高晗 鐘蓓

摘要：在過(guò)去的十幾年中，染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)（ChIP-seq）成為了分析表觀基因組和鑒定DNA相關(guān)蛋白重要結(jié)合位點(diǎn)的主要技術(shù)。然而，ChIP-seq技術(shù)目前仍存在一些技術(shù)難點(diǎn)。其中一個(gè)重要限制是ChIP-seq需要大量的起始材料，需要至少數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞才能啟動(dòng)，然而實(shí)驗(yàn)中有兩個(gè)關(guān)鍵步驟往往會(huì)造成所使用的樣本丟失，即染色質(zhì)制備和免疫沉淀。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從染色體制備入手，通過(guò)選擇兩種不同核酸水解酶DNase和MNase，設(shè)計(jì)不同實(shí)驗(yàn)組驗(yàn)證最佳酶切濃度，以優(yōu)化ChIP-seq體系。結(jié)果證明0.1U/μL的MNase為本實(shí)驗(yàn)中ChIP-seq最佳酶切濃度。結(jié)果為ChIP-seq體系的優(yōu)化提供了參考，對(duì)ChIP-seq技術(shù)在小鼠早期胚胎細(xì)胞中的應(yīng)用以及發(fā)展有一定的積極意義。

關(guān)鍵詞：小鼠早期胚胎;ChIP-seq;核酸水解酶;酶切效率

中圖分類號(hào)：S865.1?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：2095-9737（2020）01-0008-04

Abstract：In the past decade，Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing，ChIP-Seq has become the main technology to analyze epigenome and identify important binding sites of DNA related proteins.However， chip-seq still has some technical difficulties.One important limitation is that chip-seq requires a large amount of starting material，which requires at least millions of cells to start.However， chromatin preparation and immunoprecipitation as two key steps in the experiment usually result in the loss of samples.This experiment started with chromosome preparation，in order to optimize the ChIP-seq system， two different nuclease hydrolases DNase and MNase were selected to design different experimental groups.The results showed that 0.1U/μL MNase was the optimal concentration of ChIP-seq.The results provide a reference for the optimization of ChIP-seq system， and have positive significance for the application and development of chip-seq technology in early mouse embryonic cells.

Key words：Early embryo of mouse; ChIP-seq; Nucleic acid hydrolase; Enzyme digestion efficiency

目前，結(jié)合染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）和下一代測(cè)序（Sequencing）的染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)（ChIP-seq）因其能夠真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的靶蛋白的調(diào)控信息，已使許多細(xì)胞系和組織類型的全基因組表觀遺傳學(xué)分析成為可能，并常使用這一方法研究蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用[1]。

ChIP-seq的原理是：首先通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，使用特異性抗體對(duì)DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行免疫沉淀。然后將結(jié)合的DNA共沉淀、純化;隨后對(duì)富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序。將獲得的上百萬(wàn)條序列標(biāo)簽精確定位到對(duì)應(yīng)的基因組上，然后得到全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。然而ChIP-seq的一個(gè)主要限制是需要大量的細(xì)胞來(lái)生成高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集，需要的細(xì)胞數(shù)量往往在百萬(wàn)級(jí)別，而這一實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)關(guān)鍵步驟往往會(huì)造成樣本丟失：染色質(zhì)制備和免疫沉淀。這就排除了使用這一技術(shù)對(duì)罕見(jiàn)細(xì)胞群的研究。在染色質(zhì)制備上面，可以有超聲和酶切消化兩種方法。由于早期胚胎細(xì)胞分裂十分旺盛，染色質(zhì)比較疏松，且含有許多細(xì)胞質(zhì)[2]，若使用傳統(tǒng)的超聲方法制備染色質(zhì)，裂解液中會(huì)溶解大量的細(xì)胞質(zhì)蛋白，對(duì)后一步免疫沉淀過(guò)程產(chǎn)生影響，且超聲的方法重復(fù)性差和具備樣品多的特點(diǎn)不適合早期胚胎細(xì)胞量少的情況。

因此，本實(shí)驗(yàn)希望從染色體制備這一實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)入手，利用核酸水解酶將染色質(zhì)酶切成100～200 bp左右的單核小體片段。而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)則需要選擇合適種類的基因組水解酶以及摸索出合適的ChIP體系。因而本實(shí)驗(yàn)對(duì)使用的基因組水解酶進(jìn)行種類和離子濃度的篩選，進(jìn)而對(duì)小鼠早期胚胎細(xì)胞進(jìn)行ChIP-seq的體系進(jìn)行優(yōu)化。

