趙 澄，盧芳國

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院； 2. 醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208)

冠狀病毒最先于1937年從雞身上分離出來，1965年從普通感冒患者鼻洗液中分離出，并相繼從人胚腎細(xì)胞和人胚氣管中分離。1975年由國際病毒命名委員會正式命名為冠狀病毒科[1]。根據(jù)血清學(xué)特性及基因序列的差異，分為α、β、γ、δ四屬，其中α、β兩屬僅感染哺乳動物，另外兩屬表現(xiàn)為禽類易感。冠狀病毒在人類和動物群體中廣泛分布，可引起呼吸道、腸道、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。普通型冠狀病毒感染常呈現(xiàn)流涕、不適等感冒癥狀，癥狀輕微，具有自限性[2]。而高致病性冠狀病毒侵襲人體，則表現(xiàn)為嚴(yán)重呼吸道癥狀，全身多器官受累甚至死亡。近年高致病冠狀病毒多次肆虐全球，其中，包括2002年冬至2003年春流行的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respirator syndrome coronavirus, SARS-CoV)、2012年流行的中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)以及2019年冬至今流行的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)[3-4]。目前，對于高致病性冠狀病毒，尚無特效藥治療，疫苗也還處于研發(fā)階段。據(jù)此，本文從病毒基因結(jié)構(gòu)的特點出發(fā)，探析高致病性冠狀病毒的致病機(jī)制，為高致病性冠狀病毒感染的預(yù)防和治療提供參考。

1 冠狀病毒基因結(jié)構(gòu)的一般特點

冠狀病毒是已知基因組最大的單股正鏈RNA病毒，基因組長約27～32 kb，由6～11個開放閱讀框(open reading frame，ORF)組成[5]，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp)、結(jié)構(gòu)蛋白以及特異性輔助蛋白。其中，基因組5’端的三分之二序列屬于ORF1，編碼兩個大的多聚蛋白pp1a和pp1ab，由病毒nsp3編碼的木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)域和nsp5的3C樣蛋白酶分別識別切割nsp1-4和nsp4-16區(qū)域位點，形成16個非結(jié)構(gòu)蛋白nsp，負(fù)責(zé)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[6]。基因組3’端的三分之一序列編碼四種主要結(jié)構(gòu)蛋白及輔助蛋白，按S(刺突蛋白)-E(包膜蛋白)-M(膜蛋白)-N(核衣殼蛋白)-3’端的順序排列，輔助蛋白基因散布其間，共同介導(dǎo)入侵宿主細(xì)胞、參與病毒生命全周期以及致病過程[7]。

大基因結(jié)構(gòu)的特性在適應(yīng)和修飾基因方面賦予冠狀病毒較大的可塑性[8]，因而冠狀病毒基因的重組率高，易出現(xiàn)變異和進(jìn)化。目前，已發(fā)現(xiàn)七種可以感染人類的冠狀病毒，其中SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2為高致病性冠狀病毒，皆為β屬冠狀病毒[3]。研究者通過對病毒全基因組核苷酸序列的分析，發(fā)現(xiàn)這三種高致病性冠狀病毒基因序列相似，其中SARS-CoV-2與SARS-CoV、MERS-CoV基因組序列同源性分別為79%和50%[9]，序列差異主要在編碼pp1a和S蛋白的基因上[10]。追溯高致病性冠狀病毒的來源，研究者通過對SARS-CoV-2與Bat-CoV RaTG13的基因序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)兩者相似度達(dá)96%[11]，而SARS-CoV與蝙蝠冠狀病毒同源性有87%～92%[12]，說明體內(nèi)攜帶多種病毒的蝙蝠可能是高致病性冠狀病毒的天然宿主，是研究和防控的重點[13]。

