李思佳，李文新綜述，宋新宇審校

0 引 言

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是以肺泡上皮細(xì)胞損傷和成纖維細(xì)胞增生為特征的一類間質(zhì)性肺疾病，研究報(bào)道IPF患者的中位生存期僅為2～3年[1]。其主要死亡原因是呼吸衰竭，在IPF發(fā)病過程中過多的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的形成以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，導(dǎo)致了永久性瘢痕的產(chǎn)生，嚴(yán)重制約了肺泡的氧氣交換能力[2]。肺泡上皮細(xì)胞的損傷主要由外界刺激或免疫反應(yīng)過度激活引起細(xì)胞凋亡和壞死所導(dǎo)致。而既往研究認(rèn)為壞死是過度刺激導(dǎo)致的不受調(diào)控的死亡模式，因此無法調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞的壞死發(fā)生。然而最近研究發(fā)現(xiàn)，至少有部分壞死是受基因調(diào)控的程序性死亡，不僅可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，還可加劇慢性組織重塑，被稱之為程序性壞死[3]。目前，程序性壞死在缺血性腦卒中、心肌缺血再灌注損傷以及急性腎損傷等疾病中被廣泛研究，最近也有研究報(bào)道了程序性壞死參與慢性阻塞性肺疾病和急性呼吸窘迫綜合征[4-5]。然而，程序性壞死參與IPF的發(fā)病及進(jìn)展的機(jī)制仍未闡明。因此，本文將對(duì)程序性壞死的發(fā)生機(jī)制及其參與IPF發(fā)生發(fā)展的研究進(jìn)展作一綜述。

1 程序性壞死

1.1 程序性壞死的發(fā)生機(jī)制程序性壞死與凋亡和自噬均是受基因調(diào)控、高度有序的細(xì)胞程序性死亡。其中，凋亡和自噬受細(xì)胞膜表面受體或細(xì)胞器信號(hào)分子激活后，引起細(xì)胞內(nèi)部蛋白或受損細(xì)胞器水解，通過形成凋亡小體和自噬小體防止細(xì)胞內(nèi)免疫復(fù)合物直接泄露至細(xì)胞外，并可被巨噬細(xì)胞吞噬后進(jìn)行降解和循環(huán)利用，是一種保護(hù)性的死亡方式。在凋亡和自噬的發(fā)生過程中細(xì)胞膜可保持完整，而程序性壞死的發(fā)生不僅會(huì)引起細(xì)胞膜快速破裂還因缺少蛋白水解過程，從而引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)并進(jìn)一步誘導(dǎo)周圍細(xì)胞損傷或死亡[6]。程序性壞死的病理學(xué)特征類似于壞死，以組織水腫、細(xì)胞質(zhì)膜迅速破裂、釋放大量?jī)?nèi)源性損傷相關(guān)分子引起急性炎癥反應(yīng)為主，因此其發(fā)生可導(dǎo)致周圍細(xì)胞及組織的損傷或后續(xù)組織的纖維化增加。但其發(fā)生機(jī)制類似于凋亡和自噬，其關(guān)鍵生物學(xué)行為均經(jīng)由特定程序和相關(guān)蛋白所主動(dòng)執(zhí)行，如質(zhì)膜破裂、氧化應(yīng)激、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的過度開放以及形成損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)等[7]。因此程序性壞死被認(rèn)定為是一種可調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，通過干預(yù)其發(fā)生的關(guān)鍵靶點(diǎn)可調(diào)控細(xì)胞的死亡、炎癥浸潤(rùn)以及纖維化形成。

