顧宏，潘賀鵬，張明，商曰玲，蔡國林*，陸健*

1(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)4(江蘇省農(nóng)墾麥芽有限公司，江蘇 射陽，224300)5(鹽城工學院 海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城，224051)

我國啤酒工業(yè)經(jīng)過二十多年的發(fā)展，目前產(chǎn)量穩(wěn)中有降的趨勢日益顯現(xiàn)[1]。相反，工坊啤酒憑借著多樣的風格和豐富的口感特征開始盛行起來，近幾年呈現(xiàn)了爆發(fā)式的增長[2]。工坊啤酒的特殊風味與顏色都得益于特種麥芽，借由工坊啤酒的快速發(fā)展，作為其重要原料，人們對特種麥芽的關注也越來越多[3]。結晶麥芽作為特種麥芽中的重要品種，隨著工坊啤酒的興起，它的需求量也在日益增加。

結晶麥芽，又稱焦糖麥芽，是一種獨特的麥芽類型，屬于焙烤麥芽。其制麥工藝較為特殊，需要將發(fā)芽后的綠麥芽完整地進行預糖化，然后在高溫下焙烤完成[4-5]。優(yōu)質(zhì)的結晶麥芽，其胚乳呈現(xiàn)出穩(wěn)定的水晶、玻璃狀，這也是其名字由來的原因[6]。在結晶麥芽的制備過程中，通過預糖化，麥芽中的淀粉和蛋白分別在淀粉酶和蛋白酶的作用下，分解成麥芽糖等還原糖和氨基酸，隨后在高溫焙烤下發(fā)生美拉德反應與焦糖化反應[7-8]。通過美拉德反應和焦糖化反應，有大量的風味物質(zhì)產(chǎn)生，包括了醛類、酮類、醇類和酯類等[9-11]。除此之外，還有大量的含氧、含氮的雜環(huán)化合物，使結晶麥芽擁有類似焦糖、太妃糖的風味[12-13]。這些風味物質(zhì)不僅賦予了結晶麥芽怡人的焦糖味、奶油香味和甜味，也在工坊啤酒的風味與顏色上發(fā)揮重要作用[14-15]。然而，由于缺乏足夠的投入，目前國內(nèi)少量的結晶麥芽普遍存在結晶率不高，結晶品質(zhì)不佳和風味物質(zhì)含量偏低等缺陷，導致出現(xiàn)優(yōu)質(zhì)結晶麥芽被國外進口結晶麥芽所壟斷的現(xiàn)象。

本研究通過比較不同發(fā)芽時間的綠麥芽在糖化后還原糖與游離氨基氮含量，進而確定適合用于結晶麥芽制備的綠麥芽，并采用單因素和響應面分析優(yōu)化預糖化工藝，制備優(yōu)質(zhì)的結晶麥芽，并對其常規(guī)理化指標和風味物質(zhì)進行分析，為后續(xù)優(yōu)質(zhì)結晶麥芽的國產(chǎn)化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

加麥(麥特卡夫)，由江蘇省農(nóng)墾麥芽有限公司提供；3,5-二硝基水楊酸，NaOH，L-酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、麥芽糖、Na2HPO4、KH2PO4、茚三酮、果糖、KIO3、乙醇、甘氨酸、可溶性淀粉，國藥集團化學試劑有限公司；5-壬酮，阿拉??；食品級乳酸，鄭州博研生物科技有限公司。

1.2 制麥方法

稱取除雜后的大麥200 g，置于浸麥槽中，用水洗麥2次，每次間隔10 min。之后將水沒過大麥，放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，溫度為15 ℃，濕度為95%RH。第一次浸麥時間為4 h，隨后斷水，斷水時間為12 h，之后第2次浸麥5 h，第2次斷水2 h。第2次斷水結束后為大麥的發(fā)芽階段，并開始計算大麥的發(fā)芽時間。在發(fā)芽階段每隔24 h需補水20 g，最終發(fā)芽結束得到綠麥芽。

1.3 綠麥芽發(fā)芽時間的選擇

在大麥發(fā)芽第24、36、48、60、72、84和96 h時取樣50 g，加入200 mL蒸餾水，在70 ℃下糖化1 h。之后取10 g糖化好的綠麥芽，加入100 mL蒸餾水，用攪拌器粉碎，在8000 ×g下離心15 min，取上清，測定其還原糖與游離氨基氮含量。游離氨基氮采用茚三酮法進行測定[16]，還原糖采用DNS法進行測定[17]。

