楊 玉，周歡娣,2，薛曉英，張 歌，韓雪濤，田哲森，李月紅

1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院放療科，河北 石家莊 050000；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050000；

3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050000

食管癌是常見消化道惡性腫瘤，并且是預(yù)后較差的消化道惡性腫瘤之一，其術(shù)后5年生存率僅為28.5%～57.0%，放療是其主要治療手段之一［1-3］。放射抗性作為腫瘤放療失敗的主要原因，同時也是食管癌放射生物學(xué)研究的焦點(diǎn)，對其分子機(jī)制的研究備受關(guān)注。放射抗性涉及凋亡基因的調(diào)控、DNA損傷修復(fù)能力［4］、乏氧［5-6］、細(xì)胞周期狀態(tài)［4］及多種分子信號通路的改變［7］。

神經(jīng)營養(yǎng)因子受體相互作用M AGE 類藥物（neurotrophin receptor-interacting MAGE homolog，NRAGE）是黑色素瘤相關(guān)抗原家族的成員［8］。NRAGE基因最初被認(rèn)為系抑癌基因在細(xì)胞存活、凋亡、細(xì)胞周期和分化中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能［9］。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)NRAGE在黑色素瘤、胃癌、結(jié)腸癌等癌組織中過表達(dá)，并存在與抑癌基因截然相反的作用［10-11］。

有研究發(fā)現(xiàn)，NRAGE在食管癌放射抗拒細(xì)胞系TE13R120中表達(dá)升高［12］，進(jìn)一步研究提示NRAGE亞細(xì)胞定位變化可能參與食管癌細(xì)胞放射抗性的形成［12］。本研究在此基礎(chǔ)上建立NRAGE基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的食管癌細(xì)胞系，觀察其對細(xì)胞放射抗性、細(xì)胞周期和凋亡的影響，探討其參與放射抗性的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Eca109為北京大學(xué)高獻(xiàn)書教授實(shí)驗(yàn)室惠贈，質(zhì)粒為河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院放療科實(shí)驗(yàn)室保存，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司（貨號：11668027），G418購自美國Sigma公司（貨號：11811023），NRAGE（貨號：22053-1-AP）和β-catenin（貨號：51067-2-AP）多克隆抗體均購自美國Proteintech公司，引物設(shè)計(jì)由上海捷瑞生物工程有限公司完成，PrimeScriptTMⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RR047A）與SYBR PremixEx TaqTM（貨號：RR820A）均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（貨號：CA1020），流式細(xì)胞儀購自美國BD公司（型號：FACSCalibur）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

①篩選濃度的確定：接種Eca109于6孔板上，5×103個/孔，培養(yǎng)24 h后，按100～1000 μg/mL濃度范圍加入G418，繼續(xù)培養(yǎng)。維持上述G418濃度，正常換液，觀察細(xì)胞的生長和凋亡情況，兩周后使全部細(xì)胞死亡的最低濃度即為最佳篩選濃度。② 轉(zhuǎn)染及篩選：參照LipofectamineTM2000說明書，取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板上，當(dāng)細(xì)胞長至80%～90%融合時，轉(zhuǎn)染，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6 h換完全培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組（Eca109/NRAGE組）和對照組（Eca109組）。全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按1∶6傳代，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換G418的全培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時把抗生素濃度減半維持篩選，兩周后，Eca109組細(xì)胞全部死亡，Eca109/NRAGE組細(xì)胞有克隆形成，挑取陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，以備實(shí)驗(yàn)用。③單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA和總蛋白做實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitive polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）與蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)效果。

1.2.3 細(xì)胞照射條件

輻照設(shè)備為電子直線加速器［醫(yī)科達(dá)（上海）醫(yī)療器械有限公司］，使用6 MV X射線進(jìn)行照射，劑量率為300 MU/min，機(jī)架角為180度，SSD源皮距為100 cm，并在培養(yǎng)瓶下放置1.5 cm組織補(bǔ)償膜，室溫下照射。

