紀(jì)海旺，孫曉榮，孫 科

（1.青島市嶗山區(qū)王哥莊街道辦事處，山東青島 266105；2.青島市嶗山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東青島 266100；3.青島市嶗山區(qū)沙子口街道辦事處，山東青島 266102）

2019年12月以來(lái)，由新型冠狀病毒（SARSCoV-2）引發(fā)的新冠肺炎（COVID-19）疫情在全球暴發(fā)流行，給人類(lèi)健康、公共衛(wèi)生安全、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定造成了巨大影響。SARS-CoV-2是繼2003年的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（SARS-CoV），2012年的中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）后出現(xiàn)的第七個(gè)可以導(dǎo)致人類(lèi)疾病的冠狀病毒。COVID-19的暴發(fā)流行，再次引起了人們對(duì)冠狀病毒的關(guān)注。目前，在犬群中已經(jīng)分離獲得了屬于α冠狀病毒屬的犬腸炎冠狀病毒和屬于β冠狀病毒屬的犬呼吸道冠狀病毒。其感染機(jī)體后引起的臨床癥狀通常較輕，但易與犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒等可引起腸炎或呼吸道疾病的病原體發(fā)生混和感染。2020年2月，我國(guó)香港報(bào)道了COVID-19患者家養(yǎng)的寵物犬感染了SARS-CoV-2，表明SARS-CoV-2也對(duì)犬健康構(gòu)成了威脅。本文從病原學(xué)與流行病學(xué)、臨床癥狀、診斷和防治措施等角度，對(duì)犬冠狀病毒進(jìn)行了綜述，以期為犬冠狀病毒病的綜合防治提供借鑒。

1 病原學(xué)與流行病學(xué)

犬冠狀病毒（canine coronavirus，CCoV）屬于巢式病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒亞科。目前，感染犬的冠狀病毒主要包括犬腸炎冠狀病毒和犬呼吸道冠狀病毒（canine respiratory coronavirus，CRCoV）。有關(guān)CCoV感染的報(bào)道首次出現(xiàn)于1971年，德國(guó)科學(xué)家Binn等從患急性腸炎的軍犬中分離獲得了病毒（1-71株），純化的病毒可實(shí)驗(yàn)感染幼犬并出現(xiàn)相似的臨床癥狀[1]。此后CCoV在世界范圍內(nèi)多個(gè)國(guó)家和地區(qū)出現(xiàn)，并成為犬的重要腸道病原體。血清學(xué)和病原學(xué)研究[2]表明：CCoV在犬群中普遍存在，尤其在犬舍和動(dòng)物收容所更加流行。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究人員先后報(bào)道了警犬、軍犬、民用犬的冠狀病毒感染[3]。1995年，解放軍農(nóng)牧大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所從病犬心臟和胃腸道內(nèi)容物中分離到CCoV[4]。

目前，腸道CCoV引起自然感染的影響因素尚不完全清楚。CCoV是導(dǎo)致犬腸炎的主要原因之一，感染癥狀從輕度到中度不等，但對(duì)幼犬或與其他病原體共感染時(shí)癥狀較重。常見(jiàn)癥狀包括糞便稀軟、腹瀉、嘔吐、脫水、食欲不振等，偶爾死亡。CCoV和犬細(xì)小病毒（canine parvovirus，CPV）發(fā)生共感染時(shí)，癥狀尤為嚴(yán)重，且CCoV也會(huì)加重CPV的感染程度[5]。CCoV的自然感染途徑為糞-口傳播，因此感染犬糞便為主要傳染源。在新生犬中，CCoV主要在小腸上皮細(xì)胞的絨毛尖端復(fù)制，引起裂解性細(xì)胞感染。隨后，小腸絨毛縮短或脫落，并在感染后18～72 h導(dǎo)致感染犬發(fā)生腹瀉。局部產(chǎn)生的IgAs可限制CCoV在腸道內(nèi)的傳播并阻止感染的進(jìn)展，因此感染犬在臨床癥狀消失后，病毒仍可持續(xù)存在6個(gè)月之久[5]。CCoV感染的主要傳染源是發(fā)病犬或帶毒犬，其糞便、唾液可對(duì)飼料、飲水、犬舍等造成污染，健康犬科動(dòng)物經(jīng)口由消化道感染病毒[6-7]。CCoV感染一年四季均可發(fā)生，但冬季發(fā)生率較高。此外，犬的生活環(huán)境、飼養(yǎng)密度、斷奶、分窩、調(diào)運(yùn)等因素也能誘發(fā)感染或發(fā)病。

