煙酰胺對PM2.5誘導人永生化角質(zhì)形成細胞損傷的保護作用研究

田 軍，常 瑛，樊錦濤，楊 勵

近年來，大氣顆粒物（airborne particulate matter，PM）污染在我國越來越受到重視，直徑在2.5 μm 的顆粒PM2.5 是大氣顆粒物中污染危害最大的部分，也是構成霧霾的主要成分。2012 年我國新修訂的《空氣質(zhì)量標準》增加了PM2.5 的空氣監(jiān)測標準，環(huán)境保護部的數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)城市秋冬季PM2.5 的24 h 平均濃度明顯升高。多年來，關于PM2.5 的基礎及流行病學調(diào)查主要集中在呼吸及心血管系統(tǒng)，近年PM2.5 與皮膚的相關研究也逐漸多了起來[1,2]。近期，新的研究發(fā)現(xiàn)PM2.5 空氣污染可以誘發(fā)或者加重兒童變態(tài)反應性皮膚疾病[3,4]。暴露于高濃度PM2.5 情況下還可以誘發(fā)及加重色素沉著與皺紋，引起皮膚老化[5]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)PM2.5可以明顯升高皮膚的氧化應激水平，同時會造成皮膚免疫功能的紊亂[6,7]。煙酰胺是一種維生素B3 的衍生物，也是美容皮膚科學領域公認的皮膚抗老化成分，以往研究發(fā)現(xiàn)其抗衰老的機制與其強大的抗氧化功能相關[8,9]。本文以體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細胞為研究對象，以PM2.5 誘導細胞損傷，觀察煙酰胺對人永生化角質(zhì)形成細胞（HaCaT）的氧化損傷是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 人永生化角質(zhì)形成細胞系(HaCaT)（第四軍醫(yī)大學饋贈），煙酰胺（上海信誼藥廠有限公司），1640 培養(yǎng)基（Hyclon 生物公司），胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）、0.25%胰蛋白酶消化液（含EDTA）（美國Thermo Fisher Scientific 公司GIBCO 品牌），CCK-8 細胞活性檢測試劑盒（上海七海復泰生物科技有限公司），活性氧簇（ROS）檢測試劑盒、總抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽還原酶（GR）檢測試劑盒（碧云天公司），Annexin V-FITC / PI 細胞凋亡試劑盒（美國Biolegend 公司）。倒置顯微鏡（上海光學儀器廠），酶標儀（美國BIORAD），流式細胞儀FACS Calibur（美國BD 公司），空氣總懸浮顆粒物采樣器（安徽藍盾光電子股份有限公司）。

1.1.2 細胞培養(yǎng)及處理 HaCaT 用10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基（含100 U/ml 青霉素，100 U/ml 鏈霉素）37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞達到80%融合時，用0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA 37℃ 5 min消化傳代，在顯微鏡下看見細胞變圓回縮，用10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基終止消化然后以1:3 進行傳代。將細胞分為空白對照組、煙酰胺組、50 μg/ml PM2.5 組、100 μg/ml PM2.5 組、200 μg/ml PM2.5 組、50 μg/ml PM2.5+煙酰胺組、100 μg/ml PM2.5+煙酰胺組和200 μg/ml PM2.5+煙酰胺組，煙酰胺溶液于PM2.5 處理前12 h 加入。

1.2 方法

1.2.1 溶液制備 PM2.5 懸液制備：采用空氣總懸浮顆粒物采樣器采集PM2.5 樣品，并將收集好的PM2.5 用生理鹽水配制成溶液后置于超聲波清洗儀（200 W，40 kHz）中超聲振蕩15 min，混勻滅菌，高壓滅菌后-20℃保存，使用時用完全培養(yǎng)基配制成相應的濃度。煙酰胺溶液：稱取PP 純品4.88 mg，溶于100 ml 1640 培養(yǎng)基中，充分溶解，過濾后-20℃保存?zhèn)溆?。使用時稀釋成所需的終濃度。

1.2.2 細胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡觀察處理后各組細胞的形態(tài)學變化。

1.2.3 細胞活性檢測 向已處理好的 96 孔培養(yǎng)板每孔加10 μl CCK-8 試劑，置于37℃，5% CO2孵箱中孵育 1 h 后，酶標儀測定 490 nm 處各孔A 值（所測得的數(shù)據(jù)均減去空白對照組的A值 ）。按公式計算細胞活性，細胞活性=A490（處理組）/A490（對照組）×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 處理好的各孔細胞 （1×106）加 入50 μl Binding Buffer 和FITC 標 記的Annexin V（20 μg/ml）5 μl，室溫避光30 min，再加入PI（50 μg/ml）2.5 μl，避光反應5 min 后，加入200 μl Binding Buffer，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3 次。

