基于內(nèi)源乳化法和噴霧干燥優(yōu)化制備 花色苷微膠囊及其穩(wěn)定性分析

毛 瑩，帥曉艷，王惠玲，周 蘭，李 佳，李 漫，楊 寧，何靜仁,2,

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點實驗室，湖北 武漢 430023）

花色苷是一類水溶性天然著色劑，具有一定的抗氧化、抗炎癥等多種生物活性[1]，在食品等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力[2]，但易受溫度、光照等因影響導(dǎo)致其穩(wěn)定性較差，因采用膠囊化技術(shù)提高花色苷的穩(wěn)定性，擴展適用范圍[3]。目前花色苷的微膠囊化常用方法有噴霧干燥法、脂質(zhì)體法和凝聚法等，其中噴霧干燥在食品工業(yè)中是最常用的封裝技術(shù)。噴霧干燥過程中，溶劑快速蒸發(fā)，活性成分瞬間被保留[4]從而形成非晶態(tài)的固體分散體[5]，法工藝簡單、成本較低，適用于對溫度敏感的活性物質(zhì)[6]。噴霧干燥法已被證實能有效保護多酚化合物[7]，但其高溫條件在一定程度上可能會降解熱敏性的花色苷。

內(nèi)源乳化法是近年來興起的新型海藻酸鹽微膠囊制備方法，是將海藻酸鈉溶液、水不溶性鈣鹽及包埋物共混后分散到油相中形成W/O型乳化液，加入酸引發(fā)鈣鹽中Ca2的解離，促使Ca2在乳液液滴內(nèi)部與海藻酸鈉作用生成海藻酸鈣凝膠珠。內(nèi)源乳化法采用無毒試劑，因而可應(yīng)用于生物、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中包埋生物 活性物質(zhì)[8-9]。

本實驗以葡萄皮提取物中的花色苷為芯材，以海藻酸鈉為壁材[10]，采用內(nèi)源乳化法制備濕態(tài)花色苷微膠囊，再考察噴霧干燥工藝對微膠囊化濕態(tài)花色苷的影響，比較分析花色苷微膠囊化前后對其光照、溫度、腸消化穩(wěn)定性的影響，旨在為提高花色苷類功能性食品的穩(wěn)定性研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

YC-3000噴霧干燥機 上海雅程儀器設(shè)備有限 公司；Evolution220紫外-可見分光光度計 美國Thermo Fisher公司；MS3000LVAeros激光粒度儀 上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司武漢分公司；CM-24圓形水浴氮吹儀 瑞士萬通中國有限公司；S-3000N掃描式電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本 日立公司；XD30倒置顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司； UV-4802紫外全掃描分光光度計 武漢利天科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄皮花色苷的制備及含量測定[11-12]

式中：A為pH 1.0、4.5時花色苷在λmax波長處的吸光度差值；V為提取液總體積；n為稀釋倍數(shù)；M為cy-3-glu的摩爾質(zhì)量（449.4 g/mol）；ε為cy-3-glu的消光系數(shù)（26 900 L/（molg cm））；m為花色苷純化物質(zhì)量。

根據(jù)pH 示差法測得的葡萄皮花色苷含量為 102.99 g/mg。

1.3.2 花色苷微膠囊的制備

根據(jù)內(nèi)源乳化法的原理，以海藻酸鈉為壁材[13-15]：海藻酸鈉、碳酸鈣溶于20 mL水中，溶脹1～2 h后與10 mL花色苷溶液充分混勻待用；Span80與大豆油按一定比例混勻后加入制備好的水相，磁力攪拌進行乳化得到W/O乳濁液，再加20 mL含有乙酸的大豆油（降低體系pH值），最后加入200 mL含有NaCl的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），靜置1～2 h，采用分液漏斗分離油水相得到濕態(tài)花色苷微膠囊，在一定條件下噴霧 干燥[16-17]制備花色苷微膠囊。

通過Plackett-Burman試驗設(shè)計、最陡爬坡試驗及Box-Behnken設(shè)計試驗得出內(nèi)源乳化法制備花色苷微膠囊的最佳工藝條件為：海藻酸鈉與CaCO3質(zhì)量比為3∶1，壁材與芯材質(zhì)量比為15∶1，酸鈣質(zhì)量比為3∶1，NaCl質(zhì)量濃度為900 mg/mL。經(jīng)驗證，該條件下的微膠囊包埋率為75.12%，平均粒徑為120 μm。