1.2.4 RTFQ-PCR檢測NRAGE和β-catenin mRNA表達(dá)

收集細(xì)胞，利用TRIzol試劑提取總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒的操作步驟，以GAPDH作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性5 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。采用相對定量法比較目的mRNA的表達(dá)差異，以2-（Ct目的基因-Ct GAPDH）作為目的基因mRNA相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測相關(guān)蛋白水平

根據(jù)試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（NRAGE為1∶100，β-catenin為1∶1000，β-actin為1∶500），4 ℃搖床一抗封閉過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000）于37 ℃搖床溫育2 h，TBST洗3次，5 min/次，然后洗膜、顯影。β-actin為內(nèi)參。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)測定放射敏感性

取指數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板上，每孔分別接種50、100、300、500、800、1000個細(xì)胞。每組設(shè)3個平行組，分別照射0、2、4、6、8和10 Gy。培養(yǎng)10～14 d見克隆形成時終止培養(yǎng)。甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染液染色30 min，計(jì)數(shù)集落數(shù)，以≥50個細(xì)胞的集落作為一個克隆。存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）=實(shí)驗(yàn)組集落形成率/對照組集落形成率；集落形成率=形成集落數(shù)/種植細(xì)胞數(shù)；以單擊多靶模型S=1-（1-e-D/D0）N擬合細(xì)胞存活曲線并計(jì)算放射生物學(xué)參數(shù)D0、Dq、N和SF2（照射2 Gy后細(xì)胞SF）。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡分布的變化

兩組細(xì)胞分別接受10 Gy劑量的單次照射后繼續(xù)培養(yǎng)12 h后檢測細(xì)胞周期及凋亡，收集各組細(xì)胞2×106個，用PBS洗滌細(xì)胞沉淀后離心去上清，用70%冰乙醇4 ℃固定12 h，棄上清，PBS洗滌，加入PI染液后37 ℃溫育后上機(jī)分析細(xì)胞周期。相同細(xì)胞制備方法加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin-V-FITC混勻，再加入5 μL碘化丙啶混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

取對數(shù)生長期細(xì)胞，2×105個/孔接種于6孔板上，培養(yǎng)24 h時（T0）在培養(yǎng)板底部“1”字形劃痕，顯微鏡下觀察劃痕并拍照記錄；繼續(xù)培養(yǎng)12、24 h，拍照。用Image J軟件分析數(shù)據(jù)并計(jì)算細(xì)胞遷移率。遷移率=（T0時劃痕寬度-各時間點(diǎn)劃痕寬度）/T0時劃痕寬度×100%。

1.2.9 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

收集2×104個對數(shù)生長期細(xì)胞加入Transwell小室上室，將600 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)液加入小室下室，培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞和Matrigel基質(zhì)膠。固定后沖洗，顯微鏡（×100）下觀察，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以表示，采用t檢驗(yàn)及方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)NRAGE基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建

RTFQ-PCR和Western blot結(jié)果證實(shí)Eca109/NRAGE組細(xì)胞的NRAGE表達(dá)量較其親本細(xì)胞明顯增加（P＜0.05，圖1A、B）。倒置顯微鏡下觀察Eca109和Eca109/NRAGE細(xì)胞株，Eca109細(xì)胞為圓形或不規(guī)則多邊形，細(xì)胞間邊界不清，呈片狀生長；而Eca109/NRAGE細(xì)胞株則細(xì)長呈梭形或紡錘形，細(xì)胞極性消失（圖1C、D）。

圖1 過表達(dá)NRAGE基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建Fig.1 Construction of stable transfected cell line with overexpression of NRAGE gene

2.2 NRAGE對食管癌細(xì)胞放射抗性的影響

Eca109/NRAGE細(xì)胞的D0、Dq、N、SF2值均增大，其中Eca109/NRAGE細(xì)胞的D0、Dq、SF2值顯著高于Eca109細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為2.253、2.939、2.351，P＜0.05，圖2，表1）。

表1 單擊多靶模型參數(shù)值Tab.1 The parameter values of survive curves fitted with the multi-target model

圖2 Eca109和Eca109/NRAGE組細(xì)胞的放射生存曲線Fig.2 Radiation survival curves of Eca109 and Eca109/NRAGE cells