1.2.5 細胞內(nèi)ROS 水平檢測 去除已處理好各孔細胞 （1×106）的培養(yǎng)基，用PBS 洗1 次，加入500 μl DCFH-DA 工作液，37℃細胞培養(yǎng)箱避光孵育20 min，棄上清后用PBS 洗滌2 次，1 000 r/min 離心3 min，加入500 μl PBS 重懸細胞，流式上機檢測。以平均熒光強度代表細胞內(nèi)ROS 水平進行分析。

1.2.6 總SOD 活性檢測 收集正常及處理組的HaCaT 細胞，加入100 μl 的樣品制備液4℃，1 000 r/min 離心3 min，取上清液作為待測樣本。測定BCA 蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度和預計的蛋白使用量，緩沖液適當稀釋樣品，低溫配制樣本檢測體系。檢測微孔板置于37℃恒溫箱中孵育30 min，酶標儀測定450 nm 波長處的A值。計算樣本中總SOD 活力,待測樣本中SOD 酶活力單位=抑制百分率/（1－抑制百分率）U, 根據(jù)BCA 蛋白定量結果，將SOD 活力單位轉(zhuǎn)化換算為U/mgprot。

1.2.7 GR 檢測 同前處理，取上清液待用，配制各孔反應體系，室溫靜置5 min，酶標儀測定405 nm波長處各孔的A值。按公式計算細胞中GSH 含量（μmol/gprot）=（A測定孔-A空白孔）/（A標準孔-A空白孔）×20 μmol/L×2÷勻漿蛋白濃度（gprot/L）。

1.3 統(tǒng)計學方法

不同濃度損傷組與未處理對照組采用單因素方差分析（one-way ANOVA），加藥組與損傷組組間差異比較采用雙因素方差分析（two-way ANOVA），當P＜0.05 時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度PM2.5 處理組及藥物干預組細胞形態(tài)學變化

圖1 不同濃度PM2.5處理組及藥物干預組細胞密度變化

倒置顯微鏡下觀察正常的HaCaT 細胞形態(tài)呈樹突狀，經(jīng)PM2.5 處理后HaCaT 細胞密度降低，細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞形態(tài)皺縮、細胞樹突數(shù)量減少或消失，變圓變亮。當處理濃度＞100 μg/ml 后，細胞結構明顯破壞。加入煙酰胺藥物后，漂浮的細胞數(shù)量減少，較同濃度PM2.5 處理組細胞樹突完整性好，破壞減少，見圖1。

2.2 不同濃度PM2.5 對HaCaT 細胞活性的影響及煙酰胺處理后變化

PM2.5 對 HaCaT 細胞活性的影響存在濃度依賴關系，隨著PM2.5 濃度增加，HaCaT 細胞的生長活性逐漸降低（對照組vs 50 μg/ml PM2.5 組，P＜0.0001；對照組vs 100 μg/ml PM2.5 組，P＜0.0001；對照組vs 200 μg/ml PM2.5 組，P＜0.0001）。藥物干預組仍可觀察到細胞活性的下降，但下降的程度明顯低于PM2.5 處理組（50 μg/ml PM2.5 組vs 50 μg/ml PM2.5+ 煙 酰 胺 組，P=0.0064；100 μg/ml PM2.5組vs 100 μg/ml PM2.5+ 煙 酰 胺 組，P=0.0301；200 μg/ml PM2.5 組vs 200 μg/ml PM2.5+ 煙 酰 胺 組，P＜0.0001）。煙酰胺的加入在一定程度上抑制了細胞活性的下降（圖2）。

2.3 不同濃度PM2.5 對HaCaT 細胞凋亡的影響及煙酰胺處理后變化

PM2.5 對 HaCaT 細胞凋亡的影響存在濃度依賴關系，相對于對照組細胞，50 μg/ml PM2.5 處理對HaCaT 細胞凋亡即有顯著性改變（P＜0.0001），100 μg/ml PM2.5 處理可引起凋亡細胞比例的升高（P＜0.0001），200 μg/ml PM2.5 處理對細胞凋亡的改變更加顯著（P＜0.0001）。加入煙酰胺的藥物干預組相較于不同濃度PM2.5 處理組，凋亡細胞比例降低（50 μg/ml PM2.5 組vs 50 μg/ml PM2.5+煙酰胺組，P=0.0459；100 μg/ml PM2.5 組vs 100 μg/ml PM2.5+煙酰胺組，P=0.0265；200 μg/ml PM2.5 組vs 200 μg/ml PM2.5+煙酰胺組，P=0.0075）（圖3）。