與所有RNA病毒一樣，CCoV在復(fù)制過(guò)程中極易發(fā)生突變，產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的毒株并引起更嚴(yán)重的腸道疾病。目前除了已知的I型（CCoV-I）和II型（CCoV-II）兩個(gè)基因型外，還發(fā)現(xiàn)了新的重組CCoV變異株。CCoV-I型和CCoV-II型S蛋白的同源性只有54%，而兩種基因型共感染情況很常見(jiàn)[8]。CCoV-I與貓冠狀病毒（FCoV-I）由同一種病毒進(jìn)化而來(lái)，但CCoV-I在編碼S蛋白的基因下游，存在獨(dú)特的開(kāi)放閱讀框ORF3（長(zhǎng)度為624 nt），而FCoV-I中完全不存在該開(kāi)放性閱讀框，CCoV-II和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）基因組中有該閱讀框殘留[9]。此外，在患有腹瀉的犬糞便中還發(fā)現(xiàn)了CCoV-II和TGEV的重組毒株，且廣泛分布。最早分離的CCoV屬于CCoV-II型，根據(jù)S蛋白N末端前300個(gè)氨基酸區(qū)域（NTD），將CCoVII進(jìn)一步分為兩個(gè)亞型：CCoV-IIa和CCoV-IIb，分別包括經(jīng)典CCoV和TGEV樣毒株[10]。該分類(lèi)方法雖沒(méi)有被正式接受，但在文獻(xiàn)中已被廣泛應(yīng)用。CCoV-IIa在犬類(lèi)中流行最為普遍，且具有與原型CCoV一致的NTD。經(jīng)典的CCoV-IIa僅限于感染小腸，而新出現(xiàn)的泛嗜性CCoV-IIa可以全身性傳播，引起白細(xì)胞減少[11]。CCoV-IIb與CCoVIIa在遺傳學(xué)上不同，其S蛋白與TGEV有類(lèi)似的NTD，這在幾個(gè)歐洲國(guó)家以及日本均有報(bào)道[10]。近年來(lái)，鑒于A76樣病毒中新發(fā)現(xiàn)了一種NTD，有研究者建議將其分為一個(gè)新亞型——CCoV-IIc。它是具有CCoV-I樣或FCoV-I樣NTD的CCoV-II型病毒。這些病毒在美國(guó)和瑞典都有報(bào)道[12]。

2003年，英國(guó)在病犬中分離到一株屬于β冠狀病毒屬的CCoV，其與牛冠狀病毒相近，但遺傳進(jìn)化特點(diǎn)又明顯不同，為了與屬于α冠狀病毒屬的犬腸炎冠狀病毒相區(qū)分，將其命名為CRCoV[13]。隨后，日本在家養(yǎng)犬上呼吸道中也分離到了CRCoV。流行病學(xué)調(diào)查和遺傳進(jìn)化分析表明，日本、韓國(guó)、意大利、加拿大、美國(guó)等國(guó)家均存在CRCoV感染[14]。

