不同長(zhǎng)牡蠣群體對(duì)海水酸化的生理響應(yīng)差異分析

宋宏策, 姜秋云, 李玲玲, 戰(zhàn) 蕊, 魏 磊, 王曉通

(魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264025)

海水酸化是指由于吸收大氣中過量二氧化碳而導(dǎo)致海水逐漸變酸的現(xiàn)象, 隨之所產(chǎn)生的海水pH值下降、碳酸鹽體系失衡等海洋化學(xué)性質(zhì)變化可能會(huì)對(duì)海洋動(dòng)物的生存產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1]。中國(guó)海域遼闊、海岸線漫長(zhǎng), 且在部分海區(qū)已經(jīng)顯現(xiàn)出海水酸化進(jìn)程加快的趨勢(shì)[2]。長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)是中國(guó)主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類, 具有生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[3]。在自然的環(huán)境下, 野生長(zhǎng)牡蠣多出現(xiàn)在潮間帶海域, 附著在岸邊的巖石上, 由于潮汐的影響, 潮間帶生長(zhǎng)的長(zhǎng)牡蠣會(huì)時(shí)而暴露在空氣中, 時(shí)而浸沒在水下。相反, 在海灣的養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi), 長(zhǎng)牡蠣在水泥池中育苗, 投放在以尼龍繩穿線扇貝殼或牡蠣殼而成的附著基上, 懸掛在筏架上, 在海水中進(jìn)行垂下式養(yǎng)殖。因此, 養(yǎng)殖的長(zhǎng)牡蠣均在潮下帶生長(zhǎng), 其整個(gè)生活史都在水下完成。積年累月的生境差異, 可能對(duì)長(zhǎng)牡蠣產(chǎn)生生態(tài)多樣性的影響, 進(jìn)而可能在一定程度上改變了潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣的環(huán)境適應(yīng)能力, 并且與野生群體相比, 養(yǎng)殖群體由于近親繁殖或只在小范圍內(nèi)選擇親本, 可能會(huì)導(dǎo)致其遺傳變異性的降低[4,5]。

海洋酸化對(duì)海洋生物的主要生理過程均有可能產(chǎn)生負(fù)面影響, 且對(duì)于不同海洋生物類群的影響存在一定的種間差異, 即使同源性很高的物種, 或是同一物種的不同群體間也有可能表現(xiàn)出完全不同的響應(yīng)情況[6,7]。 經(jīng)海水酸化暴露后, 與野生悉尼巖牡蠣(Saccostrea glomerata)群體相比, 選育悉尼巖牡蠣群體的后代幼蟲體型更大且具有較快的發(fā)育速度, 選育養(yǎng)殖品種具有更好的耐受酸化能力, 這一發(fā)現(xiàn)表明不同生境的同一物種對(duì)海水酸化的敏感性也存在顯著差異[8]。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn), 悉尼巖牡蠣成體對(duì)海水酸化的響應(yīng)在野生和選育群體中有著明顯的差異變化[9]?？偟膩碚f, 海洋酸化對(duì)海洋軟體動(dòng)物的整個(gè)生活周期都可產(chǎn)生一定影響作用, 進(jìn)而嚴(yán)重影響海洋中的生物多樣性, 打破原有的海洋生態(tài)平衡, 最終導(dǎo)致海洋生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的改變[10]。

本研究以潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖的兩種長(zhǎng)牡蠣作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 在了解其對(duì)海水酸化響應(yīng)的基本代謝特征的基礎(chǔ)上, 整合兩種長(zhǎng)牡蠣的不同組織(鰓、外套膜及消化腺)在能量代謝及氧化應(yīng)激等生理指標(biāo)上的響應(yīng)差異情況, 綜合評(píng)價(jià)存在生境差異的兩種長(zhǎng)牡蠣對(duì)海水酸化的響應(yīng)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用長(zhǎng)牡蠣均為殼長(zhǎng)3 cm~5 cm左右的稚貝。潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣采集于煙臺(tái)市月亮灣海灘礁石, 潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣購(gòu)置于煙臺(tái)市芝罘島牡蠣養(yǎng)殖場(chǎng)。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)牡蠣進(jìn)行3周馴養(yǎng)后, 篩選兩種長(zhǎng)牡蠣各150只, 隨機(jī)分組進(jìn)行海水酸化暴露實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)置為: 潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖對(duì)照組, 潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖海水酸化處理組。向?qū)嶒?yàn)用海水中通氣進(jìn)行酸化條件的模擬暴露實(shí)驗(yàn)。海水酸化處理組通入CO2和空氣的混合氣體(pH約為7.6), 對(duì)照組通入周圍空氣(pH約為8.0)。暴露周期為21 d, 暴露處理過程中, 每天定時(shí)投喂微藻餌料, 并在進(jìn)食結(jié)束后更換預(yù)先通氣處理好的酸化海水, 在暴露過程中維持通氣狀態(tài)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中, 每天1次利用pH計(jì)、鹽度計(jì)等監(jiān)測(cè)海水化學(xué)參數(shù)(溫度、鹽度、pH、pCO2和總堿度等)的變化情況(表1)。