1.4 結晶麥芽制備工藝及描述

結晶麥芽與普通麥芽的制備工藝的區(qū)別在于，結晶麥芽需要經(jīng)過預糖化。模擬啤酒釀造中的糖化工藝，將得到的綠麥芽整顆投入水中，在一定的溫度與pH下，麥芽中的蛋白酶將蛋白分解成氨基酸(蛋白休止階段)，同樣，淀粉酶會將淀粉分解成麥芽糖、葡萄糖等還原糖(糖化階段)。預糖化結束后，將綠麥芽投入旋轉焙烤爐中進行焙焦。冷卻后即可得到結晶麥芽。

1.5 蛋白休止階段的工藝優(yōu)化

將綠麥芽浸入糖化水中，用食品級乳酸調(diào)節(jié)糖化水至不同的pH(2、3、4、5、6和7)，在一定溫度下(分別為55、60、65、70、75、80 ℃)進行蛋白質(zhì)休止(分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3 h)。蛋白休止結束后進行游離氨基氮含量的測定。

1.6 糖化階段的工藝優(yōu)化

蛋白休止后，用食品級乳酸調(diào)節(jié)糖化水至不同的pH(2、3、4、5、6、7)，在一定溫度下(55、60、65、70、75、80 ℃)進行糖化(0.5、1、1.5、2、3、4 h)。糖化結束后進行還原糖含量的測定。

1.7 基于響應面分析的工藝優(yōu)化

利用Design-Expert V8.0.6進行響應面分析，并計算得到最優(yōu)解，再進行驗證，最終確定預糖化工藝控制點。

1.8 結晶麥芽的麥汁制備及其理化指標測定

結晶麥芽的麥汁制備參考美國釀造化學家協(xié)會(American Society of Brewing Chemists，ASBC)分析方法進行[18]。麥汁中還原糖與游離氨基氮含量的測定見1.3中的測定方法。麥汁色度與浸出率的測定參考啤酒麥芽國標[16]。結晶麥芽結晶率的測定為隨機選擇100顆結晶麥芽并切開，麥芽內(nèi)部結晶一半以上才算作結晶麥芽，否則不是，最終計算結晶率如公式(1)所示：

(1)

1.9 結晶麥芽浸提液揮發(fā)性成分的測定

結晶麥芽樣品10 g，用粉碎機進行粉碎，精確稱取5.00 g麥芽細粉，加入100 mL水，46 ℃下浸提30 min，然后升溫至70 ℃浸提60 min，取7.2 mL浸提液，加入0.8 mL內(nèi)標(0.5 mg/L的5-壬酮溶液)，采用內(nèi)標法進行GC-MS定量測定。

SPME提取方法：用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在具塞頂空瓶上部吸附萃取50 min，在氣相色譜進樣口250 ℃進行解吸，解吸1 min。

色譜條件：TG-WAXMS(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：45 ℃保持1 min，以6 ℃/min速度上升到230 ℃，保持6 min；載體為He，流速1.5 mL/min；進樣口溫度250 ℃，解吸時間1 min；不分流。

質(zhì)譜條件：離子源EI源；離子源溫度：200 ℃；四級桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV，掃描質(zhì)量范圍33～400 u；進樣方法：手動進樣。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0分析，重復3次實驗取平均值，在圖中以平均值±標準偏差表示，并進行單因素方差分析數(shù)據(jù)差異的顯著性(P< 0.05)。

2 結果與分析

2.1 發(fā)芽時間的選擇

在大麥發(fā)芽24、36、48、60、72、84和96 h時取樣，糖化，粉碎后測定還原糖和游離氨基氮的含量。由圖1可知，大麥在發(fā)芽24～84 h時，綠麥芽中的還原糖與游離氨基氮含量持續(xù)上升。但繼續(xù)發(fā)芽至96 h時，還原糖與游離氨基氮的含量開始下降。這是由于在發(fā)芽后期，部分蛋白質(zhì)，包括淀粉酶與蛋白酶會被分解為肽與氨基酸，然后運輸至胚中，用于長成新的根芽與葉芽[19]。在發(fā)芽84 h時，還原糖與游離氨基氮含量最高，這與王芝梅報道大麥發(fā)芽第4天時，綠麥芽中的淀粉酶與蛋白酶的酶量與活性較高基本一致[20]。所以，選擇發(fā)芽84 h的綠麥芽作為制備結晶麥芽的原料，有利于在結晶麥芽制備過程中形成更多的還原糖和氨基酸，進而提高結晶率和增加美拉德產(chǎn)物。

圖1 綠麥芽糖化后還原糖與游離氨基氮含量的變化Fig.1 Changes of reducing sugar content and free amino nitrogen content after glycosylation of green malt

