限飼對(duì)初情期小鼠乳腺發(fā)育的影響及機(jī)制

鄭吉松，陳雙，楊強(qiáng)，張靜，袁聰，朱曉彤，束剛，王麗娜，高萍，江青艷，王松波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642)

作為哺乳動(dòng)物的泌乳器官，良好的發(fā)育是乳腺充分發(fā)揮泌乳功能的前提，對(duì)動(dòng)物子代的生長(zhǎng)發(fā)育及畜牧業(yè)生產(chǎn)具有重要影響。因此，研究影響乳腺發(fā)育的因素及其機(jī)制對(duì)提高動(dòng)物泌乳性能及畜牧業(yè)生產(chǎn)提質(zhì)增效具有重要意義。

哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)育期包括初情期、妊娠期和泌乳期等不同階段[1]。豬乳腺發(fā)育有3個(gè)關(guān)鍵階段，分別是90日齡到性成熟期間、妊娠期后三分之一階段和哺乳期[2]。乳腺的發(fā)育受到遺傳、激素、營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境等不同因素的影響[1-3]，其中營(yíng)養(yǎng)對(duì)乳腺的發(fā)育起著非常重要的作用[3-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂日糧會(huì)抑制初情期小鼠乳腺的發(fā)育[5-6]；相反，限飼或者過(guò)瘦也會(huì)影響乳腺的發(fā)育，例如：母豬90日齡至性成熟期間，25%的限飼可顯著降低乳腺實(shí)質(zhì)質(zhì)量、乳腺組織DNA 和RNA 含量[7]。此外，一定程度的能量限制是預(yù)防乳腺癌的潛在策略[8]，但是過(guò)量限飼也會(huì)抑制乳腺的正常發(fā)育。目前，對(duì)于限飼調(diào)控初情期哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)育的機(jī)制尚不清楚。

本試驗(yàn)以初情期小鼠為對(duì)象，在研究限飼對(duì)初情期小鼠乳腺導(dǎo)管發(fā)育的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索限飼對(duì)初情期小鼠血清中胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insu lin-like growth factor 1,IGF-1)和雌二醇(Estradiol,E2)水平及乳腺組織中增殖相關(guān)蛋白增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表達(dá)的影響，旨在揭示限飼對(duì)初情期小鼠乳腺發(fā)育的影響及其機(jī)制，為動(dòng)物乳腺發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用24只4周齡的C57BL/6J 雌性小鼠(購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，預(yù)飼喂正常日糧3 d后，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(自由采食日糧)和限飼組(每天飼喂對(duì)照組小鼠前一天平均采食量的70%)，每組12只。將小鼠同室分籠飼養(yǎng)，自由采食飲水；每天光照與黑暗各12 h，環(huán)境溫度控制在(25±1) ℃，濕度(60±5)%。每周進(jìn)行小鼠采食量、飲水量和體質(zhì)量的測(cè)定，采樣前對(duì)小鼠進(jìn)行體成像和體組成檢測(cè)，飼養(yǎng)4周后，眼球采血靜置離心分離得到血清，并對(duì)血清IGF-1和E2水平進(jìn)行檢測(cè)；通過(guò)頸部脫臼方式處死小鼠，采集小鼠乳腺組織、褐色脂肪和內(nèi)臟脂肪組織并稱質(zhì)量，同時(shí)對(duì)乳腺進(jìn)行染色和蛋白表達(dá)等檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)材料

小鼠日糧購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；百里酚、胭脂紅和硫酸鋁鉀購(gòu)于成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；輕型小動(dòng)物成分分析儀(上海紐邁電子科技有限公司)用于對(duì)小鼠進(jìn)行體成像和體成分測(cè)定；IGF-1放射免疫試劑盒購(gòu)于天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；PCNA 抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

乳腺采集和Whole-mount 染色：切下右側(cè)乳腺腹腺體(第4對(duì)乳腺)并稱質(zhì)量，涂在玻璃載玻片上，進(jìn)行Whole-mount 染色[5]，顯微鏡下觀察初情期小鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計(jì)乳腺組織終末乳芽(Terminal end bud，TEB)數(shù)量和導(dǎo)管分支數(shù)量。

