毛 嘉， 周文娟， 潘 洋， 劉 巖

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610064)

1 引 言

在化療過程中很多時候癌細胞會產(chǎn)生耐藥性，這對有效治療癌癥造成了極大的障礙[1]；為了克服這種障礙，臨床上時常采用聯(lián)合用藥的方式.但同時使用幾種藥物進行治療時，需要考慮藥物之間的相互作用，因為它們可能會改變藥物的治療效果.

米托蒽醌(Mitoxantrone，簡稱MTX)是80年代研制出來的一種蒽環(huán)類廣譜化療藥，主要用于治療急性髓系白血病(AML)、惡性淋巴瘤和乳腺癌[2-3]，同時對神經(jīng)系統(tǒng)疾病如多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)也有一定的療效[4].研究表明，MTX是通過依賴于TOP2產(chǎn)生的雙鏈DNA斷裂引起細胞死亡.簡單地說，MTX插入DNA雙鏈的堿基對中，促進TOP2和DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，而該復(fù)合物的降解直接導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂的產(chǎn)生，最終引起細胞死亡[5].如大多數(shù)化療藥一樣，MTX的治療效果也受癌細胞耐藥性的影響；為了克服這個問題，臨床上嘗試MTX與其他藥物聯(lián)用，如MTX聯(lián)合皮質(zhì)類固醇激素治療晚期前列腺癌比單獨使用MTX有更好的療效[6].

為了發(fā)現(xiàn)更多可以加強MTX作用的輔助藥物，我們搜索了在臨床上使用的化療藥，我們的篩選條件是：(1)待檢藥物和MTX的作用機制不同，(2)待檢藥物可以加強DNA損傷或加強DNA損傷引起的細胞死亡.其中阿柔比星(Aclarubicin, 簡稱ACL)引起了我們的特別關(guān)注.ACL屬于第二代蒽環(huán)類藥物，臨床上主要用于治療AML和惡性淋巴瘤[7].其作用機制與MTX有許多不同之處：(1)ACL通過TOP1產(chǎn)生DNA損傷，而MTX通過TOP2[5]；(2)ACL的作用不受細胞周期的影響，而MTX主要作用于S期和G2期的細胞[8]；(3)ACL還可以從染色體上踢走組蛋白，從而使裸露DNA更容易遭受損傷[9].雖然以上結(jié)果都暗示ACL可能會加強MTX的細胞毒性，但另一方面，有報道稱ACL可以阻止TOP2和DNA的結(jié)合，從而抑制依賴于TOP2的DNA損傷[10].為了明確ACL和MTX聯(lián)合使用效果，為臨床上是否可以聯(lián)合使用ACL和MTX治療癌癥提供線索，本研究探究了ACL和MTX單獨使用或聯(lián)合使用時對小鼠成纖維細胞L929細胞死亡水平的影響及背后的機制.

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 實驗細胞株 小鼠成纖維細胞系L929購于中國科學(xué)院昆明細胞庫.

2.1.2 主要試劑 Mitoxantrone(MTX)、DMSO和CsCL均購自Innochem，Aclarubicin(ACL)購自Santa Crutz，CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay試劑盒、DNA定量試劑盒購自Promega；AV/PI凋亡檢測試劑盒購自Sangon Biotech；DMEM、雙抗、胰蛋白酶購自Thermo Fisher；胎牛血清購自NATOCOR；γH2AX、TOP2 抗體和熒光二抗均購自Abcam.

2.2 方法

2.2.1 細胞存活率的檢測 將L929細胞以1∶2接種于96孔板(100 mL/孔)，培養(yǎng)24 h后，細胞密度達到90%；MTX單獨處理組每孔分別加入終濃度為0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μmol/L的MTX，ACL單獨處理組每孔分別加入終濃度為0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μmol/L的ACL，聯(lián)合用藥組分別加入終濃度為1 μmol/L的MTX 和0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μmol/L的ACL，對照組加入和實驗組體積相同的DMSO，每種處理條件設(shè)置3個復(fù)孔.處理40～48 h后，按照CellTiter-Glo?發(fā)光法細胞存活率檢測試劑盒的說明書進行檢測.