在海水酸化暴露結(jié)束前, 各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取樣兩種長(zhǎng)牡蠣, 分別開展標(biāo)準(zhǔn)代謝率(SMR)、耗氧率(OCR)及濾食率(IR)的測(cè)定, 每組3個(gè)重復(fù)。海水酸化暴露結(jié)束后, 解剖并切取長(zhǎng)牡蠣的鰓、外套膜及消化腺組織, 每組6個(gè)重復(fù)用于生理指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2 基礎(chǔ)代謝指標(biāo)的測(cè)定

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)代謝率(SMR)和耗氧率(OCR)

本實(shí)驗(yàn)參考已有實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定SMR和OCR指標(biāo)[11,12]。采用靜水密閉式呼吸實(shí)驗(yàn)方法, 實(shí)驗(yàn)前需將貝殼表面的附著生物處理干凈, 實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置1個(gè)呼吸瓶作為空白對(duì)照, 同時(shí)設(shè)置3個(gè)呼吸瓶作為實(shí)驗(yàn)組, 每個(gè)呼吸瓶體積為5 L, 實(shí)驗(yàn)組中每個(gè)呼吸瓶放12只長(zhǎng)牡蠣。測(cè)定之前, 為了避免攝食和環(huán)境變化對(duì)新陳代謝產(chǎn)生影響, 實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)牡蠣在測(cè)定之前禁食24 h, 并置于流水條件下適應(yīng)2 h。

實(shí)驗(yàn)中, 海水酸化處理組樣本繼續(xù)置于酸化海水中進(jìn)行檢測(cè), 而對(duì)照組則采用正常海水。在適應(yīng)及實(shí)驗(yàn)階段保持海水的流速一致, 采用虹吸的方法使PE水槽內(nèi)的使用水恒速, 實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2 h, 實(shí)驗(yàn)期間保持呼吸瓶?jī)?nèi)水溫恒定在15℃。

SMR計(jì)算如下:

其中, SMR為標(biāo)準(zhǔn)代謝率(μmolO2/(g?h)); ρ(DOt1)和ρ(DOt2)分別為放入實(shí)驗(yàn)組的呼吸瓶進(jìn)水口、出水口的DO質(zhì)量濃度(mg/L); ρ(DOc1)和ρ(DOc2)分別為空白瓶進(jìn)水口、出水口的DO質(zhì)量濃度(mg/L); ΔO2為呼吸瓶進(jìn)水口與出水口的溶氧差值(μmol/L); v為呼吸瓶進(jìn)水口流速(L/h)；M為長(zhǎng)牡蠣的軟體部干質(zhì)量(g); 0.8為長(zhǎng)牡蠣的異速生長(zhǎng)系數(shù)。

OCR計(jì)算如下:

其中, OCR為耗氧率(mg/(kg?h)); ρ(DOt1)和ρ(DOt2)分別為放入實(shí)驗(yàn)組的呼吸瓶進(jìn)水口、出水口的DO質(zhì)量濃度(mg/L); ρ(DOc1)和ρ(DOc2)分別為空白瓶進(jìn)水口、出水口的DO質(zhì)量濃度(mg/L); ΔO2為呼吸瓶進(jìn)水口與出水口的溶氧差值(μmol/L); v為呼吸瓶進(jìn)水口流速(L/h); M為長(zhǎng)牡蠣的軟體部干質(zhì)量(g)。