PCNA 蛋白的免疫熒光染色：步驟為組織脫水、包埋、切片、抗原修復(fù)、血清封閉、孵一抗過(guò)夜、孵二抗、DAPI 復(fù)染細(xì)胞核、封片，之后在免疫熒光顯微鏡下觀察初情期小鼠乳腺組織熒光強(qiáng)弱并分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SigmaPlot 12.5軟件分析，采用t檢驗(yàn)比較對(duì)照組和限飼組的統(tǒng)計(jì)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 限飼對(duì)初情期小鼠生長(zhǎng)性狀的影響

如圖1a 所示，限飼組小鼠的第1周體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，從第2周開始，限飼組小鼠的體質(zhì)量極顯著低于對(duì)照組(P＜0.001)；每周限飼組小鼠的體增質(zhì)量均極顯著低于對(duì)照組(圖1b)；另外，限飼組小鼠平均日采食量和平均日能量攝入均極顯著低于對(duì)照組(圖1c、1d)；然而，限飼組小鼠平均日飲水量極顯著高于對(duì)照組(圖1e)。

圖1 限飼對(duì)初情期小鼠生長(zhǎng)性狀的影響Fig.1 Effects of feed restriction on growth traits of pubertal mice

2.2 限飼對(duì)初情期小鼠體組成及不同部位脂肪的影響

體成像和體組成檢測(cè)結(jié)果(圖2、圖3)表明，與對(duì)照組相比，限飼不會(huì)顯著改變初情期小鼠的整體肌肉含量和脂肪含量。

采樣褐色脂肪和內(nèi)臟脂肪的結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，限飼對(duì)初情期小鼠的褐色脂肪指數(shù)(褐色脂肪質(zhì)量占體質(zhì)量百分比)無(wú)顯著影響(圖4A)，但可極顯著降低內(nèi)臟脂肪指數(shù)(內(nèi)臟脂肪質(zhì)量占體質(zhì)量百分比)(圖4B)。

2.3 限飼對(duì)初情期小鼠乳腺發(fā)育的影響

圖2 限飼對(duì)初情期小鼠體成像的影響Fig.2 Effect of feed restriction on the body im aging of pubertal mice

圖3 限飼對(duì)初情期小鼠體組成的影響Fig.3 Effects of feed restriction on the body com position of pubertal mice

圖4 限飼對(duì)初情期小鼠褐色脂肪和內(nèi)臟脂肪的影響Fig.4 Effects of feed restriction on the brown adipose tissue and visceral adipose tissue of pubertal mice

圖5 限飼對(duì)初情期小鼠乳腺形態(tài)和導(dǎo)管發(fā)育的影響Fig.5 Effects of feed restriction on mammary gland morphology and duct development of pubertal mice

小鼠乳腺Whole-mount 染色如圖5所示，與對(duì)照組小鼠相比，限飼組小鼠的乳腺組織在乳腺導(dǎo)管的密度和數(shù)量上有明顯的降低；此外，與對(duì)照組小鼠相比，限飼組小鼠的乳腺質(zhì)量顯著降低29%，同時(shí)限飼組小鼠乳腺導(dǎo)管分支數(shù)量顯著降低，導(dǎo)管的TEB數(shù)量極顯著降低(表1)。

2.4 限飼對(duì)初情期小鼠血清中IGF-1和E2水平的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，限飼可以使初情期小鼠血清中IGF-1水平降低34%，但是對(duì)小鼠血清中E2水平?jīng)]有顯著影響。

表1 限飼對(duì)初情期小鼠乳腺(第4對(duì)右側(cè))發(fā)育性狀的影響1)Table 1 Effects of feed restriction on developmental traitsof mammary gland (the right one of the fourth pair)of pubertal mice

圖6 限飼對(duì)初情期小鼠血清中IGF-1和E2水平的影響Fig.6 Effects of feed restriction on the serum levels of IGF-1 and E2 of pubertal mice

2.5 限飼對(duì)初情期小鼠乳腺組織中增殖相關(guān)蛋白PCNA 表達(dá)的影響

如圖7所示，對(duì)照組乳腺組織導(dǎo)管免疫熒光染色(紅色箭頭部分)明亮清晰，而限飼組乳腺組織導(dǎo)管卻暗淡模糊，由此得知，限飼可以顯著降低乳腺導(dǎo)管增殖相關(guān)蛋白PCNA 的表達(dá)。

圖7 限飼對(duì)初情期小鼠乳腺組織中PCNA 蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of feed restriction on PCNA protein expression in mammary gland of pubertal mice

