黑芥子苷通過(guò)p38/JNK MAPK信號(hào)通路對(duì)阿霉素心臟毒性的保護(hù)作用

阿霉素屬于蒽環(huán)類(lèi)抗生素，廣泛應(yīng)于白血病、淋巴瘤以及實(shí)體瘤等的治療[1-2]。然而，阿霉素的心臟毒性限制了其臨床應(yīng)用。應(yīng)用阿霉素后的心臟功能障礙在治療期間或治療停止后數(shù)周至數(shù)年內(nèi)出現(xiàn)，其心臟毒性可表現(xiàn)為心包炎、心律失常、充血性心力衰竭以及治療后即會(huì)出現(xiàn)的可逆性低血壓，長(zhǎng)期應(yīng)用阿霉素治療死亡率超過(guò)50%[3-4]。阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性可能涉及多種途徑，其中阿霉素誘導(dǎo)的線粒體功能障礙是其誘導(dǎo)心臟毒性的關(guān)鍵[5]。阿霉素對(duì)心磷脂具有高親和力，與心磷脂結(jié)合后可進(jìn)入線粒體，抑制呼吸鏈功能，最終引起心肌細(xì)胞凋亡[6-7]。

黑芥子苷是十字花科植物如西蘭花中天然存在的葡萄糖苷類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤和抗炎作用[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，黑芥子苷還可在抗動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用[11]，但其是否能預(yù)防阿霉素引起的心臟毒性尚不清楚。本研究探討黑芥子苷對(duì)阿霉素所致心臟毒性的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

32只10周齡C57/BL6成年雄性小鼠購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，體質(zhì)量23.5～27.5 g，SPF級(jí)。黑芥子苷購(gòu)于上海融禾公司，批號(hào)64550-88-5，純度>98%；3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、p38絲裂原激活蛋白激酶(T-p38)抗體、磷酸化的p38絲裂原激活蛋白激酶(P-p38)抗體、c-Jun氨基末端激酶(T-JNK)抗體、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(P-JNK)抗體、Bax抗體和Bcl-2抗體等一抗均購(gòu)于美國(guó)CST公司；熒光標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)LI-COR公司；化學(xué)發(fā)光蛋白檢測(cè)顯影液購(gòu)于美國(guó)Borad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)回后，適應(yīng)環(huán)境1周，隨機(jī)分為對(duì)照組、黑芥子苷組、阿霉素組和黑芥子苷+阿霉素組，每組各8只。阿霉素組和黑芥子苷+阿霉素組小鼠給予單次腹腔注射阿霉素(15 mg/kg)，對(duì)照組和黑芥子苷組給予單次腹腔注射生理鹽水(15 mg/kg)，黑芥子苷組和黑芥子苷+阿霉素組小鼠同時(shí)用黑芥子苷5 mg/kg灌胃，每2天1次，共3次。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

腹腔注射后第7天，采用多普勒心臟超聲檢測(cè)4 組小鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù) (LVEF)以及左室短軸縮短率(LVFS)。

1.4 Western blot檢測(cè)

小鼠稱(chēng)重并記錄后處死，沿胸骨中線剪開(kāi)皮膚，充分暴露心臟后取出心臟，將心腔內(nèi)血液輕輕擠出，稱(chēng)量心臟質(zhì)量。將各組心臟組織溶解于裂解緩沖液中，采用BCA法測(cè)量蛋白濃度，蛋白經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育40 min，ECL顯影。使用ImageJ軟件對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量，GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑芥子苷對(duì)阿霉素所致心臟毒性的保護(hù)作用

黑芥子苷組與對(duì)照組小鼠超聲心動(dòng)圖各指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，阿霉素組小鼠LVEDD、LVESD均明顯增大，而LVEF和LVFS均明顯減小(P均<0.05)。與阿霉素組相比，黑芥子苷+阿霉素組小鼠LVEDD、LVESD均明顯減小，LVEF和LVFS均明顯增大(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 黑芥子苷減輕阿霉素所致心肌細(xì)胞凋亡

Western blot結(jié)果顯示，黑芥子苷組與對(duì)照組小鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組小鼠相比，阿霉素組小鼠心肌Bax表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2表達(dá)水平明顯降低(P均<0.05)；與阿霉素組相比，黑芥子苷+阿霉素組Bax表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2表達(dá)水平明顯升高，(P均<0.05)，見(jiàn)圖1、表2。

表1 各組小鼠心功能比較

注：與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與阿霉素組比較，(2)P<0.05

圖1 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表2 各組小鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與阿霉素組比較，(2)P<0.05

2.3 黑芥子苷通過(guò)p38/JNK MAPK減輕阿霉素的心臟毒性

Western blot結(jié)果顯示，黑芥子苷組與對(duì)照組小鼠MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，阿霉素組小鼠心肌中磷酸化的p38和JNK的表達(dá)水平明顯升高(P均<0.05)；與阿霉素組相比，黑芥子苷+阿霉素組磷酸化的p38和JNK的表達(dá)水平明顯降低(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表3 各組小鼠MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與阿霉素組比較，(2)P<0.05

3 討論

本研究探討黑芥子苷對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的潛在保護(hù)作用，并闡明這種保護(hù)作用的可能機(jī)制。LVEF和LVFS的下降是阿霉素誘導(dǎo)的心臟功能降低的表現(xiàn)[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)阿霉素誘導(dǎo)心臟功能惡化，表現(xiàn)為L(zhǎng)VEF和LVFS的降低，而使用黑芥子苷干預(yù)后，小鼠心功能明顯改善。

體外和體內(nèi)研究表明，阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性與心肌細(xì)胞凋亡和壞死有關(guān)[13-15]。線粒體是阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自由基毒性的靶點(diǎn)[16]。阿霉素可引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開(kāi)放，允許小分子通過(guò)線粒體膜，導(dǎo)致線粒體三功能蛋白(MTP)崩潰，進(jìn)而引起線粒體腫脹和破裂，促細(xì)胞凋亡分子釋放到胞質(zhì)中[17]。線粒體在阿霉素誘導(dǎo)的心肌病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，預(yù)防線粒體功能障礙可影響心肌改變，使心臟出現(xiàn)好的轉(zhuǎn)歸[18]。在本研究中，我們觀察到阿霉素使促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，但黑芥子苷干預(yù)可減弱阿霉素介導(dǎo)的促凋亡現(xiàn)象。

MAPK在細(xì)胞增殖、分化和死亡中起重要作用。MAPK家族由3個(gè)成員組成：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)，JNK和p38。MAPK信號(hào)通路是通過(guò)氧化應(yīng)激觸發(fā)細(xì)胞凋亡的主要中間體。JNK和p38參與阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[7,19]。因此，我們研究了黑芥子苷對(duì)p38/JNK MAPK信號(hào)通路的影響。在本研究中，經(jīng)阿霉素作用后，心臟組織p38和JNK的磷酸化水平升高，而黑芥子苷抑制了阿霉素誘導(dǎo)的JNK和p38的磷酸化。

在本研究中，我們使用黑芥子苷干預(yù)阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性，結(jié)果表明黑芥子苷通過(guò)p38/JNK MAPK信號(hào)通路發(fā)揮心臟保護(hù)作用，這為黑芥子苷減輕阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性提供了理論依據(jù)。