韓 冰，胡柳楊 綜述，曹東林 審校

廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510317

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病，在全球范圍內(nèi)尤其是發(fā)展中國(guó)家仍處于高發(fā)狀態(tài)?，F(xiàn)有的臨床診斷技術(shù)中，傳統(tǒng)顯微鏡檢查陽(yáng)性率低，細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)效性差，影像學(xué)表現(xiàn)特異度較低，雖然免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)在診斷靈敏度和檢測(cè)速度等方面與經(jīng)典方法相比有了很大改進(jìn)，但仍存在成本高、結(jié)果難以規(guī)范化等諸多問題，延緩了世界衛(wèi)生組織“結(jié)束結(jié)核病戰(zhàn)略”的進(jìn)展。為彌補(bǔ)液標(biāo)本采集和應(yīng)用的不足，解決當(dāng)前診斷技術(shù)中存在的各種問題，血液、尿液等非痰液標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌游離DNA(cfDNA)的檢測(cè)應(yīng)運(yùn)而生，為實(shí)現(xiàn)肺結(jié)核的準(zhǔn)確快速診斷和肺外結(jié)核的有效檢出開辟了途徑。本文針對(duì)cfDNA檢測(cè)在結(jié)核病診斷中的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用價(jià)值作如下綜述。

1 cfDNA的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用現(xiàn)狀

cfDNA又稱循環(huán)DNA，是一種存在于生物體液中無(wú)細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA片段(80～200 bp)，它主要以DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在，在人體血液、尿液、腦脊液等多種體液中均可檢出。1948年，MANDEL等[1]首次對(duì)cfDNA進(jìn)行了描述，但在當(dāng)時(shí)他們的發(fā)現(xiàn)并沒有引起業(yè)界關(guān)注。發(fā)展到1989年，STROUN等[2]發(fā)現(xiàn)血漿中cfDNA具有腫瘤細(xì)胞DNA的一些特征，通過(guò)對(duì)腫瘤患者體內(nèi)的循環(huán)DNA序列進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示檢出的癌基因突變與原發(fā)腫瘤一致。隨后，LO等[3]首先在孕婦血漿中發(fā)現(xiàn)并且應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)到胎兒DNA，這種胎兒DNA最早可在妊娠第7周被檢測(cè)出，并隨妊娠進(jìn)展而升高，有可能成為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的理論基礎(chǔ)，這一發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是cfDNA研究領(lǐng)域的重大突破。近年來(lái)，cfDNA檢測(cè)在小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的診斷和病程監(jiān)測(cè)中取得了較大的進(jìn)展，在孕婦產(chǎn)前診斷以及妊娠相關(guān)疾病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值也不斷被發(fā)掘[4-5]。除了腫瘤學(xué)和胚胎學(xué)外，cfDNA檢測(cè)也成為糖尿病、心腦血管疾病等其他疾病診斷和治療的研究熱點(diǎn)[6-7]。

有研究指出，cfDNA也存在于細(xì)菌、寄生蟲等微生物中，當(dāng)人體感染某種病原體時(shí)可在體液中檢測(cè)出相應(yīng)的cfDNA分子，它在感染性疾病的無(wú)創(chuàng)診斷和療效觀察等方面具有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)[8]。WEERAKOON等[9]對(duì)血吸蟲病流行地區(qū)居民糞便、血清、尿液、唾液中日本血吸蟲cfDNA進(jìn)行了定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同標(biāo)本中cfDNA檢測(cè)(47.6%～74.5%)與顯微鏡檢查(26.2%)相比均獲得更高的診斷靈敏度，這種非侵入性技術(shù)已被證實(shí)可用于監(jiān)測(cè)血吸蟲病治療效果和解決診斷難題。雖然cfDNA的產(chǎn)生機(jī)制仍不十分明確，尚不能直接應(yīng)用于臨床，但毫無(wú)疑問的是它與部分感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

2 不同標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌cfDNA的檢測(cè)

