王曉玥，張麗紅，范 娜，童明瓊

(德州學(xué)院 醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東 德州 253023)

現(xiàn)階段人民生活節(jié)奏普遍較快，工作壓力大，人類(lèi)健康正遭遇前所未有的挑戰(zhàn)，發(fā)病率的增高使得我們對(duì)藥物的需求量逐漸增大。中醫(yī)藥在我國(guó)應(yīng)用歷史十分悠久，中藥材物種豐富，具有多種藥理活性，包括抗菌、抗腫瘤、抗炎、對(duì)心臟血管系統(tǒng)起效等。中藥包括植物藥、動(dòng)物以及礦物等，其中植物藥占比最大，如《中藥大辭典》中收錄的中藥種類(lèi)近6000種，植物藥占80%以上，因此有“諸藥以草為本”的說(shuō)法[1]。天然產(chǎn)物是指從生物體內(nèi)的多種內(nèi)源性的天然存在的化學(xué)成分及代謝產(chǎn)物[2]，中藥材治療過(guò)程中發(fā)揮藥理作用的有效成分是天然產(chǎn)物來(lái)源的寶庫(kù)。中藥材中天然產(chǎn)物呈現(xiàn)生物活性多樣化及多靶點(diǎn)等特性，是現(xiàn)在新藥研究的一大熱點(diǎn)。然而多種天然產(chǎn)物現(xiàn)今仍主要提取自野生藥用植物，隨著發(fā)病率上升，藥物需求量增大，采挖量的增加導(dǎo)致藥用植物資源急劇減少，阻礙著中藥材及天然產(chǎn)物的應(yīng)用和發(fā)展。中藥材內(nèi)生真菌可能含有與中藥材同樣的代謝產(chǎn)物，產(chǎn)量高，并且具有良好的可再生性，因此從中藥材內(nèi)生真菌中尋找能夠產(chǎn)生活性天然產(chǎn)物的菌株具有重要價(jià)值。

1 中藥材天然產(chǎn)物的應(yīng)用及局限性

中藥材在多種疾病中具有良好的治療效果，如中醫(yī)藥在癌癥的治療上已經(jīng)起到了非同小可的作用?，F(xiàn)在研究表明，多種中藥材具有抗腫瘤治療、提高免疫力及治療耐受性、避免手術(shù)，延長(zhǎng)生存時(shí)間的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可以從多個(gè)方面控制疾病。如紫杉醇是抗癌天然產(chǎn)物中的明星藥物，其主要作用于微管，通過(guò)破壞癌細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程，進(jìn)而起到阻止癌細(xì)胞無(wú)限增殖的作用，臨床上主要用于治療乳腺癌等多種癌癥[3]。再如傳統(tǒng)中藥材雷公藤，現(xiàn)在也會(huì)被用于腫瘤的治療，現(xiàn)代研究表明其中含有的雷公藤紅素可以抑制癌癥新生血管生成[4]，是一種十分具有研究前景的天然產(chǎn)物。除此之外，雷公藤紅素還有多種藥理功能，包括抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[5]、抗艾滋病毒[6-7]、治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]、改善肥胖哮喘氣道炎癥等。

由此可見(jiàn)，中藥材的天然產(chǎn)物可以用來(lái)治療多種疾病，很多天然產(chǎn)物處于供不應(yīng)求的狀態(tài)?，F(xiàn)階段天然產(chǎn)物的獲取方式具有極大的局限性，主要包括直接從植物中提取，人工合成，半合成及組織培養(yǎng)等。多種天然產(chǎn)物主要提取于中藥材，然而中藥材中有效化學(xué)成分含量往往較低，若僅依賴(lài)于從中藥材中提取天然產(chǎn)物，需要大量砍伐藥材資源，可能導(dǎo)致物種瀕臨滅絕，破壞物種多樣性。同時(shí)，為保證藥用成分含量的積累，多數(shù)藥材需要多年種植才能采收，進(jìn)一步限制了天然產(chǎn)物的應(yīng)用。許多天然產(chǎn)物可以通過(guò)人工合成獲得，但是天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性導(dǎo)致了工業(yè)合成的難度極大，所需經(jīng)費(fèi)高，人力物力浪費(fèi)嚴(yán)重。半合成方法相對(duì)而言研究較為透徹，但是操作過(guò)程中仍然需要使用大量中藥材，未能從根本解決藥用資源匱乏問(wèn)題。組織培養(yǎng)法建立耗時(shí)久，所需成本高，同時(shí)難以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。由此可見(jiàn)，尋找有效天然產(chǎn)物的獲取方式十分重要。