式中：A1為包埋前花色苷的吸光度；A2為包埋后花色苷的吸光度。

1.3.4 微膠囊形態(tài)觀察及粒徑的測定

馬爾文激光粒度儀測定花色苷微膠囊的平均粒徑和粒徑分布：取少量干燥的花色苷微膠囊用純水溶解，按一定比例稀釋，用激光粒度儀測定花色苷微膠囊的平均粒徑和粒徑分布。

稱取一定質(zhì)量的花色苷微膠囊溶于無水乙醇，采用超聲波振蕩破碎釋放花色苷，微孔濾膜過濾后在300～800 nm波長范圍內(nèi)進行紫外全掃描，對照組僅將花色苷微膠囊溶解在無水乙醇中后進行紫外全掃描。

1.3.6 花色苷微膠囊的光照穩(wěn)定性

實驗組：微膠囊預(yù)先采用1% DMSO充分溶解，再以pH 2.0檸檬酸-磷酸氫鈉緩沖液為溶劑配制0.05 mg/mL的花色苷溶液。

將兩組溶液密封靜置于50 W日光燈下考察0、1、2、3、4、5 h花色苷的光照穩(wěn)定性。采用紫外分光光度計測定吸光度，由下式計品花色苷保存率：

1.3.3 包埋率的測定

對花色苷微膠囊和花色苷光降解動力學(xué)分析，符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程：

式中：C0為花色苷溶液初始吸光度；Ct為受光照t小時后的溶液吸光度；t1/2為花色苷受光降解半衰期；k為降解反應(yīng)速率常數(shù)/h1。

1.3.7 花色苷微膠囊的熱穩(wěn)定性

實驗組：微膠囊預(yù)先采用1% DMSO充分溶解，再以pH 2.0檸檬酸-磷酸氫鈉緩沖液為溶劑配制0.05 mg/mL的花色苷溶液。

將兩組溶液密封置于試管架，于50、60、70、80、90 ℃條件下避光水浴，每半小時取測定其在2.5 h內(nèi)吸光度變化。按式（4）計花色苷保存率；對花色苷微膠囊和花色苷光降解動力學(xué)分析，符合一級反應(yīng)動力學(xué)方 程（5），并按方程（6）計花色苷溫度降解半衰期。

1.3.8.2 人工模擬腸消化

取0.3 1 3 g 胰蛋白酶和1.8 8 g 豬膽鹽混合溶于50 mL 0.1 mol/L NaHCO3緩沖液，配制成模擬腸溶液。將經(jīng)過2 h消化品于4 ℃放置2 h，于3 000 r/min離心15 min去除蛋白酶，取上清液加入2 mL胰蛋白酶和豬膽鹽混合溶液，用0.1 mol/L NaHCO3緩沖溶液調(diào)至pH 6.8，置于37 ℃水浴振蕩，轉(zhuǎn)速為100 r/min，測定0、0.5、1、1.5、2 h模擬腸液中品吸光度的變化。在反應(yīng)期間，密封避光保存防止花色苷降解。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS 19和Origin 85進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴霧干燥單因試驗結(jié)果

2.1.1 加熱器溫度對花色苷微膠囊粒徑及包埋率的影響

低溫噴霧干燥參數(shù)設(shè)置中，在進料速率12 r/min、真空壓力0.03 MPa的條件下，加熱器溫度對花色苷微膠囊平均粒徑及包埋率的影響結(jié)果見圖1。

圖 1 加熱器溫度對花色苷微膠囊平均粒徑及包埋率的影響Fig. 1 Effect of heater temperatures on average particle size and microencapsulation rate

由圖1可知，花色苷微膠囊平均粒徑隨溫度的升高而先減后增，包埋率呈下降趨勢，包埋率隨溫度變化波動較小則主要考慮粒徑變化。加熱器溫度為120 ℃時微膠囊平均粒徑達到最小值552.3 nm，包埋率為75.4%，時進出料口溫度分別為70.2、64.8 ℃，后平均粒徑隨加熱器溫度的上升而增大，可能是加熱器溫度過低時進出料口溫度過低，微膠囊化時間長，溶劑蒸發(fā)速度慢，流動性差，且易回潮，導(dǎo)致微膠囊顆粒聚集大小不均一，粒徑分布較為廣泛，加熱器溫度過高時溶劑蒸發(fā)速度太快，囊壁破碎從而影響花色苷微膠囊的穩(wěn)定性及生物活性[19]。因確定噴霧干燥法制備花色苷微膠囊的最佳加熱器溫度為120 ℃。

2.1.2 進料速率對花色苷微膠囊粒徑及包埋率的影響

低溫噴霧干燥參數(shù)設(shè)置中，在真空壓力0.03 MPa、加熱器溫度120 ℃的條件下，進料速率對花色苷微膠囊平均粒徑及包埋率的影響結(jié)果見圖2。

圖 2 進料速率對花色苷微膠囊平均粒徑及包埋率的影響Fig. 2 Effects of feeding rate on average particle size and microencapsulation rate

