楊 梅，張曉天，劉秀敏，武 婧，朱洪權(quán)

(吉林大學第二醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130041)

2019年12月，湖北武漢出現(xiàn)了新型冠狀病毒肺炎，疫情迅速蔓延至全國各地區(qū)甚至全球多個國家[1]。新冠肺炎的病原體是新型冠狀病毒，主要傳染源是病毒感染的患者和無癥狀攜帶者，通過飛沫和直接接觸的方式傳播，且該病毒傳染性強，人群普遍易感?；颊咭园l(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)，少數(shù)伴有鼻塞、咽痛和腹瀉等癥狀。重型、危重型患者可能出現(xiàn)呼吸困難、急性呼吸窘迫綜合征，甚至多器官功能衰竭等，老年人和有慢性基礎(chǔ)疾病者預后較差[2]。因此，精準的診斷對于疾病治療和疫情防控至關(guān)重要。

SARS-CoV-2的病原學和血清學檢查標本可來源于血液、糞便[3,4]、鼻咽拭子、痰、肺泡灌洗液和其他下呼吸道分泌物。目前主要依據(jù)的實驗室陽性診斷方法為：(1)實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性；(2)病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源；(3)血清新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽性；血清學新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復期較急性期4倍及以上升高[2]。本文對目前常用的SARS-CoV-2基因測序、熒光RT-PCR核酸檢測和血清特異性抗體檢測方法的基本原理和應用現(xiàn)狀進行以下綜述。

1 基因測序

基因組是生物體內(nèi)遺傳信息的總和，利用高通量測序平臺對病毒基因組序列深入分析為我們認識和診治新冠肺炎提供可靠的依據(jù)。由2019新型冠狀病毒資源庫可知，SARS-CoV-2基因組約29000個核苷酸，12個開放讀碼框(ORF)，為線性單股正鏈RNA病毒[5]。數(shù)據(jù)分析顯示，SARS-CoV-2與SARS-CoV有80%的全基因組序列幾乎相同，與蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性高達88%[6,7]。但SARS-CoV-2基因組ORF 1ab區(qū)域的RNA聚合酶基因(RdRp)與SARS-CoV顯著不同，屬于一種全新的β群冠狀病毒[8,9]。

WU F等[10]利用MiniSeq(Illumina)平臺對患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)測序，確認了SARS-CoV-2完整的基因組序列并上傳至GenBank(注冊號MN908947)，依據(jù)其核苷酸序列評估SARS-CoV-2與已鑒定冠狀病毒間的進化關(guān)系。Chen L等[11]利用基于RNA的宏基因組下一代測序檢測兩名急性呼吸癥患者(有華南海鮮市場接觸史)的BALF，迅速鑒定出樣品中唯一的病原體-新型冠狀病毒，且豐度水平很高。LU R等[12]采用基于高通量宏基因組測序的DNBSEQ-T7平臺對BALF樣本進行下一代測序(NGS)，證明SARS-CoV-2與SARS-CoV類似，通過S蛋白結(jié)合宿主細胞的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ(ACEⅡ)受體致病，并觀察到病毒受體結(jié)合域中的幾個關(guān)鍵殘基可變，即能產(chǎn)生新的種株或亞型。Wang M等[13]開發(fā)了納米孔靶向測序技術(shù)，這一方法可同時檢測和區(qū)分SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒，與目前常用的qPCR試劑盒相比假陰性率明顯降低，另外，該技術(shù)已經(jīng)檢測到SARS-CoV-2的核苷酸突變。

高通量測序方法準確性高、敏感性高，能夠得到病毒精確的全基因組序列，有利于掌握病毒的遺傳信息、了解致病機制；有利于潛伏期低病毒含量標本的檢測，和對熒光定量PCR/抗體檢測可疑結(jié)果的確認；也有利于監(jiān)測病毒的變異，指導開發(fā)可靠的診斷試劑盒。與其他方法相比基因測序占據(jù)著無可替代的優(yōu)勢，但是，測序所需儀器成本高，對實驗室和實驗人員要求高，樣本檢測和結(jié)果分析周期長，難以滿足COVID-19爆發(fā)時的檢測需求。因此，疫情時期大量樣本的檢測仍需結(jié)合其他方法。

2 實時熒光RT-PCR核酸檢測

實時熒光RT-PCR技術(shù)是WHO推薦的MERS-CoV檢測方法之一，我國新冠肺炎診療方案已將呼吸道分泌物、血液標本病毒核酸陽性作為COVID-19的診斷標準之一[2]。疫情初期，國家疾病預防控制中心對SARS-CoV-2進行序列確認和公布，推薦了基因組中用于核酸檢測的保守序列區(qū)域：開放讀碼框(ORF 1ab)、核衣殼蛋白N基因。截至2020年3月27日，已有10個基于熒光PCR的新冠病毒檢測試劑盒獲得國家藥品監(jiān)督管理局批準[14]。

