劉文靜，孫宏莉，張小江，王 瑤，楊啟文，竇紅濤，王 賀，趙 穎，郭莉娜，劉亞麗，張 麗，肖 盟，徐英春

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730；2.北京市侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730）

布魯菌病是一種常見(jiàn)的動(dòng)物源性疾病，感染對(duì)象包括家畜、野生動(dòng)物和人，一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物是布魯菌的無(wú)癥狀攜帶者。人感染布魯菌病的潛伏期長(zhǎng)短不一，一般是1～4周。因布魯菌寄生在巨噬細(xì)胞內(nèi)，可通過(guò)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)至循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的趨向性播散至全身，導(dǎo)致疾病的不同階段[1]。布魯菌病起病隱匿，可表現(xiàn)為廣泛多樣性的非特異臨床癥狀和體征，如發(fā)熱、盜汗、關(guān)節(jié)痛、肌痛、乏力、食欲缺乏、體重減輕和肝脾腫大等。并發(fā)癥可涉及多個(gè)器官和組織，可有局限病灶，兒童表現(xiàn)為相似的臨床表現(xiàn)[2]。引起人的感染發(fā)熱初期與瘧疾、傷寒等疾病容易混淆，給臨床診斷帶來(lái)極大挑戰(zhàn)，病史采集和體格檢查對(duì)于感染性疾病的診斷和經(jīng)驗(yàn)性治療是決定性的[3]。布魯菌感染急性期經(jīng)規(guī)范治療多可治愈，若治療不及時(shí)或不規(guī)范可轉(zhuǎn)為慢性，不同區(qū)域布魯菌流行的特點(diǎn)略有不同[4]，為提高臨床醫(yī)生對(duì)該病的認(rèn)識(shí)，減少誤診漏診，使患者得到及時(shí)正確的診斷治療，現(xiàn)將2009～2018年北京協(xié)和醫(yī)院布魯菌感染的臨床和實(shí)驗(yàn)室特征分析如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科2009～2018年134例布魯菌感染患者送檢外周血自動(dòng)化血培養(yǎng)（185）及組織（8）、骨髓（7）、腦脊液（3）、關(guān)節(jié)液（2）和玻璃體（1）等普通培養(yǎng)標(biāo)本共206例。

1.2 試劑和儀器 血瓊脂平板、不含萬(wàn)古霉素的巧克力瓊脂平板、中國(guó)藍(lán)瓊脂平板（英國(guó)Oxoid公司）；BACTEC? FX全自動(dòng)血培養(yǎng)儀（美國(guó)BD公司）；BacT/ALERT 3D，氧化酶（法國(guó)生物梅里埃公司）；觸酶試劑（實(shí)驗(yàn)室新鮮配制）；尿素微量生化反應(yīng)管（杭州濱和微生物試劑有限公司）；布魯菌凝集試劑盒（法國(guó)生物梅里埃公司）。

1.3 方法

1.3.1 布魯菌培養(yǎng)：嚴(yán)格按照北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科外周血自動(dòng)化血培養(yǎng)及無(wú)菌標(biāo)本病原微生物鑒定操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)。全部操作均在生物安全柜中進(jìn)行。

1.3.2 布魯菌凝集實(shí)驗(yàn)：按試劑說(shuō)明書(shū)在反應(yīng)卡孔內(nèi)加入試劑R1（經(jīng)孟加拉玫紅染色的滅活牛布魯菌）15μl與待檢血清15μl，用攪拌棒混勻，緩慢搖動(dòng)反應(yīng)卡4min，觀察凝集反應(yīng)。凝集(包括弱凝集)為陽(yáng)性，不凝集為布魯菌抗體陰性。

1.3.3 布魯菌屬陽(yáng)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)：37℃需氧或5～10ml/d1 CO2孵育24～48h后形成邊緣整齊、光滑、有折光性、直徑為1～2mm的菌落，鏡下形態(tài)典型沙灘樣，革蘭陰性小球桿菌，氧化酶、觸酶和快速脲酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，即可初步報(bào)告可疑布魯菌屬[5]。

2 結(jié)果

2.1 布魯菌感染的臨床特征 男性患者88例，女性患者46例，平均年齡48歲（1～78歲）。接觸史方面：50%患者曾生活在疫區(qū)，接觸牲畜、生牛羊肉及食用未滅菌奶制品等。臨床表現(xiàn)前三位的癥狀和體征為發(fā)熱（66例）、關(guān)節(jié)痛和／或肌肉痛伴乏力（23例）、心臟?。?0例）。另外還有頭痛、憋氣、納差、布魯菌病脊柱炎、淋巴結(jié)腫大、睪丸腫大、腦膜炎、腎炎、眼內(nèi)炎及多器官受累等多種臨床表現(xiàn)。