2.3 NRAGE對細(xì)胞周期及凋亡的影響

兩組細(xì)胞在照射前，Eca109/NRAGE細(xì)胞中S期細(xì)胞比例顯著高于Eca109組（t=2.756，P＜0.05），而G2/M期細(xì)胞分布低于Eca109組（t=10.5，P＜0.05）。10 Gy的X射線照射后兩組細(xì)胞均出現(xiàn)G2/M 期阻滯，表明細(xì)胞在進(jìn)行自身損傷修復(fù)，照射后Eca109相比于Eca109/NRAGE組G0/M期細(xì)胞比例顯著增加（t=23.78，P＜0.05）。兩組細(xì)胞在照射前，Eca109細(xì)胞凋亡率為7.99%±0.71%，Eca109/NRAGE細(xì)胞凋亡率為4.16%±0.15%。兩組細(xì)胞相比，Eca109/NRAGE細(xì)胞凋亡率顯著降低（t=3.268，P＜0.05）。10 Gy的X射線照射后兩組細(xì)胞凋亡率均增加，Eca109細(xì)胞凋亡率為34.63%±2.54%，Eca109/NRAGE細(xì)胞凋亡率為24.29%±1.122%。兩組細(xì)胞相比，Eca109細(xì)胞凋亡率增加更顯著（t=8.829，P＜0.05，圖3）。

圖3 NRAGE對細(xì)胞周期及凋亡的影響Fig.3 The influence of NRAGE on cell cycle and cell apoptosis

2.4 NRAGE對細(xì)胞遷移和侵襲的影響

采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察NRAGE基因及低劑量照射（5 Gy）對Eca109細(xì)胞遷移影響，發(fā)現(xiàn)0 Gy照射時Eca109/NRAGE細(xì)胞的劃痕寬度有所變窄，其細(xì)胞遷移能力顯著高于Eca109（t=7.729，P＜0.05）。

接受5 Gy照射后Eca109、Eca109/NRAGE細(xì)胞的遷移能力均降低（t分別為8.017、3.466，P均＜0.05），且Eca109/NRAGE細(xì)胞遷移率仍高于Eca109（t=12.28，P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。對于侵襲能力的檢測，0 Gy照射時Eca109/NRAGE細(xì)胞侵襲能力顯著高于Eca109（t=11.73，P＜0.05）。接受5 Gy照射后Eca109、Eca109/NRAGE細(xì)胞的侵襲能力均降低（t分別為5.857、8.644，P＜0.05），且Eca109/NRAGE培養(yǎng)24 h的細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)高于Eca109（t=8.944，P＜0.05，圖5，表3）。

2.5 Eca109和Eca109/NRAGE細(xì)胞中β-catenin表達(dá)情況

RTFQ-PCR 和Western blot結(jié)果結(jié)果顯示，β-catenin在Eca109/NRAGE組細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于Eca109組細(xì)胞（P＜0.05，圖6）。

圖4 NRAGE對細(xì)胞遷移的影響Fig.4 The influence of NRAGE on cell migration

表2 NRAGE對細(xì)胞遷移的影響Tab.2 The influence of NRAGE on cell migration

圖5 NRAGE對細(xì)胞侵襲的影響Fig.5 The influence of NRAGE on cell invasion

表3 NRAGE對細(xì)胞侵襲的影響Tab.3 The influence of NRAGE on cell invasion

圖6 Eca109和Eca109/NRAGE細(xì)胞中β-catenin表達(dá)Fig.6 The β-catenin expression in Eca109 and Eca109/NRAGE cells

3 討論

食管癌是常見的上皮組織源性的惡性腫瘤，中國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，在中國十大惡性腫瘤死亡率中，食管癌死亡率占第四位［14］。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推薦，放療和手術(shù)一樣是食管癌主要的根治手段。雖然放射物理學(xué)技術(shù)不斷提高，已經(jīng)顯著提高了食管癌放療的精度，但食管癌患者5年生存率仍不足20%［15］。治療失敗的主要失敗原因?yàn)榫植繌?fù)發(fā)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)主要與放療期間腫瘤細(xì)胞獲得放射抗性有關(guān)［16］。隨著放射抗性研究的不斷深入，從細(xì)胞生物學(xué)角度探索癌細(xì)胞放射抵抗的分子機(jī)制，改善腫瘤的放射敏感性，將為提高食管癌局部控制率，改善預(yù)后提供幫助，對于制定腫瘤治療方案起到重要作用。