SARS-CoV-2是RNA病毒，先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，若樣本存在靶序列，TaqMan探針與模板結(jié)合，DNA鏈擴增發(fā)出熒光，檢測熒光達到閾值時的Ct值，病毒核酸濃度越高，Ct值越小。試劑盒檢測原理基本一致，但官方并未規(guī)定檢測引物和探針序列，有些試劑盒檢測三個靶基因區(qū)域(ORF 1ab、N基因和E基因)，有些檢測兩個區(qū)域(ORF 1ab、N基因)，還有的是單基因區(qū)域檢測，如華大生物科技的試劑盒只靶向檢測ORF 1ab基因。也有學者建議，將ORF 1ab作為診斷序列，將N基因作為篩檢序列[15]。

除了研發(fā)試劑盒之外，對于弱陽性標本需開發(fā)敏感度更高的檢測方法。近期，張鋒教授團隊[16]開發(fā)了一種基于CRISPR的SHERLOCK技術(shù)的新方法，能夠快速檢測SARS-CoV-2的特異性RNA。經(jīng)測試，該方法能在很低的RNA溶度(10-100 copies/uL)下，準確檢測到病毒RNA序列。楊祥勝等[17]研發(fā)了一種多重探針擴增(MPA)技術(shù)，將TaqMan技術(shù)和溶解曲線相結(jié)合，實現(xiàn)多重檢測多個靶標，覆蓋包括SARS-CoV-2在內(nèi)的18種呼吸道病毒，臨床注冊檢驗結(jié)果表明最低檢出限≤100 copies/uL。微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)對樣品進行微滴化處理，直接計算模板中的拷貝數(shù)，為H7N9的病毒監(jiān)測和治療提供了很大幫助[18]，可參考用于SARS-CoV-2檢測。新技術(shù)試驗結(jié)果固然令人驚喜，但目前仍處于研究階段。

雖然，熒光RT-PCR檢測技術(shù)作為新冠肺炎診斷的“金標準”，具有靈敏度高、特異性強和檢測周期短的優(yōu)勢，但仍存在如下因素造成檢測結(jié)果不準確。(1)各產(chǎn)品選擇擴增的序列不一，試劑敏感度、特異度不同。郭元元等[19]用6種試劑盒同時檢測1例弱陽性患者不同時期的咽拭子標本，結(jié)果顯示只有C試劑和F試劑檢測性能較理想。(2)標本采集類型。肺中表達ACEⅡ的細胞有80%以上是Ⅱ型肺泡上皮細胞，即下呼吸道分泌物(如痰、肺泡灌洗液)的檢測效果可能優(yōu)于上呼吸道(如咽拭子)。陳煒等[20]的研究結(jié)果當即顯示患者痰標本的病毒核酸含量均高于咽拭子。(3)標本采集時期。一般的快速抗原檢測在1周左右往往呈陰性[21]，董玉穎等[22]證明確診患者暴露第2周其咽拭子標本核酸檢測陽性率才達100%，且隨時間推移其陽性率逐漸降低，即采樣過早或過晚均影響核酸檢測結(jié)果。(4)樣本運輸及保存。標本應置于病毒保存液中，常溫下應4 h內(nèi)檢測，24 h內(nèi)能檢測的樣本可置于4℃保存，24 h內(nèi)無法檢測的應置于-70℃或以下保存[23]。綜上可知，仍然需要尋求其他檢測方法來彌補核酸檢測“假陰性”的漏洞。

3 血清特異性抗體檢測

SARS-CoV-2感染機體后，最先能被檢測到的是其遺傳物質(zhì)RNA,隨著病程進展，人體免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生抗體，主要是IgM和IgG兩種。

IgM是體液免疫最早(約發(fā)病后5天)合成和分泌的抗體，其升高提示近期感染，但可能因類風濕因子、自身抗體等干擾導致假陽性，因感染后兩周IgM開始衰減甚至消失造成假陰性結(jié)果；IgG是一種保護性抗體，產(chǎn)生較晚(約發(fā)病后14天)持續(xù)時間較長[24]，其陽性提示病情進入中后期或既往感染。所以，單獨的IgM或IgG抗體檢測易出現(xiàn)假陽/陰性，建議檢測IgM/IgG總抗體以輔助診斷疾病不同感染階段，使SARS-CoV-2感染檢測進入“核酸為主，抗體為輔”的聯(lián)合檢測局面。常用的抗體檢測技術(shù)主要包括：膠體金免疫法、化學發(fā)光免疫法和酶聯(lián)免疫吸附試驗等。截至2020年3月27日，國家藥監(jiān)局已應急批準新冠病毒抗體檢測試劑8個[13]。