2.2 布魯菌感染的科室分布 住院99例、門(mén)診62例、急診45例。分離前五位的科室為感染內(nèi)科（49例）、急診科（34例）、普通內(nèi)科（11例）、發(fā)熱門(mén)診（9例）、骨科（3例）。其他科室包括呼吸內(nèi)科、免疫內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科、心胸外科、兒科、腎內(nèi)科、消化內(nèi)科、血管外科、眼科和內(nèi)分泌科，其中有少數(shù)患者轉(zhuǎn)診于兩個(gè)不同的科室，主要為急診科轉(zhuǎn)到血管外科和普內(nèi)科各1例；胸外科轉(zhuǎn)外科ICU和血管外科各1例，內(nèi)分泌科轉(zhuǎn)胸外科1例。

2.3 布魯菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本分析 布魯菌需氧血培養(yǎng)瓶陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間均值為88.12h（2～481h）。除外周血外，組織、骨髓、腦脊液、關(guān)節(jié)液、玻璃體等標(biāo)本類(lèi)型也有布魯菌的分離。134例布魯菌感染患者標(biāo)本送檢情況為：外周血115例、組織4例、骨髓2例、腦脊液2例和玻璃體1例；部分患者同時(shí)送檢2種不同類(lèi)型的標(biāo)本，其中外周血+骨髓4例，外周血+其他組織3例，外周血+關(guān)節(jié)液2例，骨髓+腦脊液1例。206例送檢陽(yáng)性標(biāo)本中，外周血是重復(fù)送檢比率最高的標(biāo)本類(lèi)型為185例，提示部分患者重復(fù)送檢多套外周血陽(yáng)性。

2.4 布魯菌培養(yǎng)與血清凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性 83例疑似布魯菌感染患者同時(shí)進(jìn)行了布魯菌培養(yǎng)和布魯菌凝集實(shí)驗(yàn)，82例患者布魯菌培養(yǎng)和血清凝集實(shí)驗(yàn)同時(shí)陽(yáng)性，1例患者布魯菌培養(yǎng)陽(yáng)性，血清凝集陰性。

2.5 2009～2018年北京協(xié)和醫(yī)院布魯菌陽(yáng)性分離趨勢(shì) 見(jiàn)圖1。十年間，2015～2017年是布魯菌分離率最高的3年。

圖1 2009年～2018年布魯菌培養(yǎng)陽(yáng)性分離例數(shù)趨勢(shì)

2.6 2009～2018年北京協(xié)和醫(yī)院布魯菌培養(yǎng)陽(yáng)性例數(shù)隨季節(jié)分配情況 見(jiàn)圖2。4～7月是布魯菌培養(yǎng)陽(yáng)性分離最高的季節(jié)。

圖2 2009～2018年北京協(xié)和醫(yī)院布魯菌陽(yáng)性季節(jié)分配情況

2.7 布魯菌感染的用藥及轉(zhuǎn)歸 參考衛(wèi)健委印發(fā)的《布魯氏菌病診療指南》[6]，134例患者中2例為隱性感染病例，其他均為確診病例。嚴(yán)格按照推薦用藥方案進(jìn)行治療：一線藥物為多西環(huán)素聯(lián)合利福平或鏈霉素，二線藥物為多西環(huán)素聯(lián)合復(fù)方新諾明或妥布霉素，利福平聯(lián)合氟喹諾酮類(lèi)。難治性病例加用氟喹諾酮類(lèi)或三代頭孢菌素類(lèi)。隱性感染病例是否需要治療目前尚無(wú)循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，建議給予治療。急性期療程為6周，且外周血培養(yǎng)陰性方可考慮停藥，治療過(guò)程中需口服保肝護(hù)胃等藥物，定期復(fù)查血細(xì)胞計(jì)數(shù)、肝腎功能、紅細(xì)胞沉降率、超敏C反應(yīng)蛋白、外周血培養(yǎng)等，警惕藥物副作用，如有進(jìn)行性加重血細(xì)胞計(jì)數(shù)及肝腎功能異常時(shí)需停藥并及時(shí)就診；慢性期（病程超過(guò)6個(gè)月仍未痊愈）治療周期達(dá)半年甚至一年以上。考慮到藥物的毒副作用，如利福平相關(guān)的骨髓抑制、肝功能損傷等，會(huì)暫緩使用或改為阿米卡星和/或左氧氟沙星進(jìn)行治療。四環(huán)素類(lèi)藥物中米諾環(huán)素抗菌活性最強(qiáng)，多西環(huán)素不良反應(yīng)最少，用藥組合時(shí)也會(huì)權(quán)衡進(jìn)行選擇。并發(fā)睪丸炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、血管炎、脊椎炎、其他器官或組織膿腫的病例，加用了三代頭孢菌素頭孢曲松。