圖2 不同濃度PM2.5對HaCaT細胞活性的影響及煙酰胺處理后變化

注：* P＜0.05

2.4 不同濃度PM2.5 對HaCaT 細胞ROS 水平的影響及煙酰胺處理后變化

PM2.5 可明顯升高 HaCaT 細胞ROS 水平，呈濃 度 依 賴 關 系（ 對 照 組vs 50 μg/ml PM2.5 組，P=0.0193；對照組vs 100 μg/ml PM2.5 組，P＜0.0001；對照組vs 200 μg/ml PM2.5 組，P＜0.0001）。加入煙酰胺后，雖不能完全抑制細胞內(nèi)ROS 水平的升高，但可以在一定程度上降低細胞內(nèi)ROS 的水平，與同濃度PM2.5 處理組的對比差異具有統(tǒng)計學意義（50 μg/ml PM2.5 組vs 50 μg/ml PM2.5+煙 酰 胺 組，P=0.0359；100 μg/ml PM2.5 組vs 100 μg/ml PM2.5+煙酰胺組，P=0.0338；200 μg/ml PM2.5 組vs 200 μg/ml PM2.5+煙酰胺組，P=0.0149），見圖4。

2.5 不同濃度PM2.5 對HaCaT 細胞SOD 水平的影響及煙酰胺處理后變化

實驗發(fā)現(xiàn)PM2.5 對 HaCaT 細胞SOD 水平的影響存在濃度依賴關系，與對照組相比，PM2.5 處理后細胞SOD 水平降低（對照組vs 50 μg/ml PM2.5組，P＜0.0001；對照組vs 100 μg/ml PM2.5 組，P＜0.0001；對照組vs 200 μg/ml PM2.5 組，P＜0.0001）。給予藥物干預后，SOD 值在PM2.5 50 mmol/L 低濃度組上升最明顯，藥物干預組細胞SOD 水平明顯高于同濃度PM2.5 處理組（50 μg/ml PM2.5 組vs 50 μg/ml PM2.5+煙酰胺組，P＜0.0001；100 μg/ml PM2.5 組vs 100 μg/ml PM2.5+煙酰胺組，P=0.0003；200 μg/ml PM2.5 組vs 200 μg/ml PM2.5+煙酰胺組，P=0.0010），見圖5。

2.6 不同濃度PM2.5 對HaCaT 細胞GR 水平的影響及煙酰胺處理后變化

實驗發(fā)現(xiàn)PM2.5 對 HaCaT 細胞GR 水平的影響存在濃度依賴關系，隨著PM2.5 濃度的增加，細胞GR 水平逐漸降低（對照組vs 50 μg/ml PM2.5 組，P＜0.0001；對照組vs 100 μg/mlPM2.5 組，P＜0.0001；對 照 組vs 200 μg/ml PM2.5 組，P＜0.0001）。 藥物干預組細胞在50 mmol/L、100 mmol/L PM2.5 處理濃度下GR 水平明顯高于同濃度PM2.5 處理組（50 μg/ml PM2.5 組vs 50 μg/ml PM2.5+煙 酰 胺 組，P=0.0220；100 μg/ml PM2.5 組vs 100 μg/ml PM2.5+煙酰胺組，P=0.0106。），但在200 mmol/L PM2.5 損傷濃度下加藥組與同濃度處理組GR 水平未見明顯差異（P=0.8442），見圖6。