目前，在結(jié)核病分子生物學(xué)診斷中檢測(cè)的多為痰液中結(jié)核分枝桿菌基因組核酸。相較于痰液，血液、尿液等臨床標(biāo)本更易采集且不需要進(jìn)行前處理，對(duì)于無(wú)呼吸系統(tǒng)損害的肺外結(jié)核或嬰幼兒等難以提供痰液的可疑肺結(jié)核患者是一種較易獲得的標(biāo)本類型。并且通過(guò)PCR技術(shù)可將人體血液、尿液、胸腔積液等體液標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌cfDNA進(jìn)行檢測(cè)。

2.1血液標(biāo)本cfDNA的檢測(cè) 2016年，USHIO等[10]采用數(shù)字PCR技術(shù)成功地從全血細(xì)胞微球中直接提取并檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌cfDNA，但這項(xiàng)研究未能排除檢測(cè)到菌體基因組DNA的可能性。2018年，CLICK等[11]首次運(yùn)用熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)證實(shí)了血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測(cè)應(yīng)用于結(jié)核病診斷的可行性，并與血培養(yǎng)結(jié)果對(duì)比明確了血液中的結(jié)核活菌并非所檢測(cè)到的游離DNA來(lái)源。2018年，YAMAMOTO等[12]報(bào)告了1例血液、痰液標(biāo)本經(jīng)抗酸染色鏡檢以及基因組DNA測(cè)定均為陰性的血行播散型肺結(jié)核患者，應(yīng)用數(shù)字PCR技術(shù)可檢測(cè)到患者血液標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌cfDNA，進(jìn)一步驗(yàn)證了檢測(cè)到的核酸片段并非來(lái)自菌血癥患者血液中活菌體內(nèi)的基因組DNA。YANG等[13]通過(guò)數(shù)字PCR技術(shù)分別檢測(cè)肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者血液標(biāo)本中cfDNA，發(fā)現(xiàn)了這種方法在肺外結(jié)核診斷中的潛在價(jià)值。此外，血漿cfDNA水平及其完整性的檢測(cè)在結(jié)核病鑒別診斷中也有重要價(jià)值，對(duì)非小細(xì)胞肺癌與結(jié)核病的鑒別作用優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物[14]。

2.2胸腔積液cfDNA的檢測(cè) 2017年新修訂的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)將胸膜部的結(jié)核病變歸入肺結(jié)核范疇。結(jié)核性胸膜炎患者常合并有胸腔積液，生化檢查是判斷病變性質(zhì)的常規(guī)方法，近年來(lái)，有研究者試圖通過(guò)檢測(cè)胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌cfDNA來(lái)實(shí)現(xiàn)結(jié)核病的診斷。cfDNA在菌體受到免疫細(xì)胞攻擊后裂解釋放進(jìn)入患者體液循環(huán)，游離在胸腔積液上清液中的小DNA片段水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因組DNA，結(jié)核分枝桿菌的檢出率明顯提高。CHE等[15]通過(guò)cfDNA檢測(cè)、結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(Xpert MTB/RIF)、腺苷脫氨酶檢測(cè)以及細(xì)菌培養(yǎng)4種方法對(duì)胸腔積液中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，cfDNA檢測(cè)的診斷靈敏度(75%)明顯高于上述其他3種方法(20.0%，68.3%，26.7%)。我國(guó)作為結(jié)核病高發(fā)病率國(guó)家，科研人員也對(duì)這種方法的診斷效能進(jìn)行了探索。通過(guò)與抗酸染色鏡檢和細(xì)胞基因組DNA檢測(cè)比較，明確了cfDNA檢測(cè)在結(jié)核性胸腔積液的診斷中具有更高的價(jià)值[16]。這些都為cfDNA應(yīng)用于結(jié)核病的診斷提供了理論支持。