2 中藥材內(nèi)生真菌分離意義

內(nèi)生真菌是真菌生物多樣性的重要組成部分之一。內(nèi)生真菌生存于植物的葉和莖之中并能完成生活的周期的真菌，在植物體內(nèi)普遍存在，但是它不容易被識(shí)別，對(duì)宿主植物不具有致病性，而是依賴(lài)共生的關(guān)系。宿主植物可以提供給內(nèi)生真菌的生存所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，內(nèi)生真菌通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育及進(jìn)化過(guò)程等方式回報(bào)宿主植物[9]。如鄒暉林等[10]將內(nèi)生真菌液澆灌到鐵皮石斛的盆栽中，進(jìn)行了為期6個(gè)月的干旱培養(yǎng)，并觀察記錄其外形變化、存活率等指標(biāo)。結(jié)果表明，接受了內(nèi)生真菌灌溉的鐵皮石斛苗比對(duì)照組長(zhǎng)勢(shì)要好，說(shuō)明植物內(nèi)生真菌可以幫助植物生長(zhǎng)并增加其抗逆性。蘇珍珠等[11]實(shí)驗(yàn)表明，將內(nèi)生真菌稻鐮狀瓶霉接種于水稻種子，幼苗的株高及葉寬會(huì)顯著增加，同時(shí)營(yíng)養(yǎng)吸收相關(guān)基因活躍表達(dá)，說(shuō)明植物內(nèi)生真菌對(duì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)起到了積極的作用。

內(nèi)生真菌除具有可促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育等作用外，還可以產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物。現(xiàn)階段，在內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)物包括抗病毒劑，抗氧化劑，還包括抑菌劑等。

3.1 產(chǎn)生與宿主植物相同的代謝產(chǎn)物

內(nèi)生真菌生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物，同時(shí)可以通過(guò)基因重組獲得的宿主植物的某些基因所產(chǎn)生與宿主植物相同的產(chǎn)物，因此內(nèi)生真菌總代謝物相比宿主植物而言可能更為多樣。程玉鵬等[12]總結(jié)了多種藥用植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物規(guī)律，發(fā)現(xiàn)紅豆杉內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)紫杉醇，長(zhǎng)春花內(nèi)生真菌可產(chǎn)長(zhǎng)春新堿，喜樹(shù)內(nèi)生真菌產(chǎn)物中含有喜樹(shù)堿，以上成分均與原植物次生產(chǎn)物相同，且已經(jīng)合成藥物。此外，多種藥用植物內(nèi)生真菌正在進(jìn)行研究。曹曉冬[13]等從滇重樓的根狀莖中分離得到3株可以合成大量的甾體化合物的內(nèi)生真菌。柯樹(shù)煒等[14]從番木瓜植株的葉片、果實(shí)和莖中分離得到一株內(nèi)生真菌為青霉屬橘青霉，通過(guò)薄層層析等實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其代謝產(chǎn)物含有黃酮類(lèi)物質(zhì)。

3.2 產(chǎn)生新型結(jié)構(gòu)化合物

近年來(lái)，植物內(nèi)生真菌中分離得到了多種活性化合物，除與宿主植物相同的產(chǎn)物外，還發(fā)現(xiàn)具有新穎結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物[15]，主要包括生物堿、甾體及萜類(lèi)等[16]。如Lu等[17]從黃花籬的內(nèi)生真菌中得一種新的具有抗菌作用的吲哚類(lèi)生物堿。徐振魯?shù)萚18]對(duì)荒漠植物霧冰藜的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離研究，得到4個(gè)松蘿酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，其中有一個(gè)新的化合物，并且具有抗腫瘤活性。張武德等[19]從丹參細(xì)胞中分離出8個(gè)新型的化學(xué)成分，這些物質(zhì)分別有抗癌，抗病毒，神經(jīng)保護(hù)的作用。由此可見(jiàn)，內(nèi)生真菌是新型天然產(chǎn)物挖掘與篩選的重要來(lái)源之一。

4 中藥內(nèi)生真菌藥用價(jià)值研究進(jìn)展

中藥材藥理活性多樣，當(dāng)中藥材基原植物作為宿主植物時(shí)，其內(nèi)生真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能具有同樣的藥理活性，對(duì)于疾病的治療具有臨床應(yīng)用的前景。