3 討論與結(jié)論

3.1 限飼對(duì)初情期小鼠生長(zhǎng)和體組成的影響

周期性能量限制能顯著降低羔羊的生長(zhǎng)性能[9]，對(duì)雞和鵝的研究也觀察到類似情況。葉耀輝等[10]的研究表明，限飼對(duì)豬胴體蛋白質(zhì)日沉積量無(wú)顯著影響，但能引起胴體脂肪沉積的減少，從而達(dá)到胴體瘦肉比例相對(duì)增加的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，限飼同樣也能顯著降低小鼠的生長(zhǎng)性能，體質(zhì)量、體增質(zhì)量、平均日采食量和平均日能量攝入均顯著降低，但是平均日飲水量卻顯著升高，這可能是因?yàn)橄揎暯M小鼠能量供給不足，代償性通過(guò)增加飲水量來(lái)彌補(bǔ)能量的缺失。另外，限飼也能顯著降低初情期小鼠內(nèi)臟脂肪指數(shù)，但是對(duì)褐色脂肪指數(shù)、脂肪含量和肌肉含量均無(wú)顯著影響。

3.2 限飼對(duì)初情期小鼠乳腺發(fā)育的影響

許多研究表明，青春期，妊娠期和哺乳期的乳腺快速增生期間，母豬的營(yíng)養(yǎng)會(huì)影響乳腺發(fā)育。母豬90日齡至性成熟，相對(duì)于正常采食量25%的限飼可以顯著降低乳腺實(shí)質(zhì)質(zhì)量、乳腺組織DNA 和RNA 含量，但是，在斷奶后至90日齡對(duì)母豬進(jìn)行34%的限飼不會(huì)影響乳腺的發(fā)育[7]。在本試驗(yàn)中，whole-mount 染色結(jié)果表明，限飼可顯著降低乳腺組織導(dǎo)管分支數(shù)量以及TEB的數(shù)量，提示限飼可顯著抑制初情期小鼠乳腺的發(fā)育。Park 等[11]的研究也發(fā)現(xiàn)，能量限制延遲了大鼠青春期的開始并延緩了母代和后代的生長(zhǎng)，減少了乳腺中的脂肪沉積，但它并沒有影響乳腺細(xì)胞性質(zhì)。但是泌乳母豬飼料限制不會(huì)對(duì)乳汁組成和窩產(chǎn)仔數(shù)產(chǎn)生不利影響[12]?？梢?，不同階段的限飼造成的影響也不相同。

3.3 限飼對(duì)初情期小鼠血清IGF-1和E2水平及乳腺組織中PCNA 蛋白表達(dá)的影響

IGF-1是動(dòng)物出生后生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的重要因子，有研究報(bào)道，IGF-1能增加乳腺上皮細(xì)胞存活率并刺激乳腺上皮細(xì)胞的增殖，還促進(jìn)乳腺腫瘤發(fā)生[13]。Clemmons[14]的研究結(jié)果表明，血清中IGF-1能夠提高動(dòng)物體內(nèi)能量和蛋白的沉積，加快生長(zhǎng)速度。E2是卵巢卵泡顆粒細(xì)胞分泌的一種自然雌激素，能增進(jìn)和調(diào)節(jié)雌性器官及副性征的正常發(fā)育。有研究表明，17β?雌二醇能顯著促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的增殖[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，限飼能顯著降低初情期小鼠血清中IGF-1水平，這可能是導(dǎo)致限飼組小鼠生長(zhǎng)發(fā)育受阻的重要原因。但是，限飼對(duì)初情期小鼠血清中E2水平無(wú)顯著影響。

研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1在初情期小鼠優(yōu)先激活PI3K/Akt 通路，增加細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表達(dá)[13]。本研究中乳腺組織的免疫熒光結(jié)果表明，限飼可以顯著降低乳腺組織增殖相關(guān)蛋白PCNA 的表達(dá)，提示限飼可能抑制血清IGF-1水平，從而降低乳腺組織增殖相關(guān)蛋白PCNA 的表達(dá)來(lái)抑制乳腺發(fā)育。

綜上所述，限飼可抑制初情期小鼠乳腺發(fā)育，其乳腺導(dǎo)管分支數(shù)量和TEB數(shù)量顯著減少。限飼對(duì)初情期小鼠乳腺發(fā)育的抑制作用可能與其抑制增殖相關(guān)蛋白PCNA 的表達(dá)和降低血清中IGF-1水平有關(guān)。本論文研究結(jié)果為動(dòng)物和人類乳腺健康發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供了科學(xué)的參考依據(jù)。