1.2.2 濾食率(IR)的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)參考已有實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定IR指標(biāo)[13]。實(shí)驗(yàn)采用靜水法, 微充氣, 實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置1個(gè)燒杯作為空白對(duì)照, 同時(shí)設(shè)置3個(gè)燒杯作為實(shí)驗(yàn)組, 每個(gè)燒杯體積為1 L, 實(shí)驗(yàn)組每組放1只長(zhǎng)牡蠣, 試驗(yàn)時(shí)間為2 h, 期間微量充氣, 分別測(cè)定試驗(yàn)前后水中餌料濃度。試驗(yàn)結(jié)束后, 解剖分離貝殼與軟體部, 將軟體部置于烘箱(70℃)中烘干至恒質(zhì)量, 用分析天平稱質(zhì)量。餌料濃度用血球計(jì)數(shù)板定量, 每個(gè)樣本均定量4次, 取其平均值, 并根據(jù)下式計(jì)算試驗(yàn)幼貝的濾食率。

其中, IR為單位體質(zhì)量的濾食率(cell/(g·h)); C0和Ct分別為試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)水中的餌料濃度(104個(gè)/mL); V為試驗(yàn)水體體積(L); M為長(zhǎng)牡蠣的軟體部干質(zhì)量(g); t為試驗(yàn)時(shí)間(h); Sd為空白組餌料變化系數(shù)。

1.3 能量代謝、氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定

各實(shí)驗(yàn)組稱取0.1 g長(zhǎng)牡蠣(鰓、外套膜及消化腺)組織樣本, 加入4℃預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH=7.4, 0.01 mol/L TRIS, 0.0001 mol/L EDTA-2Na, 0.01 mol/L蔗糖, 0.8% NaCl), 制備成10 %的組織勻漿溶液。將組織勻漿溶液4 000 rpm, 4℃離心10 min, 取勻漿上清, 用于相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。采用南京建成生物工程研究所商業(yè)化試劑盒測(cè)定能量代謝指標(biāo)包括: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT, C009-1-1)、琥珀酸脫氫酶(SDH, A022-1-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST, C010-1-1)、ATP酶(ATPase, A070-1-2)、乳酸脫氫酶(LDH, A020-2-2)、ATP含量(A095-1-1)。氧化應(yīng)激指標(biāo)包括: 過氧化氫酶(CAT, A007-1-1)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST, A004-1-1)、丙二醛(MDA, A003-1-1)、總超氧化物歧化酶(SOD, A001-1-2)。長(zhǎng)牡蠣組織樣本的總蛋白含量通過BCA法測(cè)定(A045-3-2)。

利用南京建成生物工程研究所商業(yè)化試劑盒檢測(cè)與能量?jī)?chǔ)存有關(guān)的糖原含量(A043-1-1), 稱取50 mg的長(zhǎng)牡蠣(鰓、外套膜及消化腺)組織樣本, 濃硫酸脫水生成糖醛衍生物后, 通過蒽酮比色法, 檢測(cè)各樣本中的糖原含量。每個(gè)指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定6次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 海水酸化對(duì)基礎(chǔ)代謝指標(biāo)的影響

在21 d海水酸化暴露后, 相較于對(duì)照組, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣的基礎(chǔ)代謝指標(biāo)極顯著下調(diào)(P<0.01), SMR下調(diào)62.44%, OCR下調(diào)68.97%, IR下調(diào)82.20%。相較于對(duì)照組, 潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣僅IR影響顯著(P<0.05), 下調(diào)58.82%。而SMR和OCR在海水酸化暴露后均未顯著變化(P>0.05, 表2)。上述結(jié)果顯示, 海水酸化暴露對(duì)長(zhǎng)牡蠣的基礎(chǔ)代謝過程產(chǎn)生了一定影響, 且潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣基礎(chǔ)代謝活動(dòng)的響應(yīng)程度更加劇烈。

表2 海水酸化對(duì)長(zhǎng)牡蠣基礎(chǔ)代謝指標(biāo)影響 Tab. 2 Effects of seawater acidification on basal metabolic indexes of C. gigas

2.2 海水酸化對(duì)長(zhǎng)牡蠣不同組織中能量代謝及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