除13例門(mén)急診患者確診后無(wú)后續(xù)診療記錄，2例患者因其他基礎(chǔ)疾病急劇惡化放棄治療外，其他117例均為治療有效，好轉(zhuǎn)或治愈。慢性布魯菌感染患者7例，1例因不規(guī)律用藥和食用未滅菌奶制品有關(guān)，3例久住疫區(qū)販賣(mài)養(yǎng)殖牲畜有關(guān)。特殊人群（1歲兒童）感染1例，鏈霉素和四環(huán)素治療有效。

3 討論

布魯菌的感染劑量很低（≤102個(gè)病原菌），感染主要發(fā)生在成年男性，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[4-5，7]報(bào)道一致，可能主要與職業(yè)有關(guān)，因感染大多發(fā)生在乳制品行業(yè)人員、獸醫(yī)、屠宰場(chǎng)工人、臨床和微生物學(xué)研究人員中，從事這些行業(yè)的較多為男性。感染的主要途徑為與感染動(dòng)物組織的直接皮膚接觸（比如通過(guò)傷口和擦傷）、吸入含感染性顆粒的氣溶膠、意外接種（如噴霧劑或氣溶膠接種到眼、口和鼻）等。人與人的傳播有可能發(fā)生，但非常罕見(jiàn)。布魯菌感染的高發(fā)季節(jié)為4～7月與GUAN P[8]等報(bào)道的發(fā)病季節(jié)峰3～8月一致，與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道北方流行的高峰為5月份一致[4]。2009年～2018年北京協(xié)和醫(yī)院布魯菌培養(yǎng)陽(yáng)性分離情況， 除2009年和2018年陽(yáng)性檢出僅為3例外，整體呈上升趨勢(shì)，可能與就診患者人群有很大關(guān)系，布魯菌感染患者是否來(lái)協(xié)和醫(yī)院就診有關(guān)。通過(guò)對(duì)布魯菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者科室分布和高發(fā)季節(jié)等數(shù)據(jù)的分析，應(yīng)引起就診率高的相關(guān)科室醫(yī)師在相應(yīng)季節(jié)時(shí)注意對(duì)布魯菌感染的鑒別診斷。

培養(yǎng)是布魯菌病實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。由于布魯菌是高致病菌，陽(yáng)性培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)種、染色、進(jìn)一步生化鑒定、分型、藥敏、PCR，質(zhì)譜等試驗(yàn)均有較高的實(shí)驗(yàn)室感染風(fēng)險(xiǎn)，不建議一般的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。急性布魯菌病培養(yǎng)陽(yáng)性率（40%～90%）高于慢性、局限病灶和病情復(fù)雜的布魯菌?。?%～20%），骨髓培養(yǎng)比外周血培養(yǎng)陽(yáng)性率高15%～20%，腦脊液布魯菌培養(yǎng)陽(yáng)性率低（5%～30%）。血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板37℃，5%～10%（v/v） CO2孵育10天，若仍無(wú)菌生長(zhǎng)，則報(bào)告陰性[9-10]。自動(dòng)連續(xù)監(jiān)測(cè)血培養(yǎng)系統(tǒng)，大部分細(xì)菌一周之內(nèi)可以快速監(jiān)測(cè)到細(xì)菌生長(zhǎng)，沒(méi)有必要孵育超過(guò)10～14天[10]。但實(shí)際工作中為了同時(shí)捕獲一些其他非典型性病原體，往往將懷疑布魯菌感染的自動(dòng)化培養(yǎng)延長(zhǎng)至21天。布魯菌的準(zhǔn)確診斷，極大依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室工作人員的經(jīng)驗(yàn)，由于布魯菌菌落形態(tài)的不特異性，當(dāng)菌量比較少時(shí)，極易被當(dāng)成污染菌。不同類(lèi)型臨床標(biāo)本的送檢極大依賴(lài)于臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)高度懷疑布魯菌感染時(shí)應(yīng)提高骨髓標(biāo)本的送檢率，局限病灶時(shí)應(yīng)考慮相應(yīng)部位標(biāo)本的送檢，以便提高陽(yáng)性檢出率。

