蘇海林(云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，云南 昆明 650200)

0 引言

近幾年來(lái)，人們對(duì)于甾體化合物的研究越來(lái)越廣泛，由于甾體化合物本身的特性使其在多方面均得到了應(yīng)用，例如在治療淋巴母細(xì)胞白血病，治療內(nèi)分泌紊亂等相關(guān)疾病以及進(jìn)行人體器官移植時(shí)等均取得了較好的治療進(jìn)展。目前甾體類激素已經(jīng)成為除抗生素外的第二大類藥物，在醫(yī)療領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。隨著人們對(duì)甾體化合物的相繼研究，甾體衍生物羥基化的生物轉(zhuǎn)化也受到了大家的廣泛關(guān)注，甾體衍生物羥基化的生物轉(zhuǎn)化使得最終產(chǎn)生了更多高效的中間或者終末產(chǎn)物，且甾體衍生物的生物轉(zhuǎn)化具有諸多優(yōu)點(diǎn)，例如轉(zhuǎn)化過(guò)程中涉及的程序少，轉(zhuǎn)化周期短，轉(zhuǎn)化后副產(chǎn)物較少而有用的產(chǎn)物的收率較高，且具有專一化和快速精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)，此外還具有安全無(wú)公害，始終堅(jiān)持綠色原則，該轉(zhuǎn)化方法是目前生物合成甾體類相關(guān)藥物的主要途徑[1]。

1 生物轉(zhuǎn)化

生物轉(zhuǎn)化(Biotransformation)又稱為生物催化，是指某類物質(zhì)經(jīng)過(guò)多種酶的催化作用而進(jìn)行的代謝轉(zhuǎn)化，而外源物是需要轉(zhuǎn)化的對(duì)象，生物轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是使外源化合物利用生物體系本身具有的酶而進(jìn)行的酶促催化反應(yīng)，目前主要的酶促反應(yīng)主要有氧化還原反應(yīng)、羥基化反應(yīng)、脫氫脫羧、酯化?；?，多數(shù)酶促反應(yīng)需要在溫和的環(huán)境中進(jìn)行，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的重要原因之一就是為了維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[2]。生物轉(zhuǎn)化與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑相比，主要具有以下幾方面優(yōu)點(diǎn)：首先是為整個(gè)催化體系提供了區(qū)別于于傳統(tǒng)分子溶劑的反應(yīng)環(huán)境，該環(huán)境能夠有效改善相關(guān)酶或細(xì)胞的活性，從而進(jìn)一步提高了反應(yīng)速率和產(chǎn)率。生物轉(zhuǎn)化具有高選擇性、作用溫和等特點(diǎn)，其中主要的生物催化方法包括全細(xì)胞生物催化轉(zhuǎn)化法、固定化細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化法以及靜態(tài)細(xì)胞生物催化轉(zhuǎn)化法。依據(jù)底物來(lái)源不同又可以將轉(zhuǎn)化法分為植物轉(zhuǎn)化動(dòng)物轉(zhuǎn)化法以及微生物轉(zhuǎn)化法等。

在所有的生物轉(zhuǎn)化中，微生物轉(zhuǎn)化是比較常見的一種，微生物轉(zhuǎn)化又稱為微生物酶法轉(zhuǎn)化，是指微生物利用自身代謝功能而進(jìn)行一系列的有機(jī)反應(yīng)，微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中所需要的酶促生物催化劑來(lái)源于微生物細(xì)胞，該過(guò)程具有快速準(zhǔn)確，操作便捷以及區(qū)域和空間感選擇性較強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)槲⑸镛D(zhuǎn)化能夠合成一些自然界不具有的中間產(chǎn)物，或者經(jīng)過(guò)化學(xué)合成法無(wú)法合成的藥物，使得該方法受到廣大微生物學(xué)者、有機(jī)化學(xué)學(xué)者以及藥學(xué)學(xué)者的青睞。我國(guó)著名藥學(xué)家屠呦呦老師從中藥青蒿中提取到了青蒿素，青蒿素是一類繼氯喹、乙氨嘧啶和伯喹等藥物后用來(lái)治療瘧疾的比較有效的藥物，同時(shí)青蒿素具有較低的毒性，青蒿素被世界衛(wèi)生組織稱為“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”，為治療瘧疾作出了重大貢獻(xiàn)。

2 甾體衍生物羥化反應(yīng)