2 SARS-CoV基因結(jié)構(gòu)特點及致病機(jī)制

SARS-CoV基因組長約29.7 kb，含有14個ORF，5’端和3’端有長約265 bp和342 bp的非翻譯區(qū)，從5’端到3’端依次有ORF1a-ORF1b-ORF2-ORF4-ORF5-ORF9a編碼兩個多蛋白和S、E、M、N四個結(jié)構(gòu)蛋白。另外還有八個特有基因(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF8b和ORF9b)排列于ORF2和ORF9a之間，編碼輔助蛋白[14]。 這些基因編碼的蛋白在SARS-CoV的致病過程中發(fā)揮重要作用。病毒增殖是其致病的基礎(chǔ)，病毒增殖過程包括：吸附、穿入、脫殼、生物合成、組裝和釋放。病毒對宿主細(xì)胞的吸附是病毒增殖的第一環(huán)節(jié)。ORF2編碼的S蛋白中S1亞基受體結(jié)合域(RBD)通過與宿主細(xì)胞的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)受體結(jié)合，介導(dǎo)吸附；S2亞基隨之發(fā)生構(gòu)象改變，介導(dǎo)病毒包膜與宿主包膜融合，從而使病毒穿入宿主細(xì)胞中。ORF1a和ORF1b編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，組裝成復(fù)制酶-轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物以及其他病毒復(fù)制所需酶類，負(fù)責(zé)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。ORF4、ORF5、ORF9a編碼的E、M、N三個結(jié)構(gòu)蛋白則參與SARS-CoV增殖過程的裝配和釋放。另外，ORF3a和ORF7a編碼的3a和7a蛋白與S、M蛋白相互作用，參與病毒的吸附、裝配和釋放[15]。

ACE2是SARS-CoV與宿主細(xì)胞結(jié)合的主要受體之一[16]，由于其廣泛表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、氣管、支氣管、支氣管漿液腺、肺泡單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及腎、心、大腦等組織中[17-18]，因此，SARS患者常表現(xiàn)為多組織多器官損傷。臨床尸檢報告發(fā)現(xiàn)，SARS患者除有彌漫性肺泡損傷、水腫、透明膜形成、組織纖維化及巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤等肺部特征表現(xiàn)外，有三分之一以上的病例伴有急性腎小管損傷、心肌纖維水腫、脾萎縮以及淋巴細(xì)胞減少，少數(shù)病例還出現(xiàn)神經(jīng)元水腫變性、腹瀉等消化道癥狀[19-22]。

SARS-CoV的致病機(jī)制還與過度的免疫應(yīng)答觸發(fā)免疫病理損傷有關(guān)，其中包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤增加，促炎細(xì)胞因子和趨化因子失調(diào)等[23-24]。特有基因編碼的輔助蛋白在此過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中3a和7a蛋白不僅能夠激活NF-κB和JNK通路，上調(diào)促炎因子和趨化因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生；還具有誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡、使細(xì)胞周期停滯等作用[15, 25]。3b和6蛋白有干擾素拮抗的作用，可通過不同機(jī)制抑制干擾素活性，對抗機(jī)體的抗病毒作用[26]。有學(xué)者對14例臨床確診SARS患者的細(xì)胞因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患者早期血清中γ-干擾素誘導(dǎo)型蛋白10(IP-10)，白介素-2(IL-2)和IL-6的水平顯著升高，同時發(fā)現(xiàn)干擾素γ(IFN-γ)誘導(dǎo)的IL-8和IL-10水平升高[27]，在其他重癥患者中，也發(fā)現(xiàn)IL-6水平比輕癥患者高[28]，因此，說明輔助蛋白誘導(dǎo)的干擾素過度表達(dá)，可能是SARS-CoV感染患者后期出現(xiàn)免疫病理損傷的重要原因[29]。

3 MERS-CoV基因結(jié)構(gòu)特點及致病機(jī)制

MERS-CoV基因組全長約30 kb，由10個ORF組成。具有冠狀病毒的一般特性，即5’端為ORF1a和ORF1b兩個大的開放閱讀框，編碼16個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsps)；3’端的ORF2、6、7、8編碼S、E、M、N四個典型的結(jié)構(gòu)蛋白。其特有的基因為ORF3，ORF4a，ORF4b和ORF5[30]。與SARS-CoV相似，MERS-CoV致病的第一環(huán)節(jié)由ORF2編碼的S蛋白介導(dǎo)。不同的是，S1亞基需要雙肽肽酶4(DPP4，又稱CD26)作為其宿主細(xì)胞受體實現(xiàn)吸附[31]，才能觸發(fā)S2亞基的構(gòu)象變化達(dá)到入侵目的。值得注意的是，ORF6、7、8編碼的結(jié)構(gòu)蛋白(E、M、N)、ORF1a、1b編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1、nsp4、nsp6、nsp8、nsp12、nsp13、nsp16)以及ORF3、4a輔助蛋白(3、4a)廣泛參與病毒增殖過程中的生物合成、組裝和釋放[32]。