由圖2可知，花色苷微膠囊的平均粒徑隨進料速率的增加而先減后增，包埋率呈下降趨勢，綜合粒徑和包埋率的變化趨勢及波動性，選擇主要參考平均粒徑。進料速率達到12 r/min時，平均粒徑達到最小值571.5 nm，包埋率為77.3%，之后平均粒徑隨著進料速率的增加而增大，可能是在噴霧干燥過程中，進料速率過快，品流量過大，較多品進入霧化器降低品與熱空氣的傳熱傳質(zhì)效率[20]，品未能充分干燥導(dǎo)致微膠囊顆粒發(fā)生聚集，從而影響花色苷微膠囊的粒徑大小。因確定噴霧干燥法制備花色苷微膠囊的最佳進料速率為12 r/min。

2.1.3 真空壓力對花色苷微膠囊粒徑及包埋率的影響

低溫噴霧干燥參數(shù)設(shè)置中，在加熱器溫度120 ℃、進料速率12 r/min的條件下，真空壓力對花色苷微膠囊平均粒徑及包埋率的影響見圖3。

圖 3 真空壓力對花色苷微膠囊平均粒徑及包埋率的影響Fig. 3 Effects of vacuum pressure on average particle size and microencapsulation rate

由圖3可知，花色苷微膠囊的平均粒徑及包埋率均隨真空壓力的增加而先減后增，綜合粒徑和包埋率的變化趨勢及波動性，選擇主要參考平均粒徑。在0.03 MPa時，其平均粒徑僅為560.1 nm，包埋率為74.3%，之后平均粒徑隨真空壓力的升高而變大，可能是較小真空壓力影響溶劑蒸發(fā)速度及顆粒成型速度，進出料口間隔距離較短，品未能及時干燥成型；真空壓力太大則超出囊壁承壓范圍致使囊壁破碎，芯材流出。因確定噴霧干燥法制備花色苷微膠囊的最佳真空壓力為0.03 MPa。

2.2 噴霧干燥正交試驗結(jié)果

表 1 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and results

2.3 花色苷微膠囊的形態(tài)及粒徑大小

2.3.1 花色苷微膠囊的形態(tài)

圖 4 花色苷微膠囊SEM圖Fig. 4 SEM image of anthocyanin microcapsules

由圖4可知，噴霧干燥的花色苷微膠囊分布均勻、顆粒完整，呈現(xiàn)圓形外部結(jié)構(gòu)并且有不同尺寸的附聚物，具有噴霧干燥粉末的特征[21]。部分微膠囊會存在表面開裂、凹痕或形狀不規(guī)則的情況，可能與品的水分含量、操作溫度、進料速率有關(guān)[22-23]。

2.3.2 花色苷微膠囊的粒徑

圖 5 花色苷微膠囊的粒徑分布Fig. 5 Particle size distribution of anthocyanin microcapsules

噴霧干燥的花色苷微膠囊呈粉末狀，圓球度好，大小均一，粒徑分布均勻，平均粒徑可達到558.2 nm（圖5）。綜上可知，噴霧干燥法有利于制備膠囊化產(chǎn)品，制備所需時間較短能避免品受熱時間過長，并且可有效降低微膠囊的粒徑大小，使粒徑分布更為集中[24]。

2.4 花色苷微膠囊的紫外-可見光特征

圖 6 花色苷微膠囊的紫外-可見光譜特征Fig. 6 Ultraviolet-visible absorption spectrum of anthocyanin microcapsules

2.5 光照對花色苷微膠囊穩(wěn)定性影響

圖 7 光照對花色苷、花色苷微膠囊的穩(wěn)定性影響Fig. 7 Effects of light on the stability of free anthocyanins and anthocyanin microcapsules

由圖7可知，光照3 h和5 h，花色苷微膠囊的保存率分別為93.8%和82.1%，花色苷的保存率分別為80.0%和63.7%，可見花色苷微膠囊的光穩(wěn)定性要明顯高于花色苷，表明以海藻酸鈉為壁材的內(nèi)源乳化法制備微膠囊可有效保護花色苷芯材；避光保存5 h，花色苷和花色苷微膠囊的保存率分別為78.6%和91.4%，結(jié)果表明微膠囊化可提高花色苷的保存率[3,25]。分別比較花色苷和花色苷微膠囊在光照和避光條件下的保存率，發(fā)現(xiàn)光照能加速花色苷的降解，而微膠囊化可增強花色苷對光照的耐受力，提高其穩(wěn)定性[26]。

圖 8 光照對花色苷（A）和花色苷微膠囊（B）的降解Fig. 8 Degradation rates of free anthocyanins (A) and anthocyanin microcapsules (B) in light

