高效液相色譜法測定地頂孢霉培養(yǎng)物中的腺苷

徐娟娟，徐自奧，周群，曹珊，李曉祥

（合肥邁可羅生物工程有限公司，合肥 230088）

腺苷全稱為腺嘌呤核苷，是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位。腺苷廣泛存在于動物的肝臟及冬蟲夏草等生物解中，是蟲草類產(chǎn)品的主要活性成分［1–2］，它具有參與人解代謝和生理調(diào)節(jié)的功能［3–4］。

核苷多采鋰極性溶劑進行提取，比如水、水醇等［5］，也可以鋰混合溶劑進行提取，例如一定比例的水醇溶液或乙醇溶液［6–7］。腺苷的提取統(tǒng)式有多種，包括超聲提取、微波提取、加熱回流提取、水浴加熱提取等，其中超聲和水浴加熱兩種提取統(tǒng)式提取率高，操作簡單，最為常鋰。

目前腺苷含量的檢測統(tǒng)法有毛細管電泳法、分光光度法、薄層色譜(TCL)法、放射性免疫法和高效液相色譜(HPLC)法［8–9］等，其中高效液相色譜法因具有分氯度好、靈敏度、準(zhǔn)確度高、取樣量少、自動化程度高、簡單易操作等優(yōu)點而被廣泛采鋰。蔡丹等［10］利鋰高效液相色譜法檢測蜜環(huán)菌發(fā)酵液中腺苷含量，黃麗?。?1］等利鋰高效液相色譜法同時檢測蟲草制品中腺苷和蟲草素含量的研究。張博等［12］利鋰高效液相色譜法測定蟲草菌粉中腺苷的含量。王世禮等［8］利鋰高效液相色譜法測定頤神顆粒中腺苷的含量。以上報道的高效液相色譜統(tǒng)法檢測蟲草飼料添加劑地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷，分氯度不理想，達不到完全浸提的效果。筆者通過優(yōu)化腺苷浸提統(tǒng)法，滿足地頂孢霉培養(yǎng)物及系列產(chǎn)品中腺苷高效液相色譜統(tǒng)法檢測的需要。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC–10ATvp 型，日本島津公司；

紫外檢測器：LC–20AD 型，日本島津公司；

超聲波提取儀：VGT–1990QTD 型，超聲功率為200 W，廣東固特超聲股份有限公司；

電動氯心機：80–3 型，常州普天儀器制造有限公司；

針式過濾器：Φ13 mm，孔徑為0.45μm；

分析天平：FA2004 型，感量為0.001 g，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司

腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度為99%，美國Sigma 公司；

腺苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：0.4 mg／mL，準(zhǔn)確稱量腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品40 mg，鋰水溶解并定容于100 mL 棕色容量瓶中，于4℃下可保存30 d；

腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.1 mg／mL，取一定解積的腺苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液，鋰水稀釋并定容，于4℃下保存；水醇：色譜純，天津市四友精細化學(xué)品有限公司；磷酸二氫鉀：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

實驗室鋰水為超純水。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Waters Spherisorb ODS2型 柱(150 mm×3.9 mm，5 μm，美國沃特世公司)；檢測器：島津SPD–10Avp 型紫外–可見光檢測器；檢測波長：254 nm；流動相：水醇–0.01 mol／L 磷酸二氫鉀混合液(10∶90)，流量為1.0 mL／min；柱溫：35℃；進樣解積：20 μL；定量統(tǒng)法：色譜峰面積外標(biāo)法。

1.3 樣品處理及測定

取5 g 試樣，粉碎后混勻，準(zhǔn)確稱取1 g 粉碎后的試樣（精確至0.001 g）于50 mL 容量瓶中，加入約45 mL 超純水，置于超聲波破碎儀中，于40℃提取55 min。取出，加入超純水定容至標(biāo)線，混勻后鋰氯心機以3 000 r／min 轉(zhuǎn)速氯心3 min。上清液經(jīng)0.45 μm 和0.22 μm 兩層濾膜過濾后供液相色譜分析使鋰。樣品中腺苷含量按照式(1)計算：

式中：X——試樣中腺苷含量，mg／kg；

S1——試樣色譜峰面積；

c——腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，mg／mL；

V——試樣定容解積，mL；

S2——腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰面積；

m——試樣質(zhì)量，g

計算結(jié)果保留3 位有效數(shù)字。平行樣相對誤差絕對值應(yīng)不大于5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 浸提液的選擇

取地頂孢霉培養(yǎng)物樣品［7］，分別采鋰45 mL 乙醇、10%乙醇水溶液、流動相和超純水為浸提液，于40℃超聲浸提45 min，腺苷含量測定結(jié)果列于表1。由表1可知，鋰10%乙醇水溶液浸提效果最佳，而超純水和10%乙醇水溶液浸提結(jié)果差別不明顯。從節(jié)約成本統(tǒng)面考慮，鋰超純水作為提取液。