2.2.2 Annexin V/PI 雙染法檢測細胞凋亡 將L929細胞接種于12孔板中，培養(yǎng)12 h后，細胞密度達到50%，替換培養(yǎng)液為含有MTX(5 μmol/L)和ACL(5 μmol/L)的培養(yǎng)液，陰性對照中加入含有等體積DMSO的培養(yǎng)液.處理30 h后，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用0.05%的胰酶消化細胞.37 ℃消化3 min后，將細胞收集到裝有培養(yǎng)液的EP管中，800 g/min離心3 min后，棄上清.用500 μL的PBS洗一次，1 000 g/min離心3 min后，棄上清.每組加入195 μL的Binding buffer(1×)和5 μL的Annexin V-FITC，避光，混勻，室溫孵育10 min，再加入10 μL Propidium Iodide，用流式細胞儀檢測細胞凋亡.

2.2.3 體內(nèi)酶復(fù)合物檢測(In vivo Complex of Enzyme Assay, ICE assay) 將L929細胞接種于10 cm培養(yǎng)板上，用ACL(5 μmol/L)預(yù)處理細胞2 h，MTX單獨處理組和聯(lián)合用藥組再加入MTX(5 μmol/L)，對照組用等體積的DMSO處理1 h后，吸出培養(yǎng)液，在培養(yǎng)板中加入2 mL 1%sarkosyl緩沖液，用18G針頭抽吸細胞裂解液3次.在離心管中制作CsCl梯度，從管底部到頂部的濃度：1.45、1.50、1.72、1.82 g/mL，6 mL/層.將裂解的細胞直接加到CsCl梯度上并用石蠟油覆蓋.在20 ℃條件下以125 000 g離心22 h.利用蠕動泵通過在離心管底部穿孔收集超離心組分：500 μL/份(DNA通常為第10～20組份).用Nanodrop檢測每個組分的DNA濃度并且用DNA定量試劑盒進行準確定量.將每個處理條件的DNA調(diào)整為500和1 000 ng(用磷酸鈉緩沖液調(diào)整體積至100 μL)，通過真空轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，每個處理條件設(shè)置3個重復(fù).用強度為120 000 μJ/cm2的紫外線固定轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的DNA，然后將膜放在含有5%脫脂奶粉的TBS溶液中封閉1 h，4 ℃過夜孵育TOP2抗體.第2 d用TBS-T洗2次，每次5 min.二抗室溫孵育1 h；然后再用TBS-T洗2次，每次5 min；最后用TBS洗1次，5 min.使用Azure C500凝膠成像系統(tǒng)成像并做灰度值分析.

2.2.4 Western-blotting(WB)檢測γH2AX 表達水平 將L929細胞接種在6孔板內(nèi)，當(dāng)細胞密度達到90%時，用ACL(5 μmol/L)預(yù)處理細胞1 h后，MTX單獨處理組和聯(lián)合用藥組再加入MTX(5 μmol/L)處理細胞1 h.用200 μL的Bio-rad Laemmli sample buffer 裂解細胞，然后用12% SDS-PAGE對蛋白進行電泳分離，然后用γH2AX作WB定量檢測，采用α-Tubulin作為上樣內(nèi)參.重復(fù)3次實驗并做灰度值分析.

2.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，*表示兩組之間相比P<0.05，**表示兩組之間相比P<0.01，***表示兩組之間相比P<0.001.

