缺氧促進肝細胞癌發(fā)生發(fā)展機制的研究進展

孟永斌，程彬彬，杜娟，陳紅云，凌昌全

（中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué) 中醫(yī)系，上海 200433）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界最為兇險的惡性腫瘤。2018年肝癌在中國的發(fā)病率排名第5位，其中是男性病死率排名腫瘤死亡第3位，女性病死率排名第7位[1]。相較以往單純手術(shù)，HCC診治手段不斷豐富，微創(chuàng)介入、消融微波還有放療等局部治療手段的大量臨床應(yīng)用，HCC局部控制率與短期療效較以往有明顯提高[2]。但遠期療效較差，極易出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，如何遏制HCC進一步生長與發(fā)展仍是亟待解決的問題[3]。近年來缺氧與HCC發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究逐漸成為熱點。越來越多的研究表明，缺氧在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，揭示其具體機制和通路對于臨床治療有重要指導(dǎo)意義。

1 缺氧的定義以及缺氧對肝臟的影響

2019年諾貝爾生物或醫(yī)學(xué)獎頒給William、Kaelin和Gregg，因其證實了氧氣濃度變化可以調(diào)控細胞。在他們的研究中指出缺氧對于細胞的生物活動有明顯的影響。而缺氧具體定義是指對細胞、組織、器官的供氧不足或細胞氧利用受損，最終導(dǎo)致細胞、組織、器官的功能障礙[4]。肝臟是氧氣交匯的器官，其既接受來自肝動脈的氧合血液（30%），也接受來自門靜脈的脫氧血液（70%）[5]。肝竇中的血流相對較慢，而肝細胞的代謝率相對較高。肝臟生理構(gòu)造和血液供養(yǎng)決定了任何外界影響都會引起肝臟氧含量的變化。研究[6]表明肝細胞在病毒感染，有毒物質(zhì)暴露或炎癥后特別容易發(fā)生原發(fā)性或繼發(fā)性缺氧。James等[7]研究發(fā)現(xiàn)暴露于內(nèi)毒素后，盡管心臟輸出增加，動脈血氧飽和度和肝動脈血流未受影響，但小鼠肝臟竇狀隙PO2減少了75%，明顯出現(xiàn)缺氧。H?ckel等[8]認為肝臟損傷后容易誘發(fā)缺氧，缺氧以及缺氧誘導(dǎo)的基因突變，可能驅(qū)動了肝細胞癌變。

2 缺氧在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用

HCC的發(fā)展是一個復(fù)雜的病理過程，其中缺氧和相關(guān)的氧化應(yīng)激是HCC發(fā)生發(fā)展重要的外界因素。研究已證實缺氧參與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等一系列活動[9]。對于HCC，低氧腫瘤微環(huán)境可以驅(qū)動增強HCC生長并且促進其復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[10]。Choi等[11]評估腫瘤干細胞樣（cancer stem cells，CSC）與缺氧關(guān)系，研究[12]表明HCC干細胞樣上調(diào)的基因與代謝、血管生成和缺氧有關(guān)，缺氧或者缺氧引起的血管生成導(dǎo)致細胞應(yīng)激適應(yīng)并最終導(dǎo)致HCC發(fā)生。在介入治療中，HCC對治療引起的缺氧反應(yīng)對預(yù)后有判斷價值。Chiu等[13]研究表明在肝細胞癌中，缺氧誘導(dǎo)癌細胞上三核苷三磷酸二磷酸水解酶2（ENTPD2、CD39L1）的表達，從而使HCC細胞逃避免疫監(jiān)視，避免腫瘤細胞增殖受到限制。缺氧通過多種途徑促進HCC細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT），促進HCC 細胞增殖與轉(zhuǎn)移。證據(jù)證實缺氧分別上調(diào)人Twist相關(guān)蛋白1（Twist1）的表達[14]、誘導(dǎo)監(jiān)理蛋白（supervillin）[15]以及調(diào)控NOX4表達引發(fā)活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的GLI1[16]等多個途徑促進HCC 細胞E M T，增加HCC 細胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。此外研究證實缺氧激活的p-Smad3依賴性轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路（transforming growth factor β，TGF-β)信號傳導(dǎo)，間接促進血管擴張劑刺激的磷蛋白（VASP）的表達，VASP激活A(yù)kt和ERK信號通路，并通過改變EMT表型和基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMPs）的表達促進體外和體內(nèi)HCC的遷移和 侵襲[17]。