表3 海水酸化對(duì)潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣不同組織能量代謝、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Tab. Effects o f seawater acidification on energy metabolis m and oxidative stress indexes of intertidal wild-type and subtidal selectively bred C. gigas

如表3所示, 在海水酸化暴露后, 與對(duì)照組相比, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣鰓組織的ALT、AST、GST和SOD成顯著上調(diào)(P<0.05), 而總ATPase、ATP含量、糖原及CAT則出現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.05)。與潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣鰓組織在海水酸化暴露后相比, 潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣鰓組織中總ATPase、糖原和CAT呈現(xiàn)相反的顯著上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05), 而MDA和SOD則出現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.05)。

在海水酸化暴露后, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣外套膜組織的總ATPase、LDH、ATP含量和MDA顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣外套膜中, SDH、GST、MDA顯著高于對(duì)照組(P<0.05), 糖原則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

在海水酸化暴露后, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣消化腺組織的ALT、總ATPase、ATP含量和SOD顯著上調(diào)(P<0.05), 而在潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣消化腺組織中, 僅SOD顯著高于對(duì)照組(P<0.05), MDA顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

上述結(jié)果顯示, 在海水酸化暴露后, 長(zhǎng)牡蠣不同組織中的能量代謝及氧化應(yīng)激過程存在差異響應(yīng)變化, 且相關(guān)生理指標(biāo)的變化趨勢(shì)在潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖兩種長(zhǎng)牡蠣中亦存在差異性。

2.3 PCA分析潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣對(duì)海水酸化的響應(yīng)差異

分別對(duì)海水酸化暴露條件下潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣的指標(biāo)響應(yīng)變化進(jìn)行PCA分析, 探究海水酸化對(duì)兩種長(zhǎng)牡蠣各指標(biāo)的影響差異情況, 同時(shí)對(duì)所有長(zhǎng)牡蠣(總體)進(jìn)行PCA分析, 在長(zhǎng)牡蠣總體范圍內(nèi)評(píng)價(jià)潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣對(duì)海水酸化的綜合響應(yīng)差異。首先對(duì)各個(gè)指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。再提取主成分, 分別提取潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣、潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣以及長(zhǎng)牡蠣總體數(shù)據(jù)的前4、5及6個(gè)主成分, 其累積方差貢獻(xiàn)率分別為85.397%、87.611%及87.379%, 說明在變量不丟失的前提下, 提取的主成分能夠較為全面地概括數(shù)據(jù)信息。然后, 通過提取到的主成分計(jì)算潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣及長(zhǎng)牡蠣總體的各指標(biāo)權(quán)重。通過單獨(dú)群體下各指標(biāo)的權(quán)重來分析潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣各指標(biāo)的影響程度。最后, 通過總體群體下的各指標(biāo)的權(quán)重來計(jì)算此兩種長(zhǎng)牡蠣的綜合得分, 綜合得分可以反映出兩種長(zhǎng)牡蠣在海水酸化脅迫下的綜合響應(yīng)程度。

由表4可知, 海水酸化對(duì)潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣各個(gè)指標(biāo)的影響程度不同。在潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣中, 各指標(biāo)的影響權(quán)重從大到小排序?yàn)? 糖原、LDH、MDA、ATPase、GST、SOD、ALT、ATP、CAT、AST及SDH, 而潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣中各指標(biāo)的影響權(quán)重從大到小排序?yàn)? ATP、SDH、ATPase、糖原、MDA、AST、CAT、GST、SOD、LDH及ALT。由上述影響權(quán)重可知, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)權(quán)重相對(duì)較大, 潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣的能量代謝相關(guān)指標(biāo)權(quán)重相對(duì)較大, 這表明, 海水酸化暴露條件下, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣的氧化應(yīng)激相關(guān)生理過程受影響程度大于潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣, 而潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣的能量代謝相關(guān)生理過程受影響程度則大于潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣。

表4 潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣及總體的各指標(biāo)權(quán)重 Tab.4 The weights of intertidal wild-type and subtidal selectively bred and all of C. gigas

利用長(zhǎng)牡蠣總體各指標(biāo)權(quán)重計(jì)算潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣綜合得分, 得分越高, 表明越容易受到海水酸化暴露的影響。潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣得分分別為0.38和0.12。上述結(jié)果顯示, 海水酸化暴露對(duì)這兩種不同生境背景的長(zhǎng)牡蠣造成了不同程度上的生理響應(yīng)差異; 在海水酸化暴露條件下, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣可能比潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣受到了更大的影響。