3.1 膠體金免疫法

膠體金免疫法是以膠體金作為示蹤標記物或顯色劑，用于抗原抗體反應的標記免疫測定技術(shù)。其基本原理(以萬孚新冠病毒抗體檢測試劑盒為例)是：將金標抗原包被在硝酸纖維素膜上，當血清中含有SARS-CoV-2特異性抗體時，則形成SARS-CoV-2特異性抗體-金標抗原復合物，通過層析作用復合物流向檢測區(qū)，形成金標抗原-SARS-CoV-2特異性抗體-第二抗體復合物，顯色；多余的金標抗原繼續(xù)擴散至質(zhì)控區(qū)，顯色表示結(jié)果在控。膠體金法操作簡便、快捷，且樣本不需要離心，可以減少氣溶膠污染。

趙瑾等[25]采集確診組、康復組和對照組共212個血清樣本，用膠體金免疫層析法進行檢測，結(jié)果顯示該方法的檢測靈敏度71.31%，特異度98.92%，準確度82.07%。羅效梅[26]等以RT-PCR核酸檢測為金標準，采集101例患者和54例對照者的外周血，測試膠體金免疫層析法，結(jié)果表明該方法檢測SARS-CoV-2特異性IgM/IgG抗體的敏感度為92.1%，特異度90.7%，準確度91.6%。膠體金法檢測的特異度和靈敏度較好，所需樣本量少，可在20分鐘內(nèi)得到結(jié)果，且試劑盒易于標準化和商業(yè)化，比較適用于大規(guī)模人群的篩查。

3.2 化學發(fā)光免疫法

化學發(fā)光免疫法是將發(fā)光分析和免疫反應相結(jié)合用以檢測微量抗原或抗體的新型標記技術(shù)，可以定量檢測未知抗體，目前已廣泛用于臨床。其基本原理(以磁微?；瘜W發(fā)光-間接法為例)是：若樣本中有SARS-CoV-2抗體與熒光素標記抗原結(jié)合，加入包被抗熒光素抗體的磁微粒，形成SARS-CoV-2抗體-熒光標記抗原-磁微粒復合物1，在外加磁場中沉淀、去上清，加入酶標二抗，形成酶標二抗-復合物1結(jié)合體，去上清加入酶促底物，底物被酶催化產(chǎn)生發(fā)光反應，計算機處理系統(tǒng)可將光能量強度在標準曲線上轉(zhuǎn)換為待測抗體的濃度。

李泉[27]等采用化學發(fā)光法對確診組、疑似組和對照組共102例血漿標本進行檢測，結(jié)果證明SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測靈敏度為96%，特異度100%。沈花等[28]采用化學發(fā)光微粒子免疫法定量檢測血清SARS-CoV-2總抗體，結(jié)果證明其靈敏度為93.5%，特異度100%，準確度96.8%。唐鵬[29]等同時采用化學發(fā)光法和膠體金法檢測IgM/IgG抗體，結(jié)果顯示兩方法檢測特異度均為100%，但對于核酸檢測陽轉(zhuǎn)陰組，其總抗體的陽性檢出率分別為95.2%和76.2%，而對疑似組的檢出率分別為94.9%和70.5%，認為化學發(fā)光法檢測SARS-CoV-2總抗體明顯優(yōu)于膠體金法。實驗數(shù)據(jù)表明，化學發(fā)光法檢測血清總抗體得靈敏度、特異度均較高，可用于輔助診斷SARS-CoV-2感染。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是國際上通用的抗體檢測方法[30],是在抗原抗體免疫反應的基礎(chǔ)上，借助酶的催化作用，通過定性或定量檢測有色產(chǎn)物的量確定待測抗體的含量。ELISA需要采取離心操作，且步驟繁瑣，檢測速度慢，目前仍沒有新冠病毒檢測產(chǎn)品通過國家藥監(jiān)局的批準。

血清學抗體檢測方法的優(yōu)勢在于：(1)對實驗室及實驗人員要求低，適合各級醫(yī)院開展，有助于大量樣本的篩檢。(2)可減少熒光RT-PCR核酸檢測的漏檢風險，提高感染者檢出率。(3)實現(xiàn)患者體內(nèi)抗體含量動態(tài)監(jiān)測，為感染者病情評估和治療方案提供重要依據(jù)。(4)用于傳染病既往感染規(guī)律的流行病學研究，對SARS-CoV-2等病毒的感染防治和疫苗研發(fā)具有重要的參考價值。但抗體檢測仍然只能作為核酸檢測的輔助手段，不能取而代之。

4 總結(jié)

SARS-CoV-2的傳染性強、傳播速度快，早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療對于疾病的防控意義重大。但基因測序檢測周期長，PCR核酸檢測漏檢率高，而且由于SARS-CoV-2與其他冠狀病毒的同源性較高，血清抗體檢測可能會出現(xiàn)N蛋白和S蛋白的抗原交叉反應。所以，單一的檢測方法或多或少會存在局限性，只有通力合作、相輔相成，才能完成基因序列識別、樣本篩查和疾病診斷等一系列工作，更好的為臨床服務。