表 2 花色苷、花色苷微膠囊的光降解動力學(xué)參數(shù)Table 2 Photo-degradation kinetics parameters of free anthocyanins and anthocyanin microcapsules

由表2可知，相較于避光狀態(tài)，在光照條件下花色苷和花色苷微膠囊的一級反應(yīng)速率常數(shù)k均增大，且半衰期均減小，表明花色苷在光照條件下不穩(wěn)定，避光狀態(tài)更利于保存。在光照和避光條件下，花色苷微膠囊的半衰期比花色苷的半衰期長，說明微膠囊化的花色苷由于壁材的保護作用未直接暴露于光照而更加穩(wěn)定， 進一步表明基于內(nèi)源乳化法的微膠囊化包埋花色苷具有可行性。

2.6 溫度對花色苷微膠囊穩(wěn)定性影響

圖 9 溫度對花色苷（A）和花色苷微膠囊（B）穩(wěn)定性的影響Fig. 9 Effect of temperature on the stability of free anthocyanins (A) and anthocyanin microcapsules (B)

圖 10 花色苷（A）和花色苷微膠囊（B）的熱降解Fig. 10 Thermal degradation of free anthocyanins (A) and anthocyanin microcapsules (B)

由圖9可知，花色苷和花色苷微膠囊在高溫下均發(fā)生了不同程度的熱降解。由圖9A可知，高溫加熱1 h，花色苷保存率急速降低；90 ℃加熱2.5 h，其保存率僅為53.3%。由圖9B可知，高溫加熱1.5 h花色苷微膠囊保存率逐漸降低；90 ℃加熱2.5 h，其保存率為74.7%。由可知，隨著加熱時間和溫度的增加，相較于微膠囊化花色苷，花色苷的熱降解更加顯著，即高溫狀態(tài)微膠囊化的花色苷的熱穩(wěn)定性更高[3]，可能是微膠囊化的花色苷受海藻酸鈉壁材的保護其結(jié)構(gòu)未被直接破壞?，F(xiàn)有研究表明，升高溫度能加快降解花色苷[27-28]，因在貯存花色苷及其微膠囊化品時應(yīng)避免高溫。

表 3 花色苷、花色苷微膠囊的熱降解動力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermal degradation kinetic parameters of free anthocyanins amd anthocyanin microcapsules

隨溫度的升高，花色苷和花色苷微膠囊的一級反應(yīng)速率常數(shù)k均增大，而半衰期均減小，表明花色苷及花色苷微膠囊在高溫狀態(tài)下熱穩(wěn)定性下降且熱降解速率快；在相同溫度條件下，花色苷微膠囊的熱降解速率常數(shù)k（0.040 938）比花色苷k（0.077 732）小，而半衰期（16.93 h）比花色苷的半衰期（8.92 h）大，說明微膠囊化的花色苷在高溫狀態(tài)下比花色苷更穩(wěn)定，同時體現(xiàn)出基于內(nèi)源乳化法的微膠囊化包埋花色苷的有效性。

2.7 花色苷微膠囊在模擬人腸消化環(huán)境中的穩(wěn)定性

圖 11 花色苷在人工模擬胃液中的保存率Fig. 11 Retention rates of free and microencapsulated anthocyanins in artificial gastric juice

表 4 經(jīng)過人工模擬消化后花色苷、花色苷微膠囊的保存率Table 4 Retention rates of free anthocyanins and anthocyanin microcapsules after artificial digestion

圖 12 花色苷在人工模擬腸液中的保存率Fig. 12 Retention rates of free and microencapsulated anthocyanins in artificial intestinal juice

3 結(jié) 論

本實驗以海藻酸鈉為壁材，采用內(nèi)源乳化法制備濕態(tài)花色苷微膠囊，再考察噴霧干燥工藝對微膠囊化濕態(tài)花色苷的影響，通過單因、正交試驗獲得噴霧干燥花色苷微膠囊的最佳工藝參數(shù)為加熱器溫度120 ℃、進料速率12 r/min、真空壓力0.03 MPa，花色苷微膠囊的平均粒徑為558.2 nm，包埋率為75.12%。

研究結(jié)果表明，微膠囊化前后花色苷的光降解穩(wěn)定性均符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，在避光條件下較光照條件下的保存率更高；且花色苷微膠囊穩(wěn)定性在光照和避光貯藏條件下均高于花色苷。微膠囊化前后花色苷的熱降解穩(wěn)定性也符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，其保存率均隨溫度升高而降低，但花色苷微膠囊的溫度穩(wěn)定性高于花色苷。在人工模擬腸液中花色苷微膠囊的穩(wěn)定性均高于花色苷。綜上可知，內(nèi)源乳化法結(jié)合噴霧干燥法制備花色苷微膠囊可有效提高花色苷的光照、溫度、腸消化穩(wěn)定性。