劉 元 ，劉 淼，阮 元，張少寧，王旭光，文春南，麻兵繼，*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材系，河南 鄭州 450002；2.河南白云牧港生物有限公司，河南 登封 452470）

植物內(nèi)生真菌在長時間的進(jìn)化過程中和宿主植物建立了共生關(guān)系，不僅能獨(dú)立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，而且還能參與宿主植物的代謝過程，對植物的生長發(fā)育、抗病抗逆、有效成分的產(chǎn)生和積累起到促進(jìn)作用［1］。山藥為薯蕷科薯蕷屬植物薯蕷Dioscorea oppositaThunb.的根莖［2］。古河南懷慶府地區(qū)（今博愛、武陟、溫縣）所產(chǎn)山藥最佳，故謂之“懷山藥”，為著名的四大懷藥之一［3］，也是我國傳統(tǒng)的藥食同源品種之一。文獻(xiàn)報道懷山藥中含有薯蕷皂苷、尿囊素、膽堿、糖蛋白、自由氨基酸、山藥堿、山藥多糖等多種成分［4-5］，具有健脾益胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精等功效，素有“懷參”之譽(yù)。

目前，對懷山藥內(nèi)生真菌的研究較少。本課題組前期采用高通量測序技術(shù)，測定了懷山藥根、莖中主要內(nèi)生真菌分布。其中優(yōu)勢內(nèi)生真菌有鏈格孢屬（根17.1%、莖33.2%），葡萄孢盤菌屬（根34.1%、莖6.3%），毛球殼屬（根20.0%、莖0.3%）［6］。本課題組通過傳統(tǒng)的分離方式從懷山藥的根、莖中純化獲得了38 株可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌［7］。文獻(xiàn)報道植物內(nèi)生真菌對宿主植物具有促生長作用［8］，3-吲哚乙酸是人們最早發(fā)現(xiàn)的植物生長激素，可調(diào)控植物細(xì)胞的分裂、伸長、分化、根原基發(fā)生及胚的形成過程［9］。為深入研究內(nèi)生真菌與懷山藥的共生關(guān)系，本實驗對前期分離得到的38 株懷山藥內(nèi)生真菌進(jìn)行產(chǎn)生長激素3-吲哚乙酸的篩選，并以PDB（馬鈴薯葡萄糖肉湯液體培養(yǎng)基）、SDB（沙氏液體培養(yǎng)基）、SNB（合成低營養(yǎng)液體培養(yǎng)基）、MB（麥芽浸汁液體培養(yǎng)基）4 種不同培養(yǎng)基考察陽性菌株分泌3-吲哚乙酸的能力，進(jìn)而借助HPLC 測定其最大分泌量，旨在發(fā)現(xiàn)對懷山藥促生作用明顯的菌株。

1 材料

1.1 供試菌株 懷山藥的根、莖中分離得到的38 株內(nèi)生真菌。

1.2 供試培養(yǎng)基 PDB 培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。SDB培養(yǎng)基，葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，加蒸餾水至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。SNB 培養(yǎng)基，KH2PO41 g，KNO31 g，MgSO40.5 g，蔗糖0.2 g，葡萄糖0.2 g，加蒸餾水至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。MB 培養(yǎng)基，麥芽浸膏25 g，蒸餾水1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.3 儀器 LDZF-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；QHZ-98 A 全溫震蕩搖床（太倉市華美生化儀器廠）；GXZ 型多段編程智能光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州予華儀器制造有限公司）；Waters 1525 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；分析天平（萬分之一，上海菁海儀器有限公司）。

1.4 試劑 Salkowski 試劑，稱取FeCl312 g，溶于500 mL蒸餾水中，然后緩慢加入430 mL 98% H2SO4，冷卻后定容至1 L，配置成標(biāo)準(zhǔn)比色液（測定范圍為 0.3～20 mg/L）［10］。乙酸乙酯（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；乙腈（一級色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 篩選懷山藥內(nèi)生真菌分泌3-吲哚乙酸 將38 株真菌接種到150 mL PDB 液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)（250 mL 錐形瓶，30 ℃，120 r/min）8 d，用移液槍吸取200 μL 發(fā)酵液置白色坩堝內(nèi)。1∶1 加入標(biāo)準(zhǔn)比色液，在暗處靜置30 min后，觀察其顏色變化，同時以空白PDB 培養(yǎng)液為對照。以200 μL 3-吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)液（0.9 mg/L）加等量標(biāo)準(zhǔn)比色液作為陽性對照液，進(jìn)行顏色比較。經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)1 株內(nèi)生真菌LY-22 具有顯著陽性顏色反應(yīng)，并經(jīng)分子生物學(xué)手段鑒定為鐮刀屬真菌銳頂鐮刀菌Fusarium acuminatum。