3 缺氧標志物在肝細胞癌臨床診斷治療中的意義

臨床上，缺氧被認為是HCC 的獨立不良預(yù)后因素。低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、低氧誘導(dǎo)因子2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmet alloprote in a se，MMP）、高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）、自噬基因Beclin-1、神經(jīng)紅蛋白（neuroglobin，NGb）和碳酸酐酶IX（carbonic anhydrase-IX，CA-IX）等，均參與HCC中的缺氧誘導(dǎo)效應(yīng)，臨床上作為缺氧的標志物。其中部分指標對于HCC的預(yù)后有預(yù)測意義。多項研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α與腫瘤預(yù)后的關(guān)系。Wang等[18]證實與健康人群和肝硬化患者相比，HCC患者血清中HIF-1α水平明顯升高，其水平越高反映HCC預(yù)后越差。Zou等[19]在138例患者隊列的免疫組化實驗分析中，成纖維細胞活化蛋白（FAP）和HIF-1α的表達水平顯著相關(guān)。在缺氧條件下HCC細胞中FAP的上調(diào)可以預(yù)示患者的預(yù)后不良。Yang等[20]報道，與腫瘤周圍組織相比，HCC病灶中HIF-2α表達較少，但HIF-2α水平較高的患者總生存期（overall survival，OS）長。研究[21]表明隨訪12個月后，證實MMP-1表達水平與肝移植后的AFP水平相當。在肝移植的患者中，兩種標志物的水平在肝移植后6個月升高，預(yù)測存在復(fù)發(fā)可能，因此作為HCC 肝移植后監(jiān)測復(fù)發(fā)有價值的標志物，其可用于肝移植后的HCC隨訪。Finkelmeier等[22]觀察215例HCC患者，得出結(jié)論證實CA-IX是晚期HCC中無病生存期（disease-free survival，DFS）和OS的不良預(yù)測因子。同時認為CA-IX的水平升高反應(yīng)死亡風(fēng)險增加。Hyuga等[23]總結(jié)117例HCC接受肝切除術(shù)的患者中CA-IX表達。研究表明，CA-IX表達是HCC根治性手術(shù)后預(yù)后不良的關(guān)鍵預(yù)測因素。

4 缺氧標志物在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用

4.1 HIF-1α 在HCC 中的作用

HIF（包括HIF1、2和3）是異二聚體轉(zhuǎn)錄因子（α和β亞基），對缺氧產(chǎn)生響應(yīng)。其中HIF-1α是缺氧最重要的標志物。多項研究表明，HIF-1α與白細胞介素8（IL-8）關(guān)系密切。Feng等[24]證實HIF-1α在HCC細胞中顯著表達，并發(fā)現(xiàn)IL-8與其存在依賴關(guān)系。并且缺氧通過HIF-1α-IL-8-Akt軸促進HCC細胞遷移和侵襲[25]。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)和嚴重的缺氧微環(huán)境中癌細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞之間的HIF-1α、IL-1-信號傳導(dǎo)環(huán)激活，導(dǎo)致HCC細胞EMT和轉(zhuǎn)移。人類丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）參與糖酵解，其基因M2型（PKM2）在多種癌細胞中過表達。Wang等[27]證實缺氧環(huán)境下HIF-1α、PKM2通路相關(guān)的代謝變化可能促進COX2誘導(dǎo)的HCC細胞凋亡抗性。缺氧環(huán)境下，HIF-1α轉(zhuǎn)錄受到多種因素誘導(dǎo)。Wen等[28]發(fā)現(xiàn)Bcl-2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Bcl2 associated transcription factor 1，Bclaf1）通過其bZIP結(jié)構(gòu)域促進HIF-1α轉(zhuǎn)錄，隨后導(dǎo)致HIF-1α下游靶標血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）和促紅細胞生成素（EPO）的轉(zhuǎn)錄增加，其反過來促進HCC細胞的存活和繁殖。Ye等[29]體外實驗也證實在缺氧條件下HIF-1α的轉(zhuǎn)錄受到組蛋白去乙?；?誘導(dǎo)，從而加強了HCC細胞的遷移和侵襲。此外，缺氧條件下HIF-1α激活下游靶基因δ-連環(huán)蛋白也可促進HCC增殖和轉(zhuǎn)移[30]。