本課題組前期利用食管鱗癌細(xì)胞TE13，經(jīng)X線反復(fù)照射得到了具有放射抗拒性且能夠穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞株TE13R120。通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，在食管癌放射抗性細(xì)胞TE13R120中，NRAGE表達(dá)顯著升高，且實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NRAGE表達(dá)量在兩種細(xì)胞中隨照射后時間的延長和照射劑量的增加而升高［12］，提示該基因可能參與放射抗性的形成。后續(xù)在探索可能的作用機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，NRAGE亞細(xì)胞定位變化可能參與食管癌細(xì)胞放射抗性的形成［13，17-18］。

本實(shí)驗(yàn)通過基因轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NRAGE基因的食管癌細(xì)胞Eca109/NRAGE，經(jīng)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后的Eca109/NRAGE細(xì)胞具有明顯的放射抗拒性，進(jìn)一步證實(shí)NRAGE參與了介導(dǎo)食管癌放射抗性的形成。至此，NRAGE影響放射抗性的關(guān)系得到確定。

另外，我們檢測了兩組細(xì)胞在放射前后細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果顯示，與Eca109細(xì)胞相比，Eca109/NRAGE細(xì)胞對射線抵抗性最強(qiáng)的S期細(xì)胞比例增加而對射線最敏感的G2/M期減少；X射線照射后，Eca109細(xì)胞G2/M期細(xì)胞分布的增加較過表達(dá)細(xì)胞更為顯著，證實(shí)NRAGE高表達(dá)與食管癌細(xì)胞放射抗性密切相關(guān)。該結(jié)果也表明該基因可能通過影響細(xì)胞周期分布，進(jìn)而參與細(xì)胞放射抗性形成。Yang等［9］在對食管癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，敲低NRAGE基因可引起細(xì)胞周期的改變，出現(xiàn)G2/M期阻滯現(xiàn)象，且S期細(xì)胞明顯減少，與本研究結(jié)果一致。與Eca109組細(xì)胞相比，Eca109/NRAGE細(xì)胞凋亡率明顯降低，X射線照射后兩組細(xì)胞凋亡率均增加，但Eca109細(xì)胞凋亡率的增加更為顯著（P＜0.05），表明該基因抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與細(xì)胞放射抗性形成。Kumar等［11］研究發(fā)現(xiàn)，NRAGE在肺癌、乳腺癌等腫瘤中發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NRAGE的過表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，Jiang［20］等對胃癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，敲低NRAGE基因表達(dá)可以抑制細(xì)胞的侵襲能力。

經(jīng)典Wnt通路與腫瘤放射抗性形成密切相關(guān)，成為近年來的研究熱點(diǎn)。Chu等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在PANC-1細(xì)胞中敲低NRAGE基因可以使β-catenin與上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，進(jìn)而抑制胰腺癌和惡性黑色素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此本研究檢測在食管癌細(xì)胞中NRAGE是否通過激活β-catenin發(fā)揮功能。本研究結(jié)果顯示，β-catenin在Eca109/NRAGE組細(xì)胞的表達(dá)量較其親本細(xì)胞明顯增高。初步證實(shí)在Eca109/NRAGE組細(xì)胞中高表達(dá)的NRAGE可能通過參與Wnt/β-catenin信號通路而參與放射抗性的形成。

綜上所述，本研究成功建立了穩(wěn)定表達(dá)NRAGE的食管癌細(xì)胞系，并初步觀察外源性NRAGE對細(xì)胞體外放射抗性的影響，并對其放射抵抗機(jī)制進(jìn)行初步探索，希望為今后利用NRAGE基因治療食管癌的研究提供細(xì)胞模型及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為提高放療敏感性尋找新的靶點(diǎn)。