2.2 銳頂鐮刀菌在4 種培養(yǎng)基的發(fā)酵液中分泌3-吲哚乙酸測定

2.2.1 樣品溶液制備 將銳頂鐮刀菌分別在PDB、SDB、MA、SNB 4 種培養(yǎng)基液體中培養(yǎng)14 d（120 r/min，30 ℃），每種培養(yǎng)基同一批次共發(fā)酵21 瓶。每隔2 d 取其中3 瓶，以抽濾法分離菌液和菌絲，以乙酸乙酯和菌液1∶1進(jìn)行萃取，共萃取3 次。將乙酸乙酯萃取液合并，濃縮蒸干后，用色譜級甲醇定容至3 mL。

2.2.2 3-吲哚乙酸對照品溶液制備 用天平準(zhǔn)確稱取4.50 mg 3-吲哚乙酸對照品，以色譜甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，制備成0.090 mg/mL 的3-吲哚乙酸甲醇溶液。

2.2.3 色譜條件 Venusil ASB -C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相水-乙腈（65∶35）；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm。在此條件下，樣品中的3-吲哚乙酸與其他色譜峰能較好的分離，見圖1。

2.2.4 精密度試驗 取同一對照品溶液15 μL，在“2.2.3”項色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5 次，測得3-吲哚乙酸峰面積RSD 為0.80%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一對照品溶液15 μL，在“2.2.3”項色譜條件下，分別于0、1、3、5、7 h 進(jìn)樣，測得3-吲哚乙酸峰面積RSD 為0.97%，表明溶液在7 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取相同條件下的PDB 發(fā)酵液3 份，按“2.2.1”項下方法制備樣品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下，進(jìn)樣15 μL，測定3-吲哚乙酸的峰面積，按外標(biāo)法計算含有量，RSD 為1.30%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.7 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項下對照品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下，分別進(jìn)樣2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15 μL 測得3-吲哚乙酸峰面積，以對照品體積為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝185 371X-29 488（r＝0.999 6），表明線性關(guān)系良好。

2.2.8 4 種液體培養(yǎng)基中3-吲哚乙酸測定 銳頂鐮刀菌在4 種液體培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)期間每隔2 d 測其發(fā)酵液中的3-吲哚乙酸含有量，測定結(jié)果表明在第10 天左右生長激素分泌量達(dá)到最高值并基本保持平穩(wěn)，且在PDB 液體發(fā)酵液中產(chǎn)出量最高（經(jīng)HPLC 測定，該真菌在PDB 液體發(fā)酵液中分泌3-吲哚乙酸的量約為1.80 mg/L），SDB 液體發(fā)酵液中含有量次之，但未在SNB 發(fā)酵液中檢測到3-吲哚乙酸的存在，見圖2。

3 結(jié)論與討論

本研究從懷山藥中分離得到的38 株內(nèi)生真菌中經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)1 株內(nèi)生真菌銳頂鐮刀菌具有顯著分泌生長激素3-吲哚乙酸的能力。利用PDB、SDB、SNB、MB 4 種不同培養(yǎng)基對銳頂鐮刀菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，測定該真菌分泌3-吲哚乙酸的能力，結(jié)果表明銳頂鐮刀菌在PDB 培養(yǎng)基中發(fā)酵10 d左右，菌液中的 3-吲哚乙酸產(chǎn)量達(dá)到最高值，約為1.80 mg/L。

近年來在很多植物中，內(nèi)生真菌對宿主有促生作用的報道。張春英等［11］研究發(fā)現(xiàn)盆栽杜鵑根部接種樹粉孢屬真菌菌株，對盆栽杜鵑花的生長具有明顯的促進(jìn)作用。陳志為等［12］將臺灣相思樹的不同優(yōu)勢內(nèi)生真菌組合澆根回接于幼苗，發(fā)現(xiàn)對幼苗所測各項生理指標(biāo)均顯示促進(jìn)作用。懷山藥作為河南的道地藥材之一，具有悠久的栽培歷史，藥材產(chǎn)地具有明顯的地域性，但至今鮮有報道內(nèi)生真菌對其具有促生作用。3-吲哚乙酸最明顯的生態(tài)作用是促進(jìn)植物生長，但對植物莖、芽、根不同部位生長的促進(jìn)作用因濃度而異。在細(xì)胞水平上，3-吲哚乙酸可刺激形成植物層細(xì)胞分裂；刺激枝的細(xì)胞伸長、抑制根細(xì)胞生長；促進(jìn)木質(zhì)部、韌皮部細(xì)胞分化，促進(jìn)插條發(fā)根、調(diào)節(jié)愈傷組織的形態(tài)建成；在器官和整株水平上，3-吲哚乙酸從幼苗到果實成熟都起作用［13-14］。本實驗在懷山藥中首次篩選得到具有產(chǎn)3-吲哚乙酸能力的內(nèi)生真菌銳頂鐮刀菌，但該內(nèi)生真菌是否對懷山藥植株的生長具有促進(jìn)作用仍需要將菌種回接試驗來驗證，其具體的促生機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。后續(xù)實驗結(jié)果若表明3-吲哚乙酸對懷山藥大田栽培的確發(fā)揮了明顯的促生長作用，將來可開發(fā)成生物生長調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于懷山藥的生產(chǎn)實踐。