2.2 蛋白休止階段的工藝優(yōu)化

用食品級乳酸調(diào)節(jié)綠麥芽預糖化水的pH至2、3、4、5、6、7，在65 ℃下進行蛋白質(zhì)休止1.5 h。不同pH條件下，游離氨基氮的含量無明顯變化(圖2-a)，表明pH的變化對蛋白休止無明顯影響。在麥芽中，含有酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，使得其對pH敏感性變小，從而導致pH的變化對蛋白休止無明顯影響[21]。通過調(diào)節(jié)糖化溫度為55、60、65、70、75、80 ℃(pH自然，蛋白休止時間為1.5 h)，確定最適的蛋白質(zhì)休止溫度(圖2-b)。結果表明，在60 ℃時，綠麥芽中的蛋白酶能夠更好的將麥芽中的蛋白質(zhì)分解成氨基酸，游離氨基氮含量最高，為142.14 mg/L。麥芽中主要蛋白酶的最適作用溫度為50～55 ℃，然而由于綠麥芽未經(jīng)粉碎，導致麥芽內(nèi)部溫度可能低于糖化溫度，所以蛋白休止階段的最適溫度為60 ℃。不同蛋白休止時間對游離氨基氮含量差異明顯(圖2-c)，但在2 h后，游離氨基氮的含量增加不明顯，所以蛋白休止時間選擇2 h較為合適。

a-預糖化工藝中pH對蛋白休止效果的影響;b-預糖化工藝中溫度對蛋白休止效果的影響;c-預糖化工藝中時間對蛋白休止效果的影響圖2 預糖化工藝蛋白休止效果的影響Fig.2 Effect of pre-saccharification process on the protein resting

2.3 糖化階段的工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素實驗

同蛋白休止階段一樣，用食品級乳酸調(diào)節(jié)水的pH值至2、3、4、5、6、7，投入綠麥芽，并在60 ℃下水浴1.5 h，發(fā)現(xiàn)在pH=3時，還原糖的含量達到最高為10.34 g/L(如圖3-a)。在pH=3的條件下，分別于55、60、65、70、75、80 ℃將綠麥芽水浴1.5 h，測定還原糖含量。結果表明，70 ℃時，綠麥芽的還原糖含量最高，達到24.04 g/L(如圖3-b)。綠麥芽中同時存在α-淀粉酶與β-淀粉酶，糖化是在它們的共同作用下完成的。其中α-淀粉酶的最適pH值為4.5，且耐高溫，在93～95 ℃仍能保持足夠高的活性。β-淀粉酶的最適pH值與α-淀粉酶大體相同，但不能夠耐高溫，其最適溫度為50～55 ℃。但由于糖化時沒將綠麥芽粉碎，有麥殼的保護，導致麥芽內(nèi)部的pH和溫度與環(huán)境存在差異，能使得當pH=3，溫度為70 ℃時，糖化效果最好。進一步跟蹤分析在此條件下，時間對糖化效果的影響(圖3-c)，結果發(fā)現(xiàn)，在2 h后，還原糖的含量增加不明顯，所以最終確定糖化時間為2 h。

a-預糖化工藝中pH對糖化效果的影響;b-預糖化工藝中溫度對糖化效果的影響;c-預糖化工藝中時間對糖化效果的影響圖3 預糖化工藝對糖化效果的影響Fig.3 Effect of pre-saccharification process on the saccharification

2.3.2 響應面設計優(yōu)化糖化效果

以糖化條件中的溫度與pH為試驗因子，還原糖的含量為響應值，設計2因素3水平的中心組合試驗對糖化工藝進一步進行優(yōu)化，實驗結果如表1所示。用Design-Expert V8.0.6分析可得回歸方程為：Y=-571.02+15.26×A+32.99×B+0.02×A×B-0.11×A2-5.14×B2

表1 糖化工藝響應面實驗結果Table 1 The results of response surface methodology of saccharification process

表2為回歸模型的方差分析，由表2可知，本實驗所選擇的模型差異極顯著(模型的P=0.002 6)，說明此回歸模型對綠麥芽糖化效果有很好的預測性。模型決定系數(shù)R2=0.894 2與模型修正決定系數(shù)R2=0.818 7較為接近，所以該模型與實際實驗的擬合度較好。失擬誤差P=0.248 4>0.05，失擬誤差不顯著，表明除了模型研究以外的因素對糖化效果的影響較小。信噪比為9.623，大于4，說明該模型可以用于預測。

表2 糖化工藝回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) regression model of saccharification process

因此，可以通過回歸方差代替實驗真實點對結果進行分析。通過顯著性檢驗P值的大小可以得到溫度與pH這2個因素中，pH對于糖化效果的影響較大。溫度與pH的交互作用影響不顯著，A2、B2對糖化效果的影響顯著，其中B2對糖化效果的影響極顯著。將表1中的數(shù)據(jù)進行響應面曲線分析，兩者有較好的二次拋物線關系，所以還原糖含量存在最大值。