2019年12月以來(lái)，SARS-CoV-2在全球流行。2020年2月，我國(guó)香港首次報(bào)道犬可感染SARSCoV-2。目前，比利時(shí)、美國(guó)、中國(guó)、法國(guó)、西班牙、德國(guó)、俄羅斯、荷蘭、丹麥等國(guó)家已先后報(bào)道了犬、貓、圈養(yǎng)獅子和老虎、水貂等多種動(dòng)物的SARS-CoV-2感染。Thomas等[15]通過(guò)熒光定量PCR、血清學(xué)、基因組測(cè)序、病毒分離等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，15只來(lái)自我國(guó)香港COVID-19患者家庭飼養(yǎng)的寵物犬中，有2只為SARS-CoV-2陽(yáng)性。首例SARS-CoV-2感染犬為1只17歲的去勢(shì)雄性博美犬。在整個(gè)檢疫期間，該犬未出現(xiàn)明顯臨床癥狀，鼻拭子檢測(cè)為SARS-CoV核酸陽(yáng)性，但肛拭子和糞便樣本為陰性，也沒(méi)有分離到病毒。另外1只SARS-CoV-2感染犬為2.5歲健康狀況良好的雄性德國(guó)牧羊犬。其主人被確診為COVID-19患者后對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)，在口、鼻和肛拭子中均檢測(cè)到了SARS-CoV-2核酸，同時(shí)在口、鼻拭子中分離獲得了病毒。該患者家中的另外1只犬則沒(méi)有感染SARS-CoV-2。兩只感染犬體內(nèi)均檢測(cè)到了SARSCoV-2抗體，且病毒核酸序列與其主人體內(nèi)的一致，在整個(gè)檢疫期間均未出現(xiàn)臨床癥狀。以上數(shù)據(jù)表明，這是典型的人感染犬的病例。目前尚不清楚感染犬是否可將病毒傳染給其他動(dòng)物，或者再傳染給人類(lèi)。

2 臨床癥狀及病理變化

犬腸道冠狀病毒感染潛伏期較短，自然感染病例為1～4 d，實(shí)驗(yàn)感染病例通常只有1～2 d。病犬感染3～14 d后可通過(guò)糞便排毒。研究表明，自然感染犬的核酸陽(yáng)性時(shí)間可達(dá)發(fā)病后6個(gè)月（PCR檢測(cè)）。CCoV感染后主要引起犬輕度或中度腸炎，主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退、嘔吐、嗜睡和腹瀉等。腹瀉通?？沙掷m(xù)數(shù)日，糞便呈水樣或粥樣，顏色呈暗紅色、紅色或黃綠色，并混有少量血液或黏液，身體出現(xiàn)脫水癥狀[16-17]。成年犬感染CCoV后通常可自愈，很少出現(xiàn)死亡，但幼犬感染后癥狀較為嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)死亡。目前，CCoV通常與其他病原體，尤其是與CPV等可引起腸炎癥狀的病原體發(fā)生混合感染，導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床癥狀，甚至死亡[18-19]。CCoV輕度感染時(shí)，病理變化較輕微，在重癥病例中，可發(fā)現(xiàn)腸管膨脹，管壁變薄，充滿水樣、白色或黃綠色糞便。通常，腸系膜淋巴結(jié)出現(xiàn)水腫及腫大，并伴有肺多灶性實(shí)變以及肝、脾、腎等器官出血變性[20-21]。病例組織學(xué)變化通常包括，腸道損傷以及小腸絨毛萎縮和融合，隱窩加深甚至壞死[21]。

雖然CRCoV具有高度傳染性，并可從自然感染犬呼吸道中分離到，但感染犬通常僅表現(xiàn)出亞臨床或較溫和癥狀，且用分離病毒接種易感犬也不能完全復(fù)制出臨床癥狀。自然狀態(tài)下，CRCoV感染能否引起臨床癥狀，可能與混合感染和宿主易感性密切相關(guān)。目前，尚沒(méi)有直接證據(jù)證明，CRCoV是犬呼吸道疾病的主要病原體，但其作為潛在病原體的可能性需要加以重視。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 病原學(xué)檢測(cè)

病毒的分離、培養(yǎng)是國(guó)際公認(rèn)的病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。此方法特異性好，但因CCoV較難進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，導(dǎo)致其敏感度較低。此外，由于操作復(fù)雜、所需時(shí)間長(zhǎng)、需要特定的試驗(yàn)條件等因素，限制了其在臨床或基層單位的使用?？捎糜贑CoV分離培養(yǎng)的細(xì)胞包括，犬纖維瘤傳代細(xì)胞（A72細(xì)胞）、原代或傳代犬腎細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）、胸腺滑膜細(xì)胞、貓腎細(xì)胞（CRFK細(xì)胞）等[22]。病毒分離培養(yǎng)后，需要再結(jié)合電鏡觀察、中和試驗(yàn)、間接免疫熒光（IFA）、RT-PCR、序列測(cè)定分析等方法進(jìn)一步鑒定[23]。范泉水等[24]利用雙抗體夾心原理建立了CCoV ELISA檢測(cè)方法，可在4 h內(nèi)完成快速診斷。目前，臨床上采用的CCoV檢測(cè)方法主要為免疫膠體金檢測(cè)試紙條。此方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，適合臨床現(xiàn)場(chǎng)快速診斷，但特異性稍差。