2.1 甾體衍生物羥化反應(yīng)原理

甾體化合物本身屬于小分子化合物且具有脂溶性大的特點(diǎn)，較好的脂溶性使其易于進(jìn)出細(xì)胞，當(dāng)甾體化合物進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的生理變化反應(yīng)，由于其自身結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)而使甾體化合物成為較好的藥物分子[3]。例如在臨床上，甾體化合物中的腎上腺皮質(zhì)激素可以用來(lái)作為治療支氣管哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的良好藥物。另外，甾體化合物中的激素還可以起到較好的生理保健功能，例如可以有效改善機(jī)體肥胖、增強(qiáng)體力以及改善機(jī)體蛋白質(zhì)等代謝等作用。甾體化合物的原料主要來(lái)自于植物的甾醇，例如油菜的甾醇、β-谷甾醇以及豆甾醇等，而這些甾醇主要來(lái)源于豆類植物，而另一類甾體化合物主要是指存在于一些真菌體內(nèi)的麥角甾醇，在黃體酮等藥物的生產(chǎn)過(guò)程中比較常見，目前在分枝桿菌體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了甾醇的分布。同位素示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甾體衍生物的羥基化反應(yīng)是基于甾體上的羥基直接將甾體碳架上的氫原子的位置取代，且在取代過(guò)程中未發(fā)生空間構(gòu)型的改變，且羥基轉(zhuǎn)化過(guò)程中的氧不僅由水中的氫氧基提供，而且空氣中的氧也為其提供氧原子，也就是說(shuō)當(dāng)使用某些霉菌轉(zhuǎn)化甾體時(shí)需要有足夠的氧供給，從而保證羥基化過(guò)程對(duì)氧的需求。此外，甾體化合物進(jìn)行羥基化反應(yīng)時(shí)其羥基上的氫會(huì)被直接取代。

2.2 底物溶解率的影響

在對(duì)甾體化合物實(shí)施轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，由于甾體本身具有較差的溶解性，且在整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)較多的副產(chǎn)物，另外，菌體的轉(zhuǎn)化能力以及甾體底物的轉(zhuǎn)化效率低等原因，已經(jīng)成為目前生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的一大問(wèn)題。由于原料溶解性的問(wèn)題對(duì)甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化的影響較大，所以目前尋找新的甾體藥物仍然是當(dāng)下及未來(lái)需要重點(diǎn)關(guān)注的研究方向[4]。

2.3 甾體羥基酶

甾體羥基酶是一種誘導(dǎo)酶，主要存在于無(wú)細(xì)胞抽提液離心后得到的含有線粒體的上清液中，對(duì)該上清液進(jìn)行分離和純化可知，該上清液中還存在離心后分離出的微粒體，微粒體在通常條件下不進(jìn)行羥化反應(yīng)，而只有當(dāng)微粒體和高碘酸鈉結(jié)合后才具有羥基化酶。

3 甾體衍生物羥基化的生物轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀

3.1 靜息細(xì)胞生物催化轉(zhuǎn)化法

靜息細(xì)胞生物催化轉(zhuǎn)化是通過(guò)制備出靜態(tài)時(shí)的菌體懸浮液來(lái)進(jìn)一步實(shí)施生物催化。首先取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌體，過(guò)濾并離心，收集菌體沉淀，再將菌體懸浮于合適的緩沖溶液中，最后再加入相應(yīng)的底物來(lái)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[5]。使用該方法制備的產(chǎn)物具有雜質(zhì)少、易于分離純化以及反應(yīng)后的菌體可以重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)。相關(guān)研究員發(fā)現(xiàn)利用新金分枝桿菌生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)的細(xì)胞以及靜息狀態(tài)時(shí)的細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化體系，而只有靜息狀態(tài)下的細(xì)胞才能夠使甾醇實(shí)現(xiàn)正常轉(zhuǎn)化，且得到的產(chǎn)物不容易降解。

3.2 全細(xì)胞生物催化轉(zhuǎn)化法

全細(xì)胞生物催化轉(zhuǎn)化在甾體衍生物的工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的價(jià)值。用來(lái)實(shí)施催化的酶通常分布在膜蛋白上，例外，在催化過(guò)程中還需要一些輔酶的參與，與傳統(tǒng)的酶反應(yīng)相比，全細(xì)胞生物催化轉(zhuǎn)化具有步驟簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中不需要輔酶的參與，該項(xiàng)也使得轉(zhuǎn)化成本大大降低。目前也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多植物、動(dòng)物以及微生物(細(xì)菌、真菌等)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)甾體化合物的轉(zhuǎn)化，其中真菌的應(yīng)用最為廣泛，被廣泛用來(lái)對(duì)甾體藥物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而且相關(guān)研究也報(bào)道稱，真菌對(duì)甾體化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)絕大部分進(jìn)行的是甾體衍生物羥基化的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程。