1?核酸水解酶的選擇

本實(shí)驗(yàn)中選用兩種不同的核酸水解酶進(jìn)行篩選：脫氧核糖核酸酶（DNase）和微球菌核酸酶（MNase）。

DNaseI是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。DNaseI水解單鏈或雙鏈DNA后的產(chǎn)物，5'端為磷酸基團(tuán)，3'端為羥基。DNaseI 活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNaseI可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn);二價(jià)錳離子存在條件下，DNaseI可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1～2個(gè)核苷酸突出的粘末端。

MNase是由金黃色葡萄球菌分泌的一種胞外核酸內(nèi)切酶，可以較好地分解DNA中富含AT區(qū)域或RNA中富含AU區(qū)域，產(chǎn)物為3'-磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。MNase在核酸水解、RNA測(cè)序、染色質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究等方面都具有重要意義。

2?材料與方法

2.1?材料

大量小鼠胚胎內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)（R1），大量豬胚胎成纖維細(xì)胞（PEF），PBS，0.3%BSA，1%甲醛，125 mmol/L甘氨酸（Glycine），核酸提取緩沖液（MNase Master mix），MNase反應(yīng)混合物，MNase Stop Buffer，Nuclear Breaker Buffer，核酸電泳相關(guān)試劑等。

2.2?方法

2.2.1?設(shè)置實(shí)驗(yàn)組

DNaseI：調(diào)整鈣離子濃度和酶濃度，分別設(shè)置六組實(shí)驗(yàn)，具體見(jiàn)表1。

MNase：調(diào)整鈣離子濃度和酶濃度，分別設(shè)置六組實(shí)驗(yàn)，具體見(jiàn)表2。

2.2.2?DNaseI酶切濃度驗(yàn)證

（1）消化大量R1細(xì)胞后用PBS+0.3%BSA洗2次;

（2）1%的甲醛室溫固定15 min，混旋固定;

（3）用125?mmol/L的甘氨酸（Glycine）解交聯(lián)，室溫混旋5 min;

（4）4℃離心500 g 5 min，用預(yù)冷的PBS+0.3%BSA洗2次，棄上清加入20 μL Nuclei Extraction on Buffer和30 μL MNase Master mix，25℃水浴6 min;

（5）加5.5 μL MNase Stop Buffer、5.5 μL Nuclear Breaker Buffer、1 μL PIC和130 μL CHIP Buffer，混勻后吸出10 μL作為Input;

（6）加100 μL CHIP Buffer洗一遍抗體結(jié)合的磁珠，將樣品加入磁珠中4℃過(guò)夜;

（7）用預(yù)冷的Low Salt Wash Buffer和High Salt Wash Buffer分別洗2次，加入100 μL Hot Elution Buffer，Input中加入90 μL Elution Buffer，樣品放入65℃水浴鍋中水浴1.5～2 h后用DNA片段的回收試劑盒進(jìn)行回收純化，并跑膠;

（8）隨后使用大量PEF細(xì)胞對(duì)結(jié)果較好組進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。

2.2.3?MNaseI酶切濃度驗(yàn)證

（1）消化大量R1細(xì)胞后用PBS+0.3%BSA洗2次;

（2）1%的甲醛室溫固定15 min，混旋固定;

（3）用125 mmol/L的甘氨酸Glycine解交聯(lián)，室溫混旋5 min;

（4）4℃離心500 g 5 min，用預(yù)冷的PBS+0.3%BSA洗2次，棄上清加入20 μl Nuclei Extraction on Buffer和30 μL MNase Master mix，25℃水浴6 min;

（5）加5.5 μL MNase Stop Buffer、5.5 μL Nuclear Breaker Buffer、1 μL PIC和130 μL CHIP Buffer，混勻后吸出10 μL作為Input;

（6）加100 μL CHIP Buffer洗一遍抗體結(jié)合的磁珠，將樣品加入磁珠中4℃過(guò)夜;

（7）用預(yù)冷的Low Salt Wash Buffer和High Salt Wash Buffer分別洗2次，加入100 μL Hot Elution Buffer，Input中加入90 μL Elution Buffer，樣品放入65℃水浴鍋中水浴1.5～2 h后用DNA片段的回收試劑盒進(jìn)行回收純化，并跑膠。

3?結(jié)果與分析

3.1?DNaseI酶切濃度驗(yàn)證

3.1.1?大量R1細(xì)胞不同實(shí)驗(yàn)組跑膠圖

由圖1可知，在1～6組的DNaseI酶濃度以及鈣離子濃度下，DNaseI酶切后所獲得片段條帶大多數(shù)大于250 bp。

3.1.2?對(duì)1和5組使用大量PEF細(xì)胞和R1細(xì)胞進(jìn)行重新驗(yàn)證

由2圖和圖3可知，在1和5組的DNaseI酶濃度以及鈣離子濃度下，PEF細(xì)胞和R1細(xì)胞DNaseI酶切后所獲得片段條帶為100～250 bp左右。