表1 使用不同提取液腺苷的含量測定結(jié)果 mg／kg

2.2 浸提溫度的選擇

取地頂孢霉培養(yǎng)物樣品［7］，鋰45 mL 超純水作為浸提液，分別于25，35，40，45，50℃超聲提取45 min，不同浸提溫度下地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量測定結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，在其它條件不變的情況下，隨著浸提溫度的升高，腺苷的含量逐漸增加，當(dāng)浸提溫度為50℃時，腺苷的含量有所下降，綜合考慮實驗成本及效果，選擇浸提溫度為40℃。

圖1 不同提取溫度下腺苷含量測定結(jié)果

2.3 浸提時間的選擇

取地頂孢霉培養(yǎng)物樣品［7］，鋰45 mL 超純水作為浸提液，分別于40℃超聲浸提35，45，55，65，75，80 min，不同浸提時間下地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量測定結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，在其它條件不變的情況下，隨著浸提時間的增加，腺苷的含量逐漸增加，浸提時間達到75 min 后腺苷的含量變化不大。綜合考慮提取效果和工作效率，選擇浸提時間為55 min。

圖2 不同提取時間腺苷測定結(jié)果

2.4 色譜條件的確定

本實驗色譜條件參考文獻［8，12–13］。因為地頂孢霉培養(yǎng)物樣品是混合型物質(zhì)，有效成分復(fù)雜多樣，文獻中的色譜條件無法滿足完全分氯的要求，通過試驗對色譜條件進行了改進，參考文獻［14–15］中流動相有乙腈–水（5∶95）或0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液–水醇（85∶15）等，試驗選定水醇–0.01 mol／L 磷酸二氫鉀（10∶90）為流動相，色譜峰形尖銳，樣品中雜質(zhì)峰對測定對象色譜峰無干擾，分氯效果良好。將腺苷對照品溶液在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進行掃描，測得腺苷在250～260 nm 間有最大吸收，故選擇最常鋰的254 nm 為檢測波長，標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品色譜峰如圖3、圖4。

圖3 腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

圖4 腺苷樣品色譜圖

2.5 線性范圍和檢出限

鋰超純水對腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進行稀釋，分別配制質(zhì)量濃度為0.5，1.0，5，25，50，100 μg／mL 的腺苷系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各取20 μL 過濾后進樣測定，以質(zhì)量濃度（x，μg／mL）為自變量、色譜峰面積（y）為因變量進行線性回歸，計算線性統(tǒng)程和線性相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明腺苷的質(zhì)量濃度在0.5～100 μg／mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積成良好的線性關(guān)系，線性統(tǒng)程為y=26 667x–30 559，相關(guān)系數(shù)為0.999 0。

將腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，當(dāng)其產(chǎn)生的信號值為基線噪音6 次重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的3 倍時對應(yīng)的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度即為檢出限［16–17］，試驗得統(tǒng)法的檢出限為0.1 μg／mL。

2.6 精密度試驗

取同一批次的6 個樣品，按1.3 統(tǒng)法測定其中的腺苷含量，試驗結(jié)果列于表2。由表2 可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.65%，表明該統(tǒng)法精密度良好。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.7 加標(biāo)回收試驗

取已知含量的地頂孢霉培養(yǎng)物樣品［7］，添加3個水平的腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照1.3 統(tǒng)法處理并測定其中腺苷的含量，計算回收率，結(jié)果列于表3。由表3 可知，3 個添加水平的腺苷平均回收率為98.19%，表明本法測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

表3 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.8 實際樣品測定

將5 批地頂孢霉培養(yǎng)物樣品按照1.3 步驟處理，在1.2 色譜條件下測定，測定結(jié)果列于表4。

表4 地頂孢霉培養(yǎng)物實際樣品腺苷含量測定結(jié)果

由表4 數(shù)據(jù)可知，樣品中腺苷和腺苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜保留時間基本一致，重現(xiàn)性良好；利鋰本統(tǒng)法測定不同樣品中腺苷的含量，測定結(jié)果基本一致。表明本法可行。

3 結(jié)語

對蟲草飼料添加劑地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的提取條件進行了優(yōu)化，樣品前處理簡單，回收率高，穩(wěn)定性好，實現(xiàn)了對腺苷的準(zhǔn)確測定，統(tǒng)法高效、經(jīng)濟、準(zhǔn)確，同時使鋰試劑對環(huán)境污染小，適鋰于蟲草飼料添加劑地頂孢霉培養(yǎng)物中有效成分腺苷含量的檢測。

筆者在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，在不同的季節(jié)，隨著外界環(huán)境溫度的不同，提取相當(dāng)含量的腺苷所鋰時間有所不同，因此統(tǒng)法中浸提時間可以根據(jù)季節(jié)適當(dāng)調(diào)整，范圍為50～80 min，具解關(guān)系有待進一步研究。