程序性壞死的啟動(dòng)依賴于死亡受體途徑，主要由細(xì)胞膜上的死亡受體Fas、腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor, TNFR)以及Toll樣受體等受到相關(guān)配體激活后，進(jìn)一步在細(xì)胞內(nèi)募集Fas相關(guān)死亡域和TNFR相關(guān)死亡域形成死亡復(fù)合物，從而激活存在胞質(zhì)內(nèi)的受體交聯(lián)蛋白酶1(receptor-interacting protein kinase, RIPK1)[8]。RIPK1是程序性壞死的啟動(dòng)蛋白，其通過RIP同型作用域結(jié)合并磷酸化或泛素化激活下游蛋白R(shí)IPK3。隨后，RIPK3進(jìn)一步磷酸化激活程序性壞死的重要執(zhí)行蛋白混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域(mixed lineage kinase domain like, MLKL)。MLKL一般存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在被激活后多個(gè)MLKL形成寡聚化復(fù)合物并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，與細(xì)胞膜磷脂酰肌醇磷酸酯結(jié)合后形成細(xì)胞膜孔洞，導(dǎo)致鈣離子外流和鈉離子內(nèi)流，不僅會(huì)引起細(xì)胞水腫，還會(huì)最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)未充分水解的細(xì)胞器、帶有免疫原性的DAMPs以及過氧化物等釋放出胞，進(jìn)而引起周圍組織損傷和免疫炎性系統(tǒng)激活[9]。此外，RIPK1/RIPK3/MLKL信號(hào)通路的激活可上調(diào)TNF-α、IL-1、單核細(xì)胞趨化蛋白1等炎癥因子的表達(dá)，同時(shí)可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和α-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，這不僅介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，還促進(jìn)了纖維化的發(fā)生[10]。然而，這些促纖維化因子的分泌增加了肌成纖維細(xì)胞的激活，促進(jìn)了肺泡細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，并破壞了正常肺泡的氣體交換功能。目前，用于治療IPF的吡非尼酮的主要作用機(jī)制就是抑制TGF-β和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等促成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的因子表達(dá)，從而顯著防止和逆轉(zhuǎn)肺纖維化和瘢痕形成[11]。因此，程序性壞死的發(fā)生可能參與IPF中細(xì)胞死亡、炎癥浸潤(rùn)以及纖維化形成。

2 程序性壞死與IPF

IPF的發(fā)生主要是肺泡上皮細(xì)胞在多種致病因素刺激下發(fā)生損傷后引起進(jìn)行性纖維化肺泡炎，而肺間質(zhì)的廣泛纖維化形成導(dǎo)致肺組織增厚，并造成肺組織的氧氣交換功能不可逆地喪失。其具體病因尚不清楚，但與其風(fēng)險(xiǎn)因素香煙煙霧(cigarette smoke, CS)、全身炎癥反應(yīng)激活以及家族遺傳有關(guān)。Lee等[12]在博來霉素灌洗來構(gòu)建的小鼠肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，在IPF小鼠的肺組織中RIPK3和p-MLKL表達(dá)顯著升高，而與野生型小鼠相比，RIPK3敲除小鼠肺部纖維化和膠原沉積情況被顯著改善，并且在肺泡灌洗液中DAMPs的水平顯著降低，證明了程序性壞死的發(fā)生與肺纖維化的形成有緊密聯(lián)系。

2.1程序性壞死介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與IPF程序性壞死的典型特征是釋放DAMPs，可通過結(jié)合模式識(shí)別受體而觸發(fā)免疫炎癥反應(yīng)。正常情況下肺泡間質(zhì)有巨噬細(xì)胞存在而少有淋巴細(xì)胞存在，在IPF患者肺泡周圍觀察到淋巴細(xì)胞比例明顯升高，其中T細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞[13]。研究表明，肺泡周圍的巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞碎片或顆粒的情況下不會(huì)激活炎癥反應(yīng)，但在吞噬DAMPs的情況下會(huì)引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，并會(huì)作為抗原呈遞細(xì)胞介導(dǎo)T細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)，進(jìn)而分泌TGFγ、IL-2、IL-25、IL-13等驅(qū)動(dòng)膠原蛋白沉積，導(dǎo)致肺纖維化[14]。因此，程序性壞死發(fā)生釋放的DAMPs被認(rèn)為是介導(dǎo)免疫炎癥激活的重要因素。