3.2 血清學(xué)檢測(cè)

CCoV感染的血清學(xué)診斷主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、中和試驗(yàn)等。研究者利用表達(dá)的重組蛋白為包被抗原建立了CCoV抗體間接ELISA檢測(cè)方法，對(duì)50份陽(yáng)性血清和陰性血清的復(fù)檢準(zhǔn)確率為100%[25]。中和試驗(yàn)是測(cè)定血清抗體效價(jià)的最有效方法，但因其需要病毒和細(xì)胞，操作復(fù)雜，且所需時(shí)間長(zhǎng)，較少用于CCoV感染的診斷。

3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

3.3.1 RT-PCR PCR/RT-PCR是目前最常用的核酸檢測(cè)方法。Takano等[6]利用建立的CCoV RTPCR檢測(cè)方法，對(duì)收集的101份犬肛拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CCoV-I和CCoV-II的檢出率分別為88.9%和7.4%。Wang等[26]根據(jù)CDV和CCoV的H和M基因序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，建立了一步雙重PCR（one-step dPCR）方法，發(fā)現(xiàn)該方法與傳統(tǒng)PCR具有相同的敏感性。

3.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（qRT-PCR） 近年來(lái)，qRT-PCR因其敏感性高，且可對(duì)目標(biāo)核酸含量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為核酸檢測(cè)的主流方法。王靜等[27]根據(jù)CCoVS基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，建立了CCoV SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，其最低檢測(cè)限為40～50 copies/μL，靈敏度是常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法的10倍。

3.3.3 納米PCR（nano RT-PCR） 納米PCR是應(yīng)用某些納米材料結(jié)合PCR技術(shù)而產(chǎn)生的一種新興檢測(cè)方法，可以進(jìn)一步提高檢測(cè)的特異性和敏感性[28]。研究者建立了可鑒別CCoV不同基因型的雙重納米R(shí)T-PCR檢測(cè)方法。該方法對(duì)CCoV-I和CCoV-II的最低檢測(cè)限分別為6.47×101、6.91×102copies/μL；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，犬群中CCoV-I和CCoV-II共感染率為8.33%[29]。

4 防治措施

疫苗免疫是預(yù)防傳染病的最有效措施。當(dāng)前用于犬冠狀病毒病免疫預(yù)防的疫苗主要包括滅活疫苗和弱毒疫苗。無(wú)論犬只年齡如何，首次免疫后隔3～4周再次進(jìn)行兩劑量免疫，并于每年加強(qiáng)免疫1次。CCoV主要通過(guò)糞-口接觸傳播，因此科學(xué)、合理的飼養(yǎng)管理是預(yù)防病毒感染的重要一環(huán)。犬舍應(yīng)每天打掃，清除糞便。CCoV對(duì)高溫、紫外線、甲醛等敏感，可定期對(duì)犬舍用1%～10%甲醛溶液或0.1%過(guò)氧乙酸溶液進(jìn)行全面噴灑消毒[23]，對(duì)犬類(lèi)相關(guān)用品進(jìn)行高溫消毒。目前，針對(duì)CCoV感染尚沒(méi)有有效的治療藥物，臨床治療主要以支持性護(hù)理為主，通過(guò)消炎、止吐、止瀉補(bǔ)液和平衡體內(nèi)電解質(zhì)的方法提高機(jī)體抵抗力。

5 結(jié)語(yǔ)

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，冠狀病毒引起了包括急性呼吸綜合征（SARS）、中東呼吸綜合征（MERS）和COVID-19在內(nèi)的3次大的傳染病暴發(fā)流行，給人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。CCoV雖然通常只引起輕微的臨床癥狀，但有研究表明一些新的變異毒株也在不斷出現(xiàn)。此外，由于犬也可感染SARS-CoV-2，目前尚不清楚感染犬是否可將病毒再傳染給其他動(dòng)物或人類(lèi)。因此，應(yīng)加強(qiáng)CCoV感染的綜合防治研究，尤其是病原生態(tài)學(xué)和疫情監(jiān)測(cè)預(yù)警。