2.4 PLS-DA分析潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣各組織對(duì)海水酸化的響應(yīng)差異

對(duì)所有海水酸化處理組及對(duì)照組構(gòu)建模型分析, PLS-DA得分圖參數(shù)顯示R2X=0.593, R2Y=0.835和Q2=0.804, 表明所建模型有效。如圖1所示, 潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣不同的組織樣本(鰓、外套膜及消化腺)在海水酸化暴露后可完全分開, 這說明長(zhǎng)牡蠣能量代謝及氧化應(yīng)激等生理指標(biāo)變化可能存在組織間的差異。按照PLS-DA結(jié)果列出變量重要性值(VIP), VIP值越大, 說明對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)越大。本研究中, 差異較大(VIP值>1)的指標(biāo)為: SDH、AST、ATPase、ATP含量、糖原、CAT、GST及SOD, 且上述指標(biāo)在能量代謝、氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用, 說明潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣的鰓、外套膜及消化腺組織可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝、氧化應(yīng)激過程抵抗海水酸化脅迫, 且潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣不同組織應(yīng)對(duì)海水酸化的調(diào)節(jié)機(jī)制可能存在差異。

對(duì)潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣不同組織及其對(duì)照組進(jìn)行PLS-DA分析, 如圖2所示, 在海水酸化后, 潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣的鰓、外套膜及消化腺組織與對(duì)照組樣本明顯分離, 說明海水酸化對(duì)潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣體內(nèi)不同組織的能量代謝、氧化應(yīng)激等相關(guān)生理過程造成影響。相較于鰓、消化腺組織, 海水酸化暴露后潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣的外套膜組織樣本與對(duì)照組樣本分布相距更遠(yuǎn), 說明海水酸化暴露對(duì)潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣外套膜組織能量代謝及氧化應(yīng)激生理過程影響更為明顯。與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣各個(gè)組織相比, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣的鰓、外套膜及消化腺組織的酸化處理樣本與 對(duì)照樣本分離更明顯, 且分別位于圖的不同象限。相較于潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣各個(gè)組織的樣本分布更為分散。上述分析結(jié)果表明, 長(zhǎng)牡蠣不同組織對(duì)海水酸化存在差異響應(yīng), 且相比于鰓及消化腺, 外套膜組織受影響最大。

圖1 長(zhǎng)牡蠣總體PLS-DA圖 Fig. 1 PLS-DA diagram of all C. gigas

圖2 潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣不同組織的PLS-DA圖 Fig.2 PLS-DA diagrams of different tissues in intertidal wild-type and subtidal selectively bred C. gigas

藍(lán)色三角為對(duì)照組, 綠色圓點(diǎn)為海水酸化暴露組; I-C. 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣對(duì)照組; I-O. 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣酸化組; S-C. 潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣對(duì)照組; S-O. 潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣酸化組; G. 鰓組織; M. 外套膜組織; D. 消化腺組織

The blue triangle is the control group, the green dot is the seawater acidification exposure group; I-C. the control group of intertidal wild-type C. gigas; I-O. the seawater acidification group of intertidal wild-type C. gigas; S-C. the control group of selectively bred C. gigas; S-O. the seawater acidification group of selectively bred C. gigas. G. the gill tissue; M. the mantle tissue; D. the digestive gland tissue

3 討論

已有研究顯示, 軟體動(dòng)物可通過調(diào)控自身的基礎(chǔ)代謝活動(dòng), 如降低攝食率等, 來應(yīng)對(duì)外界的環(huán)境變化[14-16]。本研究中, 海水酸化暴露對(duì)潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣基礎(chǔ)代謝活動(dòng)(SMR、OCR、IR)均產(chǎn)生了一定程度的影響。相較于潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣基礎(chǔ)代謝活動(dòng)的響應(yīng)程度更加劇烈, 且多種生理指標(biāo)出現(xiàn)了更為積極地應(yīng)對(duì)調(diào)整, 可能表明其對(duì)海水酸化具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。