吸煙是IPF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與不抽煙IPF患者的4年中位生存期相比，有較長(zhǎng)抽煙史患者的中位生存期縮短至3年[15]。Pouwels等[16]發(fā)現(xiàn)，CS的暴露可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生程序性壞死和釋放DAMPs，這導(dǎo)致了大量促炎因子的釋放，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了香煙的暴露是通過程序性壞死發(fā)生而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在氣道浸潤(rùn)，而香煙煙霧對(duì)氣道的刺激可被Nec-1所阻斷。其中，HMGB1是程序性壞死釋放的DAMPs中的重要因子。Hamada等[17]發(fā)現(xiàn)IPF患者的肺泡灌洗液中HMGB1水平明顯高于非IPF患者，并且在小鼠IPF模型中發(fā)現(xiàn)了HMGB1的水平不僅與炎癥水平有關(guān)，還與肌成纖維細(xì)胞形成和膠原沉積有顯著關(guān)系，而抗HMGB1的抗體或丙酮酸乙酯均可抑制HMGB1水平從而減輕肺部炎癥和纖維化程度。因此，CS可通過程序性壞死釋放DAMPs引起免疫炎癥發(fā)生，可能還參與了纖維瘢痕的形成，最終促進(jìn)了IPF的疾病進(jìn)展。

RIPK1-NF-κB的信號(hào)傳遞可促進(jìn)多種炎癥因子在細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄[18]。NF-κB是調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答的關(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞受到死亡受體激活的信號(hào)后，RIPK1充當(dāng)支架蛋白協(xié)同IKK泛素化修飾IκB從而使IκB被泛素-蛋白酶體所降解，從而釋放出NF-κB二聚體進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄[19]。Tian等[20]發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IPF模型組的肺泡組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子均被磷酸化激活，而NF-κB通路激活的促進(jìn)了TNF-α、pro-IL-1β、IL-6、趨化因子以及集落刺激因子等一些促炎癥因子的生成，因此在程序性壞死發(fā)生過程中，NF-κB的過度激活被認(rèn)為是促進(jìn)免疫炎癥發(fā)生的主要因素。此外，RIPK3作為程序性壞死重要蛋白不僅可以激活MLKL介導(dǎo)細(xì)胞膜的破裂，還可招募炎癥小體NLRP3，繼而水解pro-Caspase-1，將其轉(zhuǎn)化為活性Caspase-1，進(jìn)而活化由NF-κB轉(zhuǎn)錄生成的pro-IL-1β和IL-18[21]。研究發(fā)現(xiàn)，在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，NLRP3和IL-1β的水平顯著升高，上調(diào)了IL-1受體的表達(dá)，介導(dǎo)了肺組織的慢性炎癥和纖維化[22-23]。有趣的是，這個(gè)過程在病灶周圍的巨噬細(xì)胞中廣泛發(fā)生，這可能會(huì)導(dǎo)致炎癥狀態(tài)的持續(xù)存在[24]。因此，程序性壞死的發(fā)生不僅可通過釋放DAMPs激活免疫系統(tǒng)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，還可通過促進(jìn)內(nèi)源性炎癥因子的生成加劇炎癥反應(yīng)。

2.2程序性壞死介導(dǎo)的纖維化與IPFIPF患者的肺纖維病灶中以肌成纖維細(xì)胞為主，而正常健康人的肺間質(zhì)主要以少量成纖維細(xì)胞存在[25]。研究發(fā)現(xiàn)IPF患者的成纖維病灶中有較高水平的TGF-β表達(dá)，且大量體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TGF-β是誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為α-SMA陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵[26]。盡管肌成纖維蛋白的形態(tài)和生長(zhǎng)特性和成纖維細(xì)胞差別不大，但高表達(dá)外分泌蛋白GM-CSF、IL-6、IL-8、MCP-1等促炎因子，從而趨化成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等聚集在纖維病灶，最終促進(jìn)大量成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞[27]。