2.3尿液標(biāo)本cfDNA的檢測(cè) 尿液中病原體檢測(cè)更為便捷、安全且易于操作，是一種理想的臨床標(biāo)本。一項(xiàng)對(duì)43例結(jié)核病患者和13例健康對(duì)照者尿液標(biāo)本的研究顯示，79%的患者尿液中可檢出含有IS6110序列的游離DNA片段，而所有對(duì)照組均為陰性[17]。這表明致病菌釋放的含有結(jié)核分枝桿菌特異性序列的小DNA碎片可隨循環(huán)運(yùn)送到腎臟最終排出體外，并在結(jié)核病患者尿液中被檢出。LABUGGER等[18]研究發(fā)現(xiàn)，痰涂片鏡檢和尿液cfDNA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核病的診斷靈敏度高達(dá)96%，進(jìn)一步體現(xiàn)了尿液cfDNA檢測(cè)在結(jié)核病診斷中的價(jià)值。而且實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)到尿液中cfDNA濃度緩慢下降，這反映了死亡細(xì)菌的逐步清除，因此尿液中結(jié)核分枝桿菌cfDNA被認(rèn)為是未來(lái)判斷早期殺菌活性的候選指標(biāo)，可用于評(píng)價(jià)新藥或用藥方案以及個(gè)體化結(jié)核病治療的監(jiān)測(cè)。

3 cfDNA檢測(cè)與現(xiàn)有診斷技術(shù)應(yīng)用價(jià)值的比較

3.1診斷靈敏度 痰涂片染色鏡檢仍是目前確診肺結(jié)核最常用的方法之一。這種傳統(tǒng)的顯微鏡檢查操作簡(jiǎn)便、成本低，但靈敏度不高。近年來(lái)，將顯微鏡與發(fā)光二極管相結(jié)合研發(fā)出的發(fā)光二極管熒光顯微鏡(LED-FM)不斷被推廣，其診斷效能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡[19]。但涂片時(shí)一些雜質(zhì)經(jīng)熒光染色后在LED-FM下也可呈現(xiàn)與結(jié)核分枝桿菌形態(tài)相似的黃色桿狀物，因此常出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，是否可以在臨床廣泛應(yīng)用仍需進(jìn)一步探索[20]。對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測(cè)的診斷靈敏度(63.11%)約為抗酸染色鏡檢(11.65%)的5倍，約為基因組DNA檢測(cè)(23.30%)的3倍，陽(yáng)性檢出率明顯提高[16]。

3.2診斷特異度 影像學(xué)表現(xiàn)是可疑肺結(jié)核患者在獲取細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果前明確是否該進(jìn)行抗結(jié)核治療的重要參考依據(jù)，對(duì)肺部疾病有輔助診斷價(jià)值，也可用于肺外結(jié)核的篩查[21]。但成像缺乏特異性，與肺部惡性疾病鑒別診斷時(shí)容易出現(xiàn)誤診、漏診，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查、病理學(xué)證據(jù)才能確診[22]。另外，免疫學(xué)測(cè)定作為目前臨床廣泛應(yīng)用的篩查試驗(yàn)，具有速度快、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，但結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)不易與卡介苗接種引起的免疫應(yīng)答相鑒別，而γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRAs)檢測(cè)結(jié)果又與機(jī)體所處的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，常存在較高的假陽(yáng)性率[23]。目前，結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測(cè)在多種類型標(biāo)本的研究中均顯現(xiàn)了良好的診斷特異度，同時(shí)解決了抗酸染色鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)中難以與非結(jié)核分枝桿菌(NTB)相鑒別的問題。FERNNDEZ-CARBALLO等[24]對(duì)4項(xiàng)有關(guān)血液、尿液標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測(cè)的研究進(jìn)行系統(tǒng)性回顧，發(fā)現(xiàn)這種方法用于結(jié)核病診斷的特異度為89.0%～100.0%。此外，胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測(cè)的特異度(100.0%)也明顯優(yōu)于結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(38.9%),而且cfDNA不如基因組DNA穩(wěn)定，可很快被降解清除，因此檢測(cè)到的cfDNA極有可能是近期被釋放到患者體內(nèi)的，能夠反映其當(dāng)下的疾病狀況并且提高診斷特異度[15]。