4.2 HIF-2α 在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用

與HIF-1α一樣，HIF-2α也是缺氧誘導(dǎo)因子家族成員。氧氣濃度的降低對于其產(chǎn)生調(diào)控，進而影響多種基因的表達，這與腫瘤發(fā)展機制有直接關(guān)聯(lián)[31]。對來自7項獨立研究1066例中國HCC患者進行的Meta分析顯示，較高的HIF-2α與腫瘤浸潤、靜脈侵犯、組織學(xué)分級相關(guān)，但與HCC預(yù)后無關(guān)[32]。Cao等[33]研究表明HIF-2α和CUB結(jié)構(gòu)域蛋白1（CDCP1）均在低氧條件下可被誘導(dǎo)，CDCP1的表達受HIF-2α調(diào)節(jié)，抑制HIF-2α、CDCP1對HCC轉(zhuǎn)移中起一定的遏制作用。Wang等[34]證明HCC 細胞分泌可溶性干細胞因子（soluble stem cell factor，S-SCF）以促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vascular endothelial cells，HUVEC）的血管生成。通過HIF-2α選擇性依賴性機制，在低氧條件下調(diào)節(jié)HCC中S-SCF的過表達，促進HCC轉(zhuǎn)移?？傊?，在某些細胞環(huán)境中，HIF-2α在調(diào)節(jié)HCC細胞的缺氧反應(yīng)中發(fā)揮促進腫瘤生長侵襲的作用。

4.3 MMPs 在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用

MMPs是調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵分子參與者[35]。MMPs家族的幾個成員（包括MMP1、2、3和9）在人類HCC組織中被上調(diào)，這有助于體外HCC的遷移、侵襲。Qin等[36]報道MMP-8在高度侵襲性HCC患者中與腫瘤生長因子b1共表達，可以反映病情的兇險程度。García-Irigoyen等[37]報道MMP10在人HCC和二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的小鼠HCC中均被上調(diào)。在缺氧期間，MMP10通過Erk介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑在HCC細胞中上調(diào)，加強肺轉(zhuǎn)移的傾向。

4.4 HMGB1 在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用

HMGB1 是與缺氧誘導(dǎo)的核損傷相關(guān)分子，其與HCC 侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。HCC 患者血中較高的HMGB1 與較短的OS 以及無進展生存期（progression-free survival，PFS）之間存在顯著的相關(guān)性[38]。Tohme等[39]揭示在缺氧期間，HMGB1從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)并與細胞質(zhì)Toll樣受體-9（Toll-like receptors-9，TLR-9）結(jié)合。這種結(jié)合促進HCC 腫瘤存活和增殖。Chen 等[40]HMGB1 在調(diào)節(jié)YES相關(guān)蛋白（yes-associated protein，YAP）發(fā)揮保護HCC細胞過度糖酵解并促進HCC細胞生長。Jiang等[41]研究表明缺氧暴露以HIF-1α依賴性方式在小鼠的肝細胞瘤細胞中產(chǎn)生HMGB1表達，并隨后誘導(dǎo)巨噬細胞的浸潤和重編程以增強IL-6的表達，促進小鼠HCC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

4.5 Beclin-1 在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用

Beclin-1是自噬的標志物，在包括HCC在內(nèi)各種癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。Osman等[42]報道自噬標記物Beclin-1的表達與HCC中HIF-1α的表達相關(guān)。相比低HIF-1α組，在高HIF-1α組，更多的HCC細胞Beclin-1表達陽性，表明缺氧可能在HCC發(fā)展期間激活自噬促進腫瘤增殖。

4.6 Ngb 和細胞紅蛋白在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用

Ngb是一種含有單體血紅素的球蛋白，一種作為氧、活性氧（ROS）傳感器的細胞內(nèi)六配位球蛋白，Hota等[43-44]均證實HCC中Ngb的下調(diào)與慢性缺氧期間神經(jīng)元中Ngb水平的變化一致，提示慢性缺氧可能是控制HCC中Ngb表達的主要因素。進一步的研究[45]表明，Ngb在體內(nèi)和體外抑制了HCC的增殖。

細胞紅蛋白（cytoglobin，Cygb）是一種人類六配位血紅蛋白家族的成員，并且作為氧化還原穩(wěn)態(tài)的動態(tài)介質(zhì)。Zhang等[46]發(fā)現(xiàn)Cygb在人HCC組織中顯著失調(diào)，并且其降低了肝癌干細胞（liver cancer stem cells，LCSC）的生長并增加了CD133（+）LCSC的亞群。Cygb修復(fù)體抑制HCC增殖和LCSC生長?？偟膩碚f，該研究表明，Cygb作為腫瘤抑制因子起作用。