DPP4是一種多功能的細(xì)胞表面蛋白，廣泛表達(dá)于腎、小腸、肝、前列腺的上皮細(xì)胞和活化的白細(xì)胞上，在呼吸道中，主要表達(dá)在肺泡上皮細(xì)胞，而在鼻腔和支氣管則無表達(dá)[33]。這一分布特性在感染模型中得到充分體現(xiàn)。MERS-CoV動物感染模型中肺部有中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，同時伴有肺泡水腫[32]。而腎由于DPP4受體的高表達(dá)，MERS-CoV感染通過直接損傷或缺氧損傷引起腎功能障礙[34]。Assiri等[35]通過對47例臨床確診MERS患者進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)所有患者胸部X片出現(xiàn)異常，98%的患者出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，超過70%的患者出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促等肺炎表現(xiàn)，20%左右的患者出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐等胃腸道表現(xiàn)。另外，重癥MERS患者92%具有休克、急性腎損傷及血小板減少等肺外表現(xiàn)[36]?？梢?，MERS-CoV感染患者的臨床表現(xiàn)與病毒增殖過程中第一階段(吸附)所需要的輔助蛋白(DPP4)的分布關(guān)系密切。另外，DPP4作為T細(xì)胞活化和T細(xì)胞免疫應(yīng)答共刺激信號的關(guān)鍵因子，其大量表達(dá)也與MERS-CoV的致病密切相關(guān)[32]。

宿主免疫功能失調(diào)是MERS-CoV的另一致病機(jī)制。一方面，MERS-CoV通過感染人類巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，幫助病毒直接破壞宿主免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子失調(diào)，引起宿主IFN-γ、IP-10、IL-8、IL-12、CCL-2、CCL-3、CCL-5、MHC-II類(HLA-DR)和共刺激分子CD86表達(dá)升高，這些細(xì)胞因子的促炎和過度免疫作用，可引起宿主嚴(yán)重炎癥和組織損傷[37-38]。另一方面，其基因編碼的輔助蛋白通過干擾宿主的免疫應(yīng)答而實現(xiàn)其致病作用。如輔助蛋白4a、4b、5以及結(jié)構(gòu)蛋白M是有效的干擾素(IFN)拮抗劑，抑制IFN的產(chǎn)生和其應(yīng)答元件的信號傳導(dǎo)，從而逃避宿主的抗病毒作用[39]；4b和5蛋白還可以干擾NF-κB介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)，影響宿主炎癥因子的表達(dá)，減輕對病毒的損傷[40]；蛋白激酶R(PKR)介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)也是重要的先天免疫反應(yīng)之一，4a蛋白阻止了dsRNA介導(dǎo)的PKR激活，從而拯救了翻譯抑制并防止了應(yīng)激顆粒的形成，確保病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[41]。

4 SARS-CoV-2基因結(jié)構(gòu)特點及致病機(jī)制

SARS-CoV-2(NC_045512.2)基因組長約29.9 kb，具有編碼12種蛋白的11個ORFs，與SARS-CoV和MERS-CoV類似的是SARS-CoV-2具有典型的5’端和3’端基因結(jié)構(gòu)，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，同時3’端還有編碼六個輔助蛋白(3a、6、7a、7b、8和10)的特有基因。與SARS-CoV相比，SARS-CoV-2的ORF1ab中7個保守復(fù)制酶結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有94.4%的同一性，但是其總氨基酸序列存在380個替換，其中nsp3和nsp2中分別有102和61個氨基酸替換，S蛋白存在27個氨基酸替換，與之同源性約為75%[3,42]，這些差異是否會影響SARS-CoV-2的宿主傾向和傳播特性尚需進(jìn)一步研究。

SARS-CoV-2與SARS-CoV具有相同的吸附、穿入機(jī)制，即通過ORF2編碼的S蛋白與宿主細(xì)胞ACE2受體結(jié)合，并與宿主蛋白酶主要是跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)協(xié)同作用，促進(jìn)病毒穿入宿主細(xì)胞[43]。與SARS-CoV和MERS-CoV類似的是，SARS-CoV-2基因編碼的蛋白廣泛參與病毒增殖及致病過程。ORF1a和ORF1ab編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp7和nsp8形成異二聚體刺激nsp12(RNA依賴性RNA聚合酶)的合成，促進(jìn)病毒增殖；nsp10、nsp13、nsp14、nsp16共同參與5’端甲基化帽形成，保證mRNA的輸出，保護(hù)病毒免受宿主先天免疫反應(yīng)；nsp8、nsp13和ORF5編碼的M蛋白促進(jìn)病毒感染期間高爾基體重構(gòu)；nsp2、nsp6、nsp7、nsp10以及ORF4編碼的E蛋白和ORF3a編碼的3a蛋白修飾內(nèi)膜區(qū)室促進(jìn)病毒復(fù)制[44-46]；nsp3則是病毒釋放所必須的蛋白。