生理指標(biāo)的檢測(cè)顯示, 僅ATPase及MDA在潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣對(duì)照組的比較中均未出現(xiàn)顯著差異, 而其他指標(biāo)在兩種長(zhǎng)牡蠣間均有差異變化的表現(xiàn)。而海水酸化暴露后, 各種生理指標(biāo)亦出現(xiàn)了不同的變化響應(yīng)。說明相同物種的不同群體受不同生存環(huán)境影響出現(xiàn)不同的生理響應(yīng)變化, 且在應(yīng)對(duì)海水酸化暴露時(shí), 亦可通過不同的方式調(diào)整體內(nèi)生理過程, 以應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的威脅。本實(shí)驗(yàn)中的海水酸化暴露過程均是將長(zhǎng)牡蠣浸沒在水下開展的, 因此, 暴露方法本身可能對(duì)潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣就是一種較大的干擾, 另外, 實(shí)驗(yàn)材料因?yàn)閬碜杂诓煌L(zhǎng)牡蠣群體, 存在其群體遺傳背景不同產(chǎn)生系統(tǒng)誤差而非生存環(huán)境造成差異的可能性, 從而導(dǎo)致兩種長(zhǎng)牡蠣對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組在生理指標(biāo)上出現(xiàn)了較大的差異變化。

生物機(jī)體生命活動(dòng)的正常進(jìn)行需要能量來維持, ATP是主要的供能物質(zhì), 糖原是能量?jī)?chǔ)備物質(zhì)[17,18], 而ALT、SDH、AST、ATPase、LDH則是能量代謝過程中的關(guān)鍵酶類。在潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣中, 海水酸化暴露對(duì)ATPase、LDH、糖原影響較大, 表明ATPase水解ATP釋放能量、LDH參與的糖酵解和TCA循環(huán)及糖原分解供能等能量代謝過程受海水酸化的影響較大[19-21]。而潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣中, SDH、ATPase、ATP、糖原受影響較大, 這可能是在海水酸化暴露條件下, 潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣可通過調(diào)節(jié)機(jī)體ATP的濃度, 來保證自身能量供給以抵抗外界海水酸化, 同時(shí)SDH、ATPase參與TCA循環(huán), 分解糖原, 調(diào)控能量代謝以應(yīng)對(duì)海水酸化的脅迫作用[22-26]。

環(huán)境脅迫可使水生動(dòng)物產(chǎn)生大量的氧自由基, 機(jī)體組織中活性氧的增多可誘導(dǎo)抗氧化劑和抗氧化酶體系的反應(yīng)[27]。氧自由基攻擊生物膜可產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物—MDA[28], 最終造成生物膜的損傷、滲漏, 甚至細(xì)胞的死亡。GST是體內(nèi)清除自由基的重要酶, 具有清除過氧化物及解毒雙重功能[29]。潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣的MDA及GST均受到海水酸化暴露的較大影響, 表明海水酸化暴露可造成長(zhǎng)牡蠣體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化, 同時(shí)長(zhǎng)牡蠣利用GST清除體內(nèi)過氧化物, 防止機(jī)體損傷。當(dāng)生物受到外界脅迫后, SOD和CAT可被激活, 清除自由基, 保護(hù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[30]。在海水酸化暴露后, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣中SOD受影響程度較大, 而潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣CAT受影響較大, 表明長(zhǎng)牡蠣抗氧化酶系統(tǒng)在應(yīng)對(duì)海水酸化暴露的過程中扮演重要角色。

在海水酸化暴露后, 潮間帶野生與潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣在基礎(chǔ)代謝及關(guān)鍵生理過程(能量代謝及氧化應(yīng)激)上存在差異響應(yīng)情況。通過PCA分析兩種不同生境背景的長(zhǎng)牡蠣對(duì)海水酸化的響應(yīng)差異, 表明相比于潮下帶養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣, 潮間帶野生長(zhǎng)牡蠣可能對(duì)海水酸化暴露的生理響應(yīng)更為劇烈。通過PLS-DA分析長(zhǎng)牡蠣的不同組織對(duì)海水酸化的響應(yīng)差異, 結(jié)果表明不同組織應(yīng)對(duì)海水酸化的調(diào)節(jié)機(jī)制可能存在差異。相比于長(zhǎng)牡蠣的鰓及消化腺組織, 外套膜組織受海水酸化的影響更大。