4.7 microRNAs 在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用

microRNAs是進化上保守且廣泛存在于真核生物中的一類非編碼單鏈小RNA,Hu等[47]研究表明miRNA在HCC細胞的缺氧反應(yīng)中的轉(zhuǎn)錄和磷酸化中起重要作用。miRNA家族在低氧環(huán)境下參與了HCC細胞發(fā)生發(fā)展全過程。研究[48]表明microRNA-200a（miR-200a）與轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）相互作用，并參與低氧Hep3B細胞的增殖，遷移，侵襲和凋亡。Xiao等[49]研究結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)雄激素受體（androgen receptor，AR）、miR-520f-3p、SOX9通過增加LCSC群體參與改變HCC細胞在缺氧條件下對索拉非尼治療的敏感性，缺氧可能通過改變AR、miR-520f-3p、SOX9信號傳導(dǎo)增加LCSC群體。

5 缺氧促進新生血管生成

各種實體瘤在其生殖周期中經(jīng)歷以下3 個階段：腫瘤細胞的增殖，缺氧和腫瘤血管生成。缺氧與腫瘤新生血管的產(chǎn)生密切相關(guān)。Matsuura等[50]表明microRNAs家族中的重要成員miR-155在缺氧條件下均顯著上調(diào)，對HCC血管形成有促進作用。研究[51]表明低氧條件下誘導(dǎo)B細胞淋巴瘤因子9（B-cell lymphoma 9，BCL9），BCL9不但促進HCC的增殖，遷移，更促進腫瘤新生血管生成。BCL9成成為HCC 缺氧與新生血管之間的橋梁。另有研究[34]表明低氧條件下HIF-2α究通過干細胞因子（stem cell factor，SCF）啟動子中的缺氧反應(yīng)元件直接誘導(dǎo)SCF基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)HCC中SCF的過表達，SCF促進了HUVEC的血管生成。在血管生成素中，由內(nèi)皮細胞促血管生成素2（angiopoietin-2，Ang-2）產(chǎn)生的另一個促血管生成因子家族，可以引發(fā)或激活血管內(nèi)皮促進新生血管。新形成的腫瘤血管表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)和功能缺陷，進一步加劇缺氧并導(dǎo)致形成“惡性循環(huán)”，其在局部腫瘤復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移中起重要作用[52]。同時研究[53]發(fā)現(xiàn)：不同的低氧暴露對于HCC細胞的血管生成影響也不同，與急性低氧暴露的HCC細胞相比，間歇性低氧暴露的HCC 細胞促血管生成作用能力明顯降低。間歇性缺氧可以減輕急性缺氧引起的VEGF的增加，并降低HCC細胞的促血管生成潛能，此研究對于臨床治療有指導(dǎo)意義。經(jīng)導(dǎo)管血管栓塞術(shù)（transcatheter arterial embolization，TAE）是常見的HCC治療手段，TAE復(fù)發(fā)的機制與缺氧、新生血管有關(guān)。一些作者認為后栓塞缺氧是腫瘤新血管生成的“原始動向”。VEGF在這一過程中是HCC患者中最重要的血管生成因子之一；而VEGF具有促進腫瘤生長的特點[54]。TAE誘導(dǎo)HCC缺血性壞死，在持續(xù)缺氧條件下，存活的腫瘤組織因TAE誘導(dǎo)發(fā)生血管生成反應(yīng)，這個反應(yīng)維持剩余腫瘤組織繼續(xù)存活[55]。近年來不斷涌現(xiàn)的HCC靶向治療，臨床效果不一，療效除了與其治療靶點有關(guān)外，缺氧也對其產(chǎn)生一定影響。Méndez-Blanco等[56]研究表明，持續(xù)索拉非尼治療的患者，抗血管生成作用誘導(dǎo)微血管密度降低，促進腫瘤內(nèi)缺氧和HIF介導(dǎo)的細胞反應(yīng)，促進缺氧微環(huán)境的抗性細胞出現(xiàn)，導(dǎo)致索拉非尼耐藥。阿帕替尼除了抑制腫瘤新生血管，更利用下調(diào)HIF-1α的表達，增加活性氧水平糾正HCC細胞內(nèi)的缺氧環(huán)境，進一步減少因缺氧誘導(dǎo)而產(chǎn)生耐藥細胞的產(chǎn)生，其抑制HCC生長的作用更強于索拉菲尼[57]。

以上是近年來缺氧在HCC 發(fā)生發(fā)展及治療中的最新進展。研究提示缺氧標志物對HCC預(yù)后具有重要意義，體內(nèi)體外實驗均證實它們受到缺氧的誘導(dǎo)，對HCC生長、侵襲與轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響。研究還揭示了缺氧參與HCC腫瘤血管新生，解決缺氧誘導(dǎo)腫瘤血管新生，可以有效抑制HCC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，對于臨床有一定指導(dǎo)意義。