姜興粲，李冰，王瑋瑋，張繼瑜

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線反映了細(xì)菌在培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)、繁殖和衰亡的規(guī)律，在適宜條件下培養(yǎng)，會(huì)出現(xiàn)延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰退期4個(gè)階段。本文采用光電比濁法和活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線，了解其生長(zhǎng)特性與差異。一般情況下，微生物實(shí)驗(yàn)操作步驟繁多，實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)苛，本研究在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題，獲得了豐富的經(jīng)驗(yàn)并總結(jié)了若干條注意事項(xiàng)，期望為以后的研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Bacillus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]菌種均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.2 儀器及試劑

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、恒溫振蕩器、數(shù)控超聲波清洗器、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、LDZM-60KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器、優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)、細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)、比色杯(光徑為10 mm)、sartoriusBSA423S-CW天平、燒杯、試管、三角瓶等。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(產(chǎn)品批號(hào)1073191)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(產(chǎn)品批號(hào)1073051)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(產(chǎn)品批號(hào)1072401)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(產(chǎn)品批號(hào)1073051)均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(產(chǎn)品批號(hào)L2018041910)。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)與活化

參照《中國(guó)獸藥典》(2015年版)的方法進(jìn)行。把標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌CMCC(B)44102，金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003，銅綠假單胞菌CMCC(B)10104接種在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃ 220 r·min-1振蕩培養(yǎng)。白色念珠菌CMCC(F)98001接種在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃ 220 r·min-1振蕩培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)至第2代，把菌株培養(yǎng)到第3代后即復(fù)蘇完成。在培養(yǎng)第3代菌株時(shí)，先把第2代菌株的菌懸液稀釋后接種到固體平皿培養(yǎng)基上，以便于挑取單個(gè)菌落。黑曲霉CMCC(F)98003為產(chǎn)孢子繁殖的真菌，在沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第3代，即完成活化[1-3]。

1.2.2 光電比濁法

分別挑取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的單個(gè)菌落接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，挑取白色念珠菌的單個(gè)菌落接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中。按1.2.1節(jié)的條件培養(yǎng)以上菌種，在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定菌懸液在600 nm的吸光度D600，同時(shí)用0.9% NaCl稀釋菌懸液至適當(dāng)?shù)臐舛群?，按《中?guó)獸藥典》(2015年版)附錄1105平皿法計(jì)數(shù)并記錄數(shù)據(jù)。

黑曲霉菌產(chǎn)生豐富的孢子后，由于孢子呈黑色，吸光度過(guò)大，首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。查閱資料后，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中選取D600為1.0時(shí)的菌懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并記錄數(shù)據(jù)[1-2, 4]。

微生物計(jì)數(shù)儀誤差較大且應(yīng)用光電比濁計(jì)數(shù)法時(shí)應(yīng)格外注意比色器皿的透光度，平皿計(jì)數(shù)時(shí)統(tǒng)計(jì)3個(gè)平皿，取平均值。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌落形成數(shù)量對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉菌和白色念珠菌的生長(zhǎng)曲線[2-8]。

2 結(jié)果與分析

大腸埃希菌在接種后至1.5 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在1.5～4.5 h處于穩(wěn)定期，在此期間菌落的數(shù)量級(jí)為108mL-1(圖1中a)。金黃色葡萄球菌在接種后至1.0 h左右時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在1.0～5.5 h處于穩(wěn)定期，在此期間菌落的數(shù)量級(jí)為107mL-1，隨后細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)入衰退期(圖1中b)。銅綠假單胞菌在接種后至2.0 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在2.0～7.0 h處于穩(wěn)定期，在此期間菌落的數(shù)量級(jí)為108mL-1(圖1中c)。白色念珠菌在接種后至3.0 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在3.0～12.0 h處于穩(wěn)定期，在此期間菌落的數(shù)量級(jí)為107mL-1(圖1中d)。黑曲霉在接種后至24.0 h處于延遲期，在24.0～96.0 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在96.0～110.0 h處于穩(wěn)定期，在此期間菌落的數(shù)量級(jí)為108mL-1，隨后黑曲霉孢子生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)入衰退期(圖1中e)。

圖1 大腸埃希菌(a)、金黃色葡萄球菌(b)、銅綠假單胞菌(c)、白色念珠菌(d)和黑曲霉(e)的生長(zhǎng)曲線

綜上可知，標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌在《中國(guó)獸藥典》(2015年版)規(guī)定的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)測(cè)定時(shí)，4種菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)相近，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)速率最快，白色念珠菌的生長(zhǎng)速率最慢。從趨勢(shì)上來(lái)看，細(xì)菌的生長(zhǎng)速率高于真菌的生長(zhǎng)速率。實(shí)驗(yàn)中，對(duì)黑曲霉菌的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了二次驗(yàn)證，2次的結(jié)果十分相近，即D600為1.0時(shí)，數(shù)量級(jí)均為107mL-1，符合《中國(guó)獸藥典》(2015年版)供試品中接種量的要求，故在完成預(yù)實(shí)驗(yàn)后即可開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。此次實(shí)驗(yàn)中采用加大接種量的方式，來(lái)減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所需要的時(shí)間。對(duì)產(chǎn)生孢子或有色物質(zhì)的微生物采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定生長(zhǎng)曲線，例如對(duì)黑曲霉菌的測(cè)定。一般的菌種生長(zhǎng)曲線為“S”型，生長(zhǎng)初期與后期的菌株活力較弱，實(shí)驗(yàn)中選擇處于對(duì)數(shù)期即以指數(shù)倍增期的“種苗菌”為傳代菌源，所以接種開(kāi)始其生長(zhǎng)曲線即為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，沒(méi)有延遲期。

3 小結(jié)

參照《中國(guó)獸藥典》(2015年版)的方法，對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌種進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大腸埃希菌在1.5～4.5 h處于穩(wěn)定期，金黃色葡萄球菌在1.0～5.5 h處于穩(wěn)定期，銅綠假單胞菌在2.0～7.0 h處于穩(wěn)定期，白色念珠菌在3.0～12.0 h處于穩(wěn)定期，黑曲霉菌在96.0～110.0 h處于穩(wěn)定期。多種標(biāo)準(zhǔn)菌株穩(wěn)定期的測(cè)定完成，對(duì)相關(guān)微生物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行具有重要的參考意義，對(duì)食品工業(yè)、生物工程、衛(wèi)生醫(yī)藥和環(huán)境保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域具有參考和利用價(jià)值。