3.2?MNase酶切濃度驗(yàn)證

3.2.1?使用R1細(xì)胞進(jìn)行了MNase酶切濃度的摸索

根據(jù)2.2.1中實(shí)驗(yàn)組的設(shè)置，使用R1細(xì)胞進(jìn)行了MNase酶切濃度的摸索。發(fā)現(xiàn)0.1 U/μL即可獲得目標(biāo)長(zhǎng)度的條帶，故選用0.1 U/μL的MNase作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

3.2.2?進(jìn)行不同樣本量（1、2、5、10和20個(gè)克?。┑腞1細(xì)胞0.1 U/μL MNase酶切濃度驗(yàn)證

1：1個(gè)克隆，In1：1組INPUT;2：2個(gè)克隆，In2：2組INPUT;5：5個(gè)克隆，In5：5組INPUT;10：2個(gè)克隆，In10：10組INPUT;20：20個(gè)克隆，In20：20組INPUT

由圖4可知，使用0.1 U/μL濃度的MNase進(jìn)行酶切在五組不同樣本量的（1、2、5、10和20個(gè)克隆）R1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中均可獲得目標(biāo)長(zhǎng)度（100～200 bp左右）的條帶。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了使用0.1 U/μLMNase酶切濃度進(jìn)行酶切在小樣本量中也可獲得目標(biāo)長(zhǎng)度的條帶，達(dá)到較理想的實(shí)驗(yàn)效果。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用0.1 U/μL即可獲得高質(zhì)量的目標(biāo)長(zhǎng)度（100～200 bp左右）的條帶。

3.3?分析

使用DNaseI消化小鼠早期胚胎細(xì)胞后得到染色質(zhì)片段多大于250 bp，重復(fù)驗(yàn)證后得到的染色質(zhì)片段也在100～250 bp左右，因而通過(guò)DNaseI消化小鼠早期胚胎細(xì)胞不能保證所獲得的染色質(zhì)均為高質(zhì)量的單核小體，可能存在大于250 bp的雙核小體，對(duì)于后續(xù)ChIP-seq實(shí)驗(yàn)效率有一定影響。而選用MNase的消化小鼠早期胚胎細(xì)胞后得到染色質(zhì)片段多為100～200 bp左右，其中0.1 U/μL的MNase能得到高質(zhì)量單核小體的目標(biāo)長(zhǎng)度。

因此，本ChIP-seq體系中選用0.1 U/μL的MNase作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳濃度。

4?討論

ChIP-seq技術(shù)可以應(yīng)用到任何基因組序列已知的物種，通過(guò)測(cè)序完整揭示免疫沉淀富集的DNA片段包含的蛋白定位信息。近些年來(lái)，ChIP-seq技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為研究轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和組蛋白修飾的最有力的實(shí)驗(yàn)手段。而基于多種高通量測(cè)序平臺(tái)的ChIP-seq在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究中也發(fā)揮著重要作用。

進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵的一個(gè)步驟就是染色質(zhì)的制備，根據(jù)小鼠早期胚胎細(xì)胞的性質(zhì)，傳統(tǒng)的利用超聲制備染色質(zhì)的方法顯然不可行，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選核酸酶種類以及酶濃度和鈣離子濃度，選擇使用0.1 U/μL微球菌核酸酶（MNase）消化，來(lái)制備高質(zhì)量的單核小體染色質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)應(yīng)用于小鼠早期胚胎細(xì)胞的ChIP-seq體系中的基因組水解酶的篩選，對(duì)早期胚胎細(xì)胞的研究產(chǎn)生一定積極意義。以小鼠早期胚胎細(xì)胞為材料進(jìn)行ChIP-seq，可以用于研究轉(zhuǎn)錄因子或其它表觀遺傳修飾的信息，并可為改良育種提供高效和正確的遺傳信息。實(shí)驗(yàn)中這一體系的獲得，為制備高質(zhì)量的單核小體染色質(zhì)、將ChIP應(yīng)用于樣本量較少的小鼠早期胚胎細(xì)胞中提供了一定參考，減少了早期胚胎細(xì)胞樣本量少、分裂活動(dòng)旺盛、染色質(zhì)較為疏松、含有大量的細(xì)胞質(zhì)等特點(diǎn)對(duì)ChIP-seq實(shí)驗(yàn)的影響。對(duì)現(xiàn)在正在火熱進(jìn)行的Low Input ChIP-seq的研究有一定積極作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chen Y W，Negre N，Li Q H，et al. Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity[J].Nat Methods，2012，9（6）：609-614.

[2]?展望，王文，施威揚(yáng).長(zhǎng)牡蠣中ChIP-seq方法的建立[J].海洋與湖沼，2015，46（6）：1557-1563.