血清學(xué)試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室診斷布魯菌病最常用的方法，可早期快速診斷[11]。布魯菌感染過(guò)程中，首先出現(xiàn)IgM抗體，接下來(lái)10～14天內(nèi)出現(xiàn)IgG抗體。一般這些抗體和其他的免疫球蛋白的變化依賴(lài)于機(jī)體對(duì)治療的反應(yīng)，在恢復(fù)期可觀察到抗體滴度逐步緩慢下降，若滴度持續(xù)較高則提示治療反應(yīng)不佳，可能存在局部并發(fā)癥、慢性感染或復(fù)發(fā)，但15%～20%正在治療和痊愈的無(wú)癥狀患者也會(huì)出現(xiàn)抗體持續(xù)存在，目前尚無(wú)法解釋此現(xiàn)象[10]。治愈后患者抗體維持陽(yáng)性滴度其意義尚未明確。血清學(xué)試驗(yàn)使用的抗原通常來(lái)自于馬爾他布魯菌和流產(chǎn)布魯菌，犬布魯菌和綿羊布魯菌主要以粗糙型菌落存在，與其他菌種不存在交叉抗原[12]。血清凝集試驗(yàn)無(wú)法區(qū)分抗體的類(lèi)型，急性病例中應(yīng)用較好，復(fù)雜和慢性病例中假陰性率高[5]。本文中有1例患者培養(yǎng)陽(yáng)性，但血清凝集試驗(yàn)陰性，可能與病情復(fù)雜多器官受累有關(guān)。酶免測(cè)定可區(qū)分IgM，IgG和IgA，尤其在慢性、局灶性和復(fù)發(fā)性布魯菌病具有較高的敏感度和特異度，被認(rèn)為是篩選布魯菌血清抗體的好方法。

質(zhì)譜技術(shù)近些年來(lái)也開(kāi)始應(yīng)用到布魯菌的鑒定中，但由于涉及到活菌的操作一定要注意生物安全，有報(bào)道指出質(zhì)譜將羊布魯菌錯(cuò)誤的鑒定為人蒼白桿菌[13]，可能與其建庫(kù)有關(guān)，所以警示實(shí)驗(yàn)室人員不能過(guò)度依賴(lài)新興技術(shù)，對(duì)于特殊病原菌尚需涂片染色、生化反應(yīng)等傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行復(fù)核。

8歲以下兒童及孕婦特殊人群治療可選用利福平聯(lián)合復(fù)方新諾明治療。妊娠12周內(nèi)選用三代頭孢菌素類(lèi)聯(lián)合復(fù)方新諾明治療。本研究中1歲兒童布魯菌感染患者用鏈霉素和四環(huán)素治療有效，值得借鑒。布魯菌對(duì)四環(huán)素、利福平和氨基糖甙類(lèi)抗生素罕有耐藥，聯(lián)合藥物治療比單一藥物治療可減少?gòu)?fù)發(fā)，使用喹諾酮類(lèi)和廣譜頭孢菌素的治療方案有較高的復(fù)發(fā)率，盡管體外藥敏提示有較好的MIC[14]，但本文尚未發(fā)現(xiàn)這樣的規(guī)律。實(shí)驗(yàn)室高風(fēng)險(xiǎn)暴露后的預(yù)防治療（四環(huán)素和利福平治療3～6周）問(wèn)題還存在爭(zhēng)議，暴露后的管理指南是經(jīng)驗(yàn)性的指南[15-16]，然而暴露后還是建議采集基礎(chǔ)水平時(shí)的血液標(biāo)本，每周監(jiān)測(cè)，直至6個(gè)月，同時(shí)在0，2，4，6和24周分別進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)。

盡管巴氏消毒法、紫外線照射、酸液、多種防腐劑和消毒劑可殺死布魯菌，但它能在多種環(huán)境中存活一段較長(zhǎng)的時(shí)間，如在土壤中存活10年，在流產(chǎn)胎兒中可存活11周，在牛糞便中可存活17周，在牛奶和冰淇淋中約存活3周，在新鮮奶酪中可存活數(shù)月[17]。所以一定要加強(qiáng)布魯菌病的流行病學(xué)調(diào)查和宣傳教育，尤其是在疫區(qū)，避免布魯菌病的高發(fā)和傳播，建議采用多種方法綜合診斷布魯菌病，但一定要注意生物安全。

本文不足之處，由于北京協(xié)和醫(yī)院為全國(guó)疑難病診治中心，難以通過(guò)籍貫判斷患者為流動(dòng)或常駐人群，難以區(qū)分不同區(qū)域患者疾病特點(diǎn)是否不同。部分患者為門(mén)急診患者，用藥及轉(zhuǎn)歸情況不詳。如果能夠完善布魯菌病確診的大致時(shí)間、不同期不同方法的陽(yáng)性檢出率、誤診的幾率等可為臨床布魯菌病的診治提供更加完善的信息。