4.1 抗氧化作用

生物體在生長(zhǎng)過(guò)程中，體內(nèi)不斷產(chǎn)生自由基，如若不及時(shí)清除，過(guò)量自由基積累會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成危害?，F(xiàn)階段，有多種內(nèi)生真菌產(chǎn)物表現(xiàn)出良好的自由基清除及抗氧化的功能。潘峰等[20]從川貝母鱗莖中分離得到一株內(nèi)生真菌，利用石油醚等四種有機(jī)溶劑提取的發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出良好的自由基清除活性。鄭帥等[21]從刺五加中分離純化得到的內(nèi)生真菌中提取代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵液菌株BXPL6和CBR1對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除活性。鄭朝輝等[22]從黃芩內(nèi)生真菌的乙酸乙酯培養(yǎng)物中提取到的鄰苯二甲酸二正丁酯等三種成分對(duì)自由基的清除能力也非常高。內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化能力與培養(yǎng)條件及時(shí)間相關(guān)，如崔晉龍等[23]在柴胡紅景天中研究一株命名為菌Rb-R-1的內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)在含有乳糖及牛肉膏的培養(yǎng)基中，中性pH值條件下，25 ℃培養(yǎng)10 d時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率達(dá)到最高值。

4.2 抗癌抗腫瘤作用

近年來(lái)癌癥發(fā)病率的上升極大地危害了人民健康，抗癌抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選迫在眉睫，內(nèi)生真菌為尋找抗癌天然藥物提供了新的思路，多種抗癌活性產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)。如陳淑娟等[24]從紅豆杉內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出一種化合物經(jīng)過(guò)檢測(cè)，對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，且與濃度呈正相關(guān)。楊明俊等[25]從水仙根莖中的內(nèi)生真菌分離真菌并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)使用乙酸乙酯提取的內(nèi)生真菌發(fā)酵液可以抑制肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌等細(xì)菌同樣具有抑制作用；鐵皮石斛內(nèi)生真菌的乙酸乙酯萃取物具有類(lèi)似藥理作用[26]。

宮頸癌嚴(yán)重危害了女性健康，繆莉等[27]使用乙酸乙酯萃取了銀杏內(nèi)生真菌的發(fā)酵液并鑒定得到，分離出四種化合物，發(fā)現(xiàn)其中一種化合物羥基曲霉酸，MTT實(shí)驗(yàn)證明該成分可抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)；陳吳海等[28]提取和純化了藏紅花內(nèi)生真菌CSL-27的多糖成分，同樣發(fā)現(xiàn)在多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖有抑制性。代金霞等[29]對(duì)寧夏枸杞的內(nèi)生菌資源進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)4株內(nèi)生真菌對(duì)腫瘤的抑制率高于50%。研究表明，雌激素受體的轉(zhuǎn)錄途徑與包括乳腺癌在內(nèi)的多種疾病相關(guān)，異常表達(dá)會(huì)影響代謝通路導(dǎo)致疾病的發(fā)生，疾病水平積累會(huì)導(dǎo)致雌激素受體的消亡，因此臨床上常使用雌激素受體激活劑進(jìn)行治療。廖祖健等[30]研究了金線蓮的內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)三種產(chǎn)物可特異性轉(zhuǎn)錄激活雌激素受體，后續(xù)試驗(yàn)證明其可抑制某些癌細(xì)胞增殖，對(duì)其深入研究有成藥潛能。民族藥是我國(guó)中藥的重要組成部分之一，是少數(shù)民族人民智慧的結(jié)晶，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮了重要的功能。黃益[31]分離了藏藥大花綠絨蒿的4種內(nèi)生真菌，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明其均具有一定的抗腫瘤活性，且活性與結(jié)構(gòu)之間存在相關(guān)性。