圖2 ACL和MTX單獨或聯(lián)合使用時對細胞死亡率的影響

DM：對照組，MTX：MTX單獨處理組，ACL：ACL單獨處理組，MA：MTX+ACL聯(lián)合處理組

Fig.2 The effect of ACL and/or MTX on the rate of cell death

3 實驗結(jié)果

3.1 ACL降低MTX引起的細胞死亡

為了研究ACL和MTX聯(lián)合使用的效果，我們分別檢測了單獨使用MTX，ACL及MTX/ACL聯(lián)合使用時對L929細胞存活率的影響.結(jié)果表明，單獨使用MTX(圖1A)和ACL(圖1B)時，細胞存活率都隨著藥物濃度升高而降低，但ACL的殺傷效果低于MTX.但當(dāng)固定MTX濃度(1 μmol/L)時，ACL在一些濃度(尤其是5和10 μmol/L)下表現(xiàn)出明顯的保護作用(之后的實驗如無特殊說明，所用ACL濃度均為5 μmol/L).為了進一步驗證這一結(jié)果，我們采用Annexin V/PI雙染法檢測了ACL，MTX和MTX/ACL引起的細胞死亡水平[11].值得注意的是，由于ACL在熒光素通道會產(chǎn)生自發(fā)熒光，在用流式細胞術(shù)分析時，我們扣除了ACL產(chǎn)生的熒光值[12].流式細胞計數(shù)結(jié)果顯示：陰性對照組(DM)細胞死亡率為1.22%，MTX處理組細胞死亡率為22.5%，ACL處理組細胞死亡率為3.66%，而ACL和MTX聯(lián)用組細胞死亡率為10.4%(圖2).以上結(jié)果清晰表明ACL可以抑制MTX誘導(dǎo)的細胞死亡.

3.2 ACL降低MTX誘發(fā)的TOP2-DNA復(fù)合物水平

MTX主要通過促進TOP2-DNA復(fù)合物形成進一步產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSBs)而引起細胞死亡[5].因為有研究報道ACL可以阻止TOP2和DNA的結(jié)合，從而抑制依賴于TOP2的DNA損傷[10]，所以我們用ICE assay檢測了細胞內(nèi)TOP2-DNA復(fù)合物的水平.如圖3所示，MTX顯著地促進了TOP2-DNA復(fù)合物的形成，而ACL可以極大程度地降低該復(fù)合物的水平.

3.3 ACL能降低MTX造成的DNA損傷

MTX促進TOP2-DNA復(fù)合物形成后會造成DSBs[13]；在DSBs產(chǎn)生后，組蛋白H2AX的C末端139位絲氨酸位點會被磷酸化形成γH2AX，并且其水平與DSBs水平成正相關(guān)，故常用來檢測DSBs[14].結(jié)果表明，相比于MTX處理組細胞，ACL和MTX聯(lián)用能夠顯著降低γH2AX蛋白的形成(圖4)，表明ACL能夠降低由MTX造成的DSBs.

4 討 論

在癌癥治療中，聯(lián)合用藥的策略在減少化療藥物毒副作用的同時可以提高治療效果，也減少了對單個藥物產(chǎn)生耐藥性的可能性.但藥物-藥物反應(yīng)不但有累加、協(xié)同作用，還可能有拮抗作用[15-16]，因而潛在的聯(lián)合用藥方案，都必須經(jīng)過嚴格的實驗驗證.

MTX是一種具有廣譜抗腫瘤活性的蒽環(huán)類藥物，用于治療乳腺癌、前列腺癌、急性白血病、淋巴癌等[17-18].ACL是一種同屬蒽環(huán)家族的化療藥物，應(yīng)用于急性髓系白血病(AML)和惡性淋巴瘤的治療，在嘗試治療其他實體瘤時，也取得了一定的效果[19].但如眾多化療藥一樣，ACL和MTX都面臨癌細胞產(chǎn)生抗藥性的影響.因為它們通過不同的機制造成DNA損傷，因而我們猜測MTX和ACL聯(lián)用時可能有更好的效果；但還有研究表明ACL可以插入DNA堿基對之間，阻止TOP2和DNA的結(jié)合[5].因為TOP2和DNA的結(jié)合是形成TOP2-DNA復(fù)合物的先決條件，暗示了ACL可以通過這種機制拮抗MTX引起的細胞死亡.

為了明確ACL和MTX聯(lián)合使用的作用，我們在小鼠成纖維細胞L929中檢測了單獨或聯(lián)合使用ACL和MTX時對細胞存活率和死亡率的影響.我們的實驗結(jié)果清晰地表明ACL可以抑制MTX引起的細胞死亡(圖1，2)，進一步研究揭示ACL通過降低MTX誘發(fā)的TOP2-DNA復(fù)合物形成(圖3)和之后的DNA雙鏈斷裂(圖4)起到了細胞保護作用.綜上，本研究結(jié)果暗示了在臨床上ACL或許不能和MTX聯(lián)合使用.