3.3檢測(cè)速度 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)合菌種鑒定是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。經(jīng)典的固態(tài)培養(yǎng)法雖然簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，但培養(yǎng)周期長(zhǎng)(4～8周)，嚴(yán)重落后于臨床治療。隨著診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，分枝桿菌生長(zhǎng)指示管檢測(cè)法(MGIT)和結(jié)核分枝桿菌液體顯色選擇培養(yǎng)法(TK SLC-L)等培養(yǎng)法被引入臨床。雖然BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)系統(tǒng)有效加快了診斷進(jìn)程，TK SLC-L培養(yǎng)基可通過(guò)剔除其他污染菌種縮短污染標(biāo)本重復(fù)培養(yǎng)時(shí)間[25]，但總體來(lái)說(shuō)細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)限性差，難以滿足臨床早診斷、早治療的需求。相對(duì)于分離培養(yǎng)，用于cfDNA檢測(cè)的非痰臨床標(biāo)本易于收集、無(wú)需經(jīng)歷漫長(zhǎng)的培養(yǎng)周期，專用試劑盒提取標(biāo)本中游離核酸片段后直接經(jīng)PCR儀檢測(cè)即可獲得結(jié)果，有望實(shí)現(xiàn)結(jié)核病的快速診斷。

3.4肺外結(jié)核的診斷效能 Xpert MTB/RIF是集標(biāo)本處理、DNA提取、結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測(cè)為一體的全自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)與常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查以及傳統(tǒng)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比較，Xpert在肺結(jié)核診斷中的高靈敏度、高特異度已經(jīng)得到了廣泛證實(shí)[26-27]。遺憾的是盡管多項(xiàng)研究證實(shí)Xpert MTB/RIF檢測(cè)總體靈敏度很高，但對(duì)肺外結(jié)核的診斷效能較低。MBUH等[28]分別收集45例經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)證實(shí)為肺外結(jié)核患者的淋巴抽吸液、胸腔積液、腹水、腦脊液等非痰液標(biāo)本進(jìn)行Xpert MTB/RIF檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率分別為66.5%、15.6%、11.1%、2.2%。而同樣作為分子生物學(xué)診斷技術(shù)的cfDNA檢測(cè)一定程度上可彌補(bǔ)Xpert MTB/RIF的不足。SANTOS等[29]利用FQ-PCR技術(shù)分別檢測(cè)38例確診肺外結(jié)核患者的血液、尿液、活組織標(biāo)本以及胸腔積液、腹水等肺外體液中的結(jié)核分枝桿菌cfDNA，陽(yáng)性檢出率分別為55.9%、33.3%、43.8%、29.6%，而且聯(lián)合檢測(cè)血液、尿液標(biāo)本可將靈敏度提高至68.8%。這與機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后免疫系統(tǒng)通過(guò)分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子發(fā)生免疫應(yīng)答來(lái)對(duì)抗感染密切相關(guān)，病原體遭到破壞后釋放的cfDNA可隨宿主細(xì)胞外液循環(huán)到達(dá)各處[30]，即未發(fā)生菌血癥的肺外結(jié)核患者仍可在體液中檢測(cè)到cfDNA，為肺外結(jié)核的有效診斷提供了新方法。

4 影響結(jié)核分枝桿菌cfDNA診斷效能的因素

4.1特異性引物 插入序列 IS6110的多個(gè)拷貝被證實(shí)特異地存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因組中，在人型結(jié)核分枝桿菌中以10～12個(gè)拷貝存在，牛型分枝桿菌只有1～3個(gè)拷貝，而其他分枝桿菌DNA中均未檢出IS6110[15]，是目前結(jié)核病分子生物學(xué)診斷中最常用的核酸擴(kuò)增靶點(diǎn)之一。此外，插入序列 IS1081、23S rRNA也是結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的有效靶點(diǎn)[31]。針對(duì)上述靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物可有效提高結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測(cè)的特異性。