通過Design-Expert V8.0.6對糖化工藝條件進行優(yōu)化，得到綠麥芽糖化工藝的最佳條件為：溫度為71.1 ℃，pH為3.36。在此工藝條件下，最終還原糖含量的預測值為26.69 g/L。采用上述條件來進行驗證實驗(n=3)，得到的還原糖含量實測值為(26.2±0.15)g/L，與預測值26.69 g/L的相對誤差為1.84 %，進而更能夠說明此模型對實驗的擬合度較好，得到的回歸方程在本實驗中有實際意義。

2.4 結晶麥芽品質(zhì)分析

2.4.1 外觀

將結晶麥芽剖開，里面胚乳與普通麥芽不同，呈現(xiàn)棕色或黑棕色的結晶狀(圖4)。本工藝制備的結晶麥芽，其內(nèi)部能夠完全結晶(圖4-a)，而商業(yè)市售的結晶麥芽則只有部分結晶，其余的仍呈現(xiàn)與普通麥芽相同的白色粉末狀胚乳(圖4-b)。通過工藝優(yōu)化后，結晶品質(zhì)改善明顯。

a-本工藝制備的結晶麥芽;b-商業(yè)市售的結晶麥芽圖4 結晶麥芽的剖面圖Fig.4 Profile of crystal malt

2.4.2 理化指標分析

對結晶麥芽的還原糖含量、游離氨基氮含量、浸出率、色度、麥汁pH以及結晶麥芽的結晶率進行測定，并與市售的結晶麥芽進行了比較，結果如表3所示。由表3看出，在還原糖含量和色度上，本工藝制備的結晶麥芽與市售的相差不大，但游離氨基氮的含量顯著提高，高出了56.2%，浸出率也比市售結晶麥芽高12.1%。本工藝制備的結晶麥芽整體的結晶率也略高于市售的結晶麥芽。

表3 結晶麥芽的理化指標比較Table 3 Comparison of physicochemical indicators of crystal malt

2.4.3 風味分析

通過GC-MS分析了結晶麥芽的風味物質(zhì)(圖5)，結晶麥芽的可揮發(fā)性成分主要以醛類為主，有18種，其次為酮類5種，吡嗪類4種，醇類3種，酚類3種，其他類3種。結晶麥芽的風味以巧克力、奶油與焦糖風味為主，并且有大量醛類物質(zhì)帶來的水果清香。由圖5可知，醛類含量是遠遠高于其他種類的物質(zhì)的，這與FICKERT等的報道相符[22]。在可揮發(fā)性成分的總濃度上，本工藝制備的結晶麥芽達到1 265 μg/L(其中醛類為1156.7 μg/L，酮類為7.7 μg/L，吡嗪類為5 μg/L，醇類為18.3 μg/L，酚類為30 μg/L，其他類為47.3 μg/L)，商業(yè)市售的只有637.8 μg/L(其中醛類為600 μg/L，酮類為2.9 μg/L，吡嗪類為1.7 μg/L，醇類為9.9 μg/L，酚類為9.1 μg/L，其他類為14.2 μg/L)，高出了98.3%。在主要的醛類風味物質(zhì)上，本工藝制備的結晶麥芽是商業(yè)市售的2倍，主要成分為異丁醛、2-甲基丁醛和異戊醛，它們所帶來的是焦糖、巧克力、咖啡的風味，這些也是結晶麥芽的標志性風味。這些醛類主要是通過美拉德反應的中間產(chǎn)物Strecker降解所得，與傳統(tǒng)美拉德反應產(chǎn)物有差異的原因是結晶麥芽在制作過程中焙烤溫度較低，為120 ℃左右。在更高的溫度下，醛類物質(zhì)會形成類黑素，一種褐色的含氮聚合物和共聚物，然后進一步形成傳統(tǒng)的美拉德反應產(chǎn)物，如吡嗪類、呋喃酮、麥芽酚等雜環(huán)化合物[23]。

圖5 結晶麥芽中可揮發(fā)性成分對比Fig.5 Comparison of volatile components in crystalline malt

3 結論

發(fā)芽84 h的綠麥芽在糖化后所測得的還原糖與游離氨基氮含量最高，選擇發(fā)芽84 h的綠麥芽作為制備結晶麥芽的原料。通過單因素和中心組合試驗，確定了結晶麥芽的預糖化工藝，將發(fā)芽84 h的綠麥芽，在60 ℃，pH=3.36的條件下，進行蛋白休止2 h，而后將溫度提升至71.1 ℃，糖化2 h，得到的綠麥芽焙烤之后就能夠得到優(yōu)質(zhì)結晶麥芽。優(yōu)質(zhì)結晶麥芽的結晶率為98%，且結晶麥芽內(nèi)部能夠完全結晶，結晶品質(zhì)佳，風味濃郁，特征明顯，風味物質(zhì)含量比市場普通結晶麥芽提高了98.3 %。本研究結果為結晶麥芽的生產(chǎn)和工坊啤酒質(zhì)量的提高提供了技術參考。