SARS-CoV-2的致病機(jī)制與S蛋白及其受體ACE2緊密聯(lián)系。在病毒吸附、穿入環(huán)節(jié)，與SARS-CoV相比，SARS-CoV-2能力更強(qiáng)，這是因為其S蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域氨基酸序列發(fā)生突變，產(chǎn)生的Q493和P499氨基酸殘基與ACE2受體結(jié)合更穩(wěn)定[47-48]。另外，由于ACE2受體在肺部高水平表達(dá)，當(dāng)SARS-CoV-2入侵宿主與其結(jié)合后，會下調(diào)ACE2水平而不影響ACE，造成肺內(nèi)ACE2和ACE失衡[49]，血管緊張素Ⅱ水平升高，過度激活肺部血管緊張素1型受體(angiotensin type 1 receptor，AT1R)，導(dǎo)致肺部毛細(xì)血管通透性增加[50]，引發(fā)肺水腫，進(jìn)一步損害肺功能，繼而可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。研究發(fā)現(xiàn)，ACE2表達(dá)水平在人群中男性高于女性，老年男性患者更容易出現(xiàn)合并癥[51]。因此，ACE2受體作為SARS-CoV-2致病的重要一環(huán)，是疫苗開發(fā)的可考慮途徑。

“細(xì)胞因子風(fēng)暴”所引發(fā)的免疫病理損傷是SARS-CoV-2致病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。研究者經(jīng)過冷凍電鏡觀察，SARS-CoV-2的ORF2編碼的S蛋白三聚體結(jié)構(gòu)相對緊湊，通過多糖屏蔽表位，幫助病毒實現(xiàn)免疫逃避[47]。SARS-CoV-2雖然可抑制IFN-I等干擾素的表達(dá)，但是IL-6、IL-8、CCL-2等炎癥因子和趨化因子不受影響的升高，吸引更多的白細(xì)胞聚集，加速“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的發(fā)生[52]。其具體作用基因尚不明確，需進(jìn)一步研究。相關(guān)臨床報道也證實了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的作用，研究者對首批41例確診新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疾病住院患者血清炎癥因子進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)的重癥患者有更高水平的GCSF、IP10、MCP1、MIP1A和TNFα，說明“細(xì)胞因子風(fēng)暴”可能是SARS-CoV-2感染患者由輕癥向危重癥轉(zhuǎn)化及危重患者死亡的重要原因[53]。另外，有學(xué)者對463例COVID-19患者進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)重癥患者的總淋巴細(xì)胞、CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，說明SARS-CoV-2可對人淋巴細(xì)胞施加重?fù)簦瑢?dǎo)致致命性肺炎[54]。這些致病機(jī)制與病毒基因所編碼蛋白特性有關(guān)。

5 總結(jié)與展望

三種高致病性冠狀病毒的基因結(jié)構(gòu)和致病機(jī)制有相似之處，除了編碼相似的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白外，還分別編碼特有的輔助蛋白，共同在侵襲宿主的過程中發(fā)揮重要作用。一方面，介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞，并迅速組裝、釋放病毒顆粒，直接損傷宿主細(xì)胞；另一方面，介導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答，攻擊宿主免疫細(xì)胞，干擾先天免疫應(yīng)答，實現(xiàn)免疫逃逸，同時，病毒蛋白還可通過上調(diào)宿主炎癥因子和趨化因子的表達(dá)水平造成組織免疫病理損傷。因此，關(guān)于高致病性冠狀病毒感染的防治，可以針對起相關(guān)作用的病毒基因及其編碼的蛋白開發(fā)相應(yīng)藥物，如：S蛋白受體拮抗劑、nsp3靶向抑制劑、特異性輔助蛋白抑制劑等，通過抑制病毒的增殖，減輕對宿主免疫應(yīng)答的影響而達(dá)到防治目的。另外，除了病毒的攻擊外，宿主的免疫應(yīng)答在高致病性冠狀病毒疾病的發(fā)展過程中也扮演著重要的角色，在此類感染性疾病中，老年人和有慢性基礎(chǔ)疾病者病死率高，因此，盡早進(jìn)行免疫治療，也是應(yīng)關(guān)注重點之一。