4.3 抗菌抑菌作用

微生物的多樣性對(duì)地球生態(tài)環(huán)境的維持至關(guān)重要，然而某些病原微生物的生存會(huì)危害到其他生物的健康。研究表明，某些內(nèi)生真菌的活性產(chǎn)物對(duì)病原微生物會(huì)起到抑制作用。王營(yíng)等[32]對(duì)從廣藿香多部位分離得到的內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)至少20種內(nèi)生真菌具有抗病原菌活性。抑菌試驗(yàn)中常使用大腸桿菌作為供試菌，作為產(chǎn)物的抑菌效果的指標(biāo)。張慧茹等[33]將絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液加入生長(zhǎng)中的大腸桿菌培養(yǎng)液中，觀察到大腸桿菌的形態(tài)發(fā)生了嚴(yán)重的破損，蛋白質(zhì)合成異常，說(shuō)明絞股藍(lán)內(nèi)生真菌對(duì)大腸桿菌有抑制性；王利梅等[34]從金葉女貞中分離內(nèi)生真菌，以大腸桿菌等為試驗(yàn)指示菌株，經(jīng)測(cè)定一半以上的內(nèi)生真菌有抑菌性。也有研究使用其它常見(jiàn)病原菌作為指標(biāo)，劉雷等[35]對(duì)川麥冬進(jìn)行分離得到內(nèi)生真菌，經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)分離的菌株對(duì)白色念珠菌具較強(qiáng)的有抑制活性。張維瑞等[36]研究發(fā)現(xiàn)杜仲中分離得到的內(nèi)生真菌可產(chǎn)生綠原酸，且發(fā)現(xiàn)1株內(nèi)生真菌對(duì)芽孢桿菌抑制率高達(dá)到80%。劉艷明等[37]篩選具有抗炭疽病活性的鐵皮石斛內(nèi)生真菌的菌株，發(fā)現(xiàn)其中三株真菌的平均抑菌率高達(dá)85%以上。除此之外，對(duì)植物病原菌的抑制性也有報(bào)道，卿朕等[38]分離了廣西地不容的內(nèi)生真菌，用有機(jī)溶劑提取發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物使煙草黑脛病菌可溶性蛋白含量降低，說(shuō)明對(duì)其有抑制性。何應(yīng)紅等[39]提取青蒿中的內(nèi)生真菌，以五種常見(jiàn)的獼猴桃病原作為指示菌，研究發(fā)現(xiàn)，50%以上的內(nèi)生真菌對(duì)其都有抑制性。

4.4 其他藥理作用

藥用植物內(nèi)生真菌還可以產(chǎn)生增強(qiáng)免疫力、治療糖尿病等治療作用的活性物質(zhì)。焦志強(qiáng)等[40]以植物絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液中提取的胞外多糖為研究對(duì)象，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究對(duì)肉雞的影響，發(fā)現(xiàn)在飼料中添加胞外多糖，可以使肉雞消化能力加強(qiáng)，提高細(xì)胞免疫和體液免疫的能力，從而增加經(jīng)濟(jì)效益。徐祥林等[41]對(duì)羅漢果內(nèi)生真菌的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶有較好的抑制活性，說(shuō)明它可以制成抗糖尿病藥物。

5 總結(jié)與展望

自古至今，中藥材在疾病治療方面一直發(fā)揮著其不可替代的作用。中藥材的療效歸功于其中含有的天然產(chǎn)物?，F(xiàn)階段，許多天然產(chǎn)物已在臨床使用，如紫杉醇、鬼臼毒素、喜樹(shù)堿等。然而多種天然產(chǎn)物由于獲取途徑的局限性，產(chǎn)量仍然較低，極大阻礙了中藥材及天然產(chǎn)物的應(yīng)用和發(fā)展。中藥材內(nèi)生真菌因其可能含有與中藥材同樣的代謝產(chǎn)物、產(chǎn)量高、可再生性強(qiáng)等特性，在活性天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)和獲取方面具有重要價(jià)值。一方面可以解決現(xiàn)階段中藥材資源匱乏問(wèn)題，另一方面可以提高藥物產(chǎn)量，降低成本及藥物售價(jià)，造福患者。然而，現(xiàn)階段僅有極小部分內(nèi)生真菌資源被開(kāi)發(fā)，許多資源尚處于研究空白狀態(tài)。同時(shí)，僅有不到5%的真菌可在現(xiàn)今通用的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，極多菌種無(wú)法分離得到，人類(lèi)對(duì)微生物世界知之甚少。隨著分子手段的革新，可將高通量測(cè)序技術(shù)與內(nèi)生真菌的分離相結(jié)合，更好的分析微生物群落結(jié)構(gòu)；并加強(qiáng)微生物培養(yǎng)手段的革新，發(fā)掘更多內(nèi)生真菌，為進(jìn)一步豐富人類(lèi)對(duì)中藥材內(nèi)生真菌的認(rèn)識(shí)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，為疾病的治療提供更多途徑。