在IPF動(dòng)物模型中，CS可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，表現(xiàn)為α-SMA的表達(dá)顯著升高，而使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA或GRP78抑制ERS可逆轉(zhuǎn)α-SMA的表達(dá)，證明CS促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞的過程依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[28]。最近研究通過共聚焦顯微鏡觀察到RIPK3在被激活后可轉(zhuǎn)位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，不僅可導(dǎo)致ERS的發(fā)生，還可引起肌質(zhì)網(wǎng)功能紊亂而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，該研究證明了ERS的發(fā)生至少有部分是由程序性壞死發(fā)生而RIPK3激活并轉(zhuǎn)位至ER外膜所導(dǎo)致的[29]。因此，我們合理地猜測(cè)在IPF過程中，CS誘導(dǎo)的程序性壞死的發(fā)生可引起ERS，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞。另外，Hou等[30]發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)肺間質(zhì)干細(xì)胞大量分化為肌成纖維細(xì)胞，而NF-κB的活化依賴于RIPK1。在博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型中，抑制NF-κB信號(hào)通路可顯著減少肺間質(zhì)干細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，并明顯地改善了肺纖維化。以上研究證明，程序性壞死可通過調(diào)控ERS和NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)大量成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，因此靶向干預(yù)程序性壞死可能是阻斷肺間質(zhì)纖維化的有效策略。

2.3程序性壞死與家族性IPF部分IPF患者具有明確的家族遺傳史，研究發(fā)現(xiàn)在吸煙史、性別因素和環(huán)境暴露因素?zé)o顯著差異的情況下，與單發(fā)性IPF患者相比，家族性IPF患者發(fā)病年齡更早(55.4歲vs63.2歲，P<0.001)，平均死亡年齡更小(67.0歲vs71.8歲，P=0.059)，盡管兩組間平均死亡年齡不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但作者認(rèn)為這可能與家族性IPF患者更早診斷和及時(shí)服用抗纖維化藥物有關(guān)[31]。Takezaki等[32]在2例日本家族性IPF患者中檢測(cè)到SFTPA1基因位點(diǎn)的純合子突變，導(dǎo)致了下游編碼蛋白產(chǎn)物表面蛋白A(surfactant protein A, SP-A)分泌顯著減少，并且這些患者更易感染流感病毒病加速IPF的進(jìn)展。為明確SFTPAP1突變與IPF的關(guān)系，他們構(gòu)建了SFTPAP1純合敲除小鼠，在SFTPAP1-/-小鼠的肺泡II型上皮細(xì)胞中檢測(cè)到RIPK3和MLKL的過表達(dá)，而敲除RIPK3或MLKL均可顯著改善IPF的進(jìn)展，這證明了SFTPAP1純合突變體不僅減少了SP-A的產(chǎn)生，還會(huì)導(dǎo)致程序性壞死的發(fā)生失去監(jiān)控。進(jìn)一步地，他們發(fā)現(xiàn)SFTPAP-1的缺失可導(dǎo)致ERS，從而過表達(dá)IRE1α和增加JNK磷酸化，從而上調(diào)了RIPK3表達(dá)，抑制IRE1α和JNK可顯著抑制RIPK3的表達(dá)并阻止肺纖維化進(jìn)程。相反，以上的過程可被RIPK3過表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，證明了家族遺傳史可能增加了IPF對(duì)外界刺激的易感性，而程序性壞死加劇了肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損傷和纖維化過程。

3 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，程序性壞死參與了IPF進(jìn)展過程中的免疫炎癥激活和纖維化增生，介導(dǎo)了吸煙和家族遺傳史加劇IPF發(fā)生的重要過程，因此程序性壞死可能是治療IPF的重要靶點(diǎn)。另外，程序性壞死相關(guān)基因的多態(tài)性可能與多種疾病的發(fā)展和患者預(yù)后顯著相關(guān)，是否程序性壞死關(guān)鍵蛋白的基因多態(tài)性可作為判斷IPF發(fā)生和預(yù)后的預(yù)測(cè)因子仍需進(jìn)一步闡明。值得注意的是，目前的研究多基于細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，是否同樣適用于臨床治療仍需進(jìn)一步調(diào)查。程序性壞死相關(guān)的信號(hào)通路和分子靶標(biāo)仍未被充分發(fā)現(xiàn)，因此程序性壞死的特異性和敏感性較高的生物標(biāo)志物尚未被充分建立。此外，目前尚缺少IPF患者肺組織異常表達(dá)程序性壞死的生物學(xué)標(biāo)記證據(jù)，以及相關(guān)血清學(xué)檢查。進(jìn)一步地完善這些研究對(duì)治療IPF具有較大臨床意義。