3 討論

圖4 不同濃度PM2.5對HaCaT細胞ROS水平的影響及煙酰胺處理后變化

圖5 不同濃度PM2.5對HaCaT細胞SOD水平的影響及煙酰胺處理后變化

圖6 不同濃度PM2.5對HaCaT細胞GR水平的影響及煙酰胺處理后變化

角質(zhì)形成細胞是暴露在外部環(huán)境中皮膚的第一層保護屏障，角質(zhì)形成細胞也是多種皮膚模型的主要組成部分。前期研究發(fā)現(xiàn)PM2.5 表面的有機化合物可以直接滲透至皮膚，影響包含角質(zhì)形成細胞在內(nèi)的多種細胞活性。近期的流行病學調(diào)查及臨床研究表明升高的PM2.5 濃度及皮膚疾病具有一定的相關性，并可以誘發(fā)和加重特應性皮炎及濕疹，然而具體機制尚不清楚[10]。人體皮膚中表皮角質(zhì)形成細胞由基底層逐漸向上移行，逐漸角化，形成表皮的滲透屏障。大氣污染物中的PM2.5 可以上調(diào)前炎癥遞質(zhì)，進一步激活AhR 信號通路，使細胞內(nèi)的ROS 水平升高[11]。所以，本研究利用角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞，在體外研究了PM2.5 對人角質(zhì)形成細胞的活性及凋亡的影響，并進一步觀察了氧化應激相關的ROS 水平，抗氧化物酶SOD 及GR 的水平。研究表明PM2.5 可以降低細胞活性呈劑量依賴模式，這與之前在人支氣管上皮細胞、臍靜脈內(nèi)皮細胞和肺上皮細胞的研究結果一致[12]。此外，證據(jù)表明ROS 升高導致的氧化應激在PM2.5 導致的皮膚疾病中發(fā)揮著重要的作用，但具體機制并不明確[13,14]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)PM2.5 損傷組ROS 明顯升高，呈劑量依賴模式。這可能與高濃度的ROS 破壞細胞的抗氧化抵御功能，產(chǎn)生了直接的氧化損傷有關。SOD 是一種抗氧化酶，是氧自由基的清除者。在筆者的研究中PM2.5 損傷組SOD 水平呈現(xiàn)劑量依賴的升高。這與之前的PM作用于A594 細胞的研究結果不完全一致，該項研究發(fā)現(xiàn)暴露于PM 中的細胞SOD 水平在較小的濃度刺激下升高，在高濃度刺激下才明顯下降[15]。這可能與研究所用PM 大小、濃度及來源不一致有關。前期研究表明高濃度的ROS 可以破壞細胞的氧化-抗氧化平衡，導致氧化應激，進一步激活線粒體凋亡途徑，導致細胞的凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)HaCaT 細胞凋亡率與PM2.5 濃度呈劑量依賴，這與之前呼吸系統(tǒng)PM2.5 作用于相關細胞的實驗結果一致[17]。前期研究發(fā)現(xiàn)GR 的下調(diào)或者缺失可以明顯升高機體或細胞的氧化應激敏感性，ROS 的升高也可以明顯抑制GR水平[18]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)GR 水平與PM2.5 濃度呈劑量依賴，可能與PM2.5 的氧化損傷有關。以上結果表明氧化應激可能在PM2.5 誘導的HeCaT 細胞損傷機制中發(fā)揮著重要的作用。

煙酰胺作為皮膚科常用藥物，在抗衰老方面應用廣泛[19,20]。氧化應激與衰老關系密切，既往其他系統(tǒng)研究表明煙酰胺可以降低細胞氧化應激水平，但具體調(diào)控機制并不明確，可能與β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸及煙酰胺代謝相關[21]。還有研究表明煙酰胺可以明顯降低衰老細胞的ROS 水平，并降低衰老表型的表達，推測其可能機制是煙酰胺激活了線粒體自噬，但研究發(fā)現(xiàn)煙酰胺降低ROS 水平是在線粒體減少之前，所以煙酰胺通過線粒體自噬途徑降低ROS 也有爭議，而且目前也沒有證據(jù)證明煙酰胺可以直接清除細胞內(nèi)ROS[8]。本研究從現(xiàn)象入手，通過觀察氧化應激、抗氧化酶及活性與凋亡指標，研究煙酰胺對于PM2.5 誘導的HeCaT 細胞氧化損傷的影響。研究表明，在相同濃度PM2.5 暴露下，煙酰胺藥物干預組細胞活性、抗氧化酶SOD 及GR 水平均高于處理組，氧化應激指標ROS 水平與凋亡比例低于處理組。其中200 mmol/L PM2.5 損傷濃度下藥物干預組與同濃度處理組GR 水平未見明顯差異，這可能與PM2.5濃度過高，細胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)消耗，不能及時清除氧自由基，引起了脂質(zhì)過氧化，導致合成GR 關鍵細胞器損傷有關。以上研究結果提示煙酰胺具有保護HaCaT 細胞，降低PM2.5 損害的作用，但具體機制仍需進一步研究。