3.3 固定化細(xì)胞生物催化轉(zhuǎn)化法

甾體化合物具有較強(qiáng)的疏水性以及受到底物傳質(zhì)的制約，使得生物轉(zhuǎn)化效率受到了影響，針對(duì)這一問(wèn)題許多研究者通過(guò)研究磁場(chǎng)、表面活性劑以及超聲波等來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，從而進(jìn)一步增強(qiáng)底物的溶解。

固定化細(xì)胞生物催化轉(zhuǎn)化技術(shù)在對(duì)甾體化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)幾乎已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了甾體藥物的半連續(xù)化生產(chǎn)，該項(xiàng)技術(shù)不僅能有效增加菌體溶液的濃度，同時(shí)菌體也可以重復(fù)利用[6]。通常在對(duì)菌體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體可能會(huì)發(fā)生自溶現(xiàn)象，而采取固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化法有望解決該弊端，使得菌體保持開始的狀態(tài)。固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化法主要包括底物包埋和交聯(lián)、載體介質(zhì)的吸附以及共價(jià)結(jié)合等主要步驟，此外，固定化細(xì)胞應(yīng)用于載體化合物羥基的生物轉(zhuǎn)化中時(shí)的催化效率主要取決于載體本身的性質(zhì)特點(diǎn)，其次反應(yīng)條件的設(shè)置會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞活性產(chǎn)生一定的影響。目前常用的固定化甾體有海藻酸鹽凝膠、聚乙烯醇、葡聚糖凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠等，在實(shí)際操作中將收集到的菌體固定到聚丙烯酰胺凝膠中可以重復(fù)多次地催化底物發(fā)生羥基化反應(yīng)，從而在最大程度上提高固定效率和產(chǎn)率。

4 結(jié)語(yǔ)

文章重點(diǎn)闡述了生物轉(zhuǎn)化相關(guān)應(yīng)用以及甾體衍生物羥基化的生物轉(zhuǎn)化原理，此外進(jìn)一步闡明了甾體衍生物羥基化生物轉(zhuǎn)化的研究方向和進(jìn)展。

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，最主要的是微生物技術(shù)的應(yīng)用，甾體衍生物的轉(zhuǎn)化已經(jīng)不只是局限于轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化的專一性，而更加注重的是轉(zhuǎn)化的途徑和過(guò)程，安全高效的轉(zhuǎn)化過(guò)程是大家迫切追求的結(jié)果，許多科學(xué)家利用分子生物學(xué)、合成生物學(xué)等多種生物方法和策略來(lái)優(yōu)化甾體類藥物的合成過(guò)程。甾體衍生物尤其是作為藥物的甾體化合物通常均具有較高的藥理活性，甾體衍生物羥基化轉(zhuǎn)化能否取得較高的產(chǎn)率一直都是制備的難題，而如何有效地提高底物濃度，即在轉(zhuǎn)化過(guò)程中擁有更多有利的產(chǎn)物，構(gòu)建并選擇有效的生物轉(zhuǎn)化介質(zhì)，同時(shí)解決底物疏水性等問(wèn)題，對(duì)提高底物濃度，增加產(chǎn)率具有重要意義。因此現(xiàn)階段需要尋找更加普適的轉(zhuǎn)化體系，構(gòu)建新型綠色的生物轉(zhuǎn)化體系是目前亟待解決的問(wèn)題，新型“綠色溶劑”成為大家迫切關(guān)注的問(wèn)題。

綜上所述，在對(duì)甾體衍生物羥基化進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)仍然需要我們依據(jù)現(xiàn)有的理論知識(shí)和現(xiàn)有的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)而不斷去探索，去選擇新的途徑，依據(jù)前人的科學(xué)研究經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)并歸納相關(guān)轉(zhuǎn)化體系和技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行深入細(xì)致的研究，雖然距產(chǎn)物大規(guī)模工業(yè)化尚有一定的距離，但是應(yīng)用前景廣闊。