4.2標(biāo)本保存 許多研究發(fā)現(xiàn)，并非所有病例均能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，部分FQ-PCR陽(yáng)性標(biāo)本有較高的閾值(Ct)，這表明部分DNA靶點(diǎn)水平接近檢測(cè)極限，必須減少標(biāo)本中cfDNA的降解和背景DNA影響。美國(guó)Streck公司研發(fā)的加入了血液標(biāo)本穩(wěn)定劑 BCT的cfDNA采血管被證實(shí)在模擬樣品儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中可降低細(xì)胞基因組DNA的釋放，檢測(cè)時(shí)可明顯減少背景DNA的干擾。MEDINA等[32]分別用Streck cfDNA BCT采血管和標(biāo)準(zhǔn)EDTA-K2采血管采集健康人靜脈血，室溫保存5 d后發(fā)現(xiàn)BCT管中DNA水平仍保持穩(wěn)定而EDTA-K2管中血漿總DNA和基因組DNA的水平明顯增加。說(shuō)明這種新型采血裝置可以有效防止血液樣品中有核細(xì)胞斷裂釋放基因組DNA而引起的污染，實(shí)現(xiàn)低豐度cfDNA的精準(zhǔn)檢測(cè)。

4.3標(biāo)本量 生物樣品中cfDNA的濃度是影響檢測(cè)結(jié)果的決定性因素，這與所收集標(biāo)本量的多少密切相關(guān)。有學(xué)者根據(jù)當(dāng)前結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測(cè)的相關(guān)研究指出，基于核酸擴(kuò)增的測(cè)定中檢測(cè)限應(yīng)為10拷貝/微升，即至少需要收集5 mL體液標(biāo)本才能實(shí)現(xiàn)cfDNA的檢出[24]。更大容量的標(biāo)本可以進(jìn)一步改善cfDNA的檢出情況，9 mL血液標(biāo)本提取檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌cfDNA的靈敏度(71%)明顯高于2 mL提取方案(33%)[33]。鑒于對(duì)大量標(biāo)本的需求，尿液將是兒童可疑病例檢查的首選標(biāo)本。

4.4cfDNA提取方法 不同的方法對(duì)標(biāo)本中游離DNA的提取效率不同。MAUGER等[34]對(duì)11種不同的提取方法進(jìn)行了綜合比較，結(jié)果顯示，QIAamp循環(huán)核酸提取試劑盒和Norgen循環(huán)核酸純化試劑盒的準(zhǔn)確性和重復(fù)性最好。由于cfDNA片段小、易降解，導(dǎo)致其在提取過(guò)程中容易丟失，選擇優(yōu)質(zhì)的提取方法能夠提高檢測(cè)靈敏度。

5 未來(lái)研究展望

cfDNA可以識(shí)別體內(nèi)多個(gè)部位的疾病，并潛在地監(jiān)測(cè)目前無(wú)法用經(jīng)典微生物學(xué)方法識(shí)別的疾病狀態(tài)。臨床標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌cfDNA濃度范圍的評(píng)價(jià)應(yīng)成為結(jié)核cfDNA研究的一個(gè)重要目標(biāo)，這不僅是診斷的關(guān)鍵，對(duì)療效監(jiān)測(cè)也有重要價(jià)值，而且標(biāo)本中cfDNA濃度的估算對(duì)標(biāo)本制備和檢測(cè)平臺(tái)開發(fā)(檢測(cè)限)也具有重要意義。另一方面，目前針對(duì)兒童患者以及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者的研究有限，而鑒于痰液標(biāo)本的不易獲得，這些患者將是從cfDNA分析中獲益最大的群體，可考慮進(jìn)一步探索HIV陽(yáng)性和兒童患者體液中結(jié)核分枝桿菌的cfDNA檢測(cè)。

6 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)核病患者血液、尿液、胸腔積液等標(biāo)本中的cfDNA是切實(shí)可行的，并且在檢測(cè)速度、靈敏度、特異度、適用廣度等多個(gè)方面均顯現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)。雖然目前cfDNA作為結(jié)核病生物標(biāo)志物的研究尚處于起步階段，然而，它的巨大潛力正推動(dòng)這一領(lǐng)域逐漸獲得更多的關(guān)注，而且已有多種插入序列被證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌所特有，市場(chǎng)上也已推出可以減少背景DNA釋放的采血裝置，有理由相信通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物和優(yōu)化目標(biāo)DNA提取等多種方法，可以提高結(jié)核分枝桿菌cfDNA的診斷效能，這種新型的分子生物學(xué)技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷改良可以開創(chuàng)結(jié)核病快速診斷的新局面。