胖大海潤喉丸治療大鼠口腔潰瘍的實驗研究

喜鵬

（甘肅省定西市第二人民醫(yī)院，甘肅 定西）

0 引言

口腔潰瘍（recurrent oral ulcer，ROU）是口腔黏膜病中的常見病癥，發(fā)病率很高，其發(fā)病特點為在局部形成潰瘍后可繼發(fā)感染，造成潰瘍局部組織炎癥和壞死?？谇粷儾∫驈碗s，可能是多種因素綜合作用的結(jié)果[1-2]，其確切的發(fā)病機制仍處于研究之中，目前尚無較好的治療方法，尤其是相關中醫(yī)藥防治研究尤為薄弱。本研究選用的胖大海潤喉丸由胖大海、桔梗、木蝴蝶、菊花、馬勃5 味藥材組成，具有疏風清熱、解毒利咽之功效。本研究通過觀察胖大海潤喉丸對大鼠口腔潰瘍面積、炎癥因子IL-6、TNF-α 水平及α-SMA、FGF1 蛋白表達含量的研究，以期探討胖大海潤喉丸在ROU 治療中可能的作用機制和臨床應用價值。

1 材料

1.1 實驗動物

6-8 周SPF 級 SD 大鼠，50 只，體質(zhì)量 180～220g，雄性，購于甘肅中醫(yī)藥大學定西校區(qū)科研實驗中心動物培育中心，合格證號為 SCXK（甘）2008-0010。

1.2 藥品及試劑

胖大海潤喉丸（甘藥制字，批號 Z0401082）；IL-6 試劑盒（Peprotech 公司 ）；TNF-α 試劑盒（Peprotech 公司）；冰醋酸（索萊寶公司）；RIPA 美國 Beyotime 公司 P0013C；蛋白酶抑制劑混合物 I AppliChem 公司 A77060001；

BCA 蛋白定量濃度測定試劑盒北京索萊寶公司YG0134；兔抗人α-SMA 多克隆抗體 Immunollay 公司YT0883；兔抗人FAP多克隆抗體Immunollay 公司YT0845；兔抗人 GAPDH 多克隆抗體 杭州賢至生物公司。

1.3 儀器

連續(xù)波長酶標儀（美國 BIO-RAD 公司）；游標卡尺（碧云天公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；蛋白核酸凝膠電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng) 美國 BIO-RAD 公司；電泳儀 （德國Eppendorf 公司）；凝膠成像分析系統(tǒng) 美國 UVP 公司 ；電子分析天平 日本 Shimadzu 公司。

2 方法

2.1 實驗分組

SD 大鼠50 只，隨機分為空白對照組，模型組，胖大海潤喉丸10、30、90mg/kg 組（中劑量為臨床等效劑量），每組10 只。

2.2 大鼠口腔潰瘍模型的制備

參考文獻方法[3-4]并結(jié)合本實驗室前期建立的方法制備大鼠口腔潰瘍模型；將大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）ip 麻醉，于大鼠口腔左側(cè)頰部黏膜下注射10%醋酸，0.1mL/只，對照組注射等量的生理鹽水，24h 后可形成口腔潰瘍。

2.3 胖大海潤喉丸對大鼠口腔潰瘍的治療作

造模成功后第2 天開始給藥，將胖大海潤喉丸研磨成粉，給藥時將藥粉（每只大鼠劑量的1/4）均勻涂于潰瘍面上，剩余藥粉（每只大鼠劑量的3/4）以水溶解后給大鼠灌胃?？瞻讓φ战M給予等量生理鹽水處理，連續(xù)給藥12d。各組大鼠于末次測量后，處死一起測定相關指標。

2.3.1 測量大鼠口腔潰瘍面積的影響

用游標卡尺測量各組大鼠給藥前及給藥后第4、8、12 天的口腔潰瘍的最大橫徑（d1）及最大縱徑（d2），計算瘍面積（潰瘍面積＝π×d1×d2×1/4，π 取值 3.14）。

2.3.2 ELISA 法測定血清中IL-6 及TNF-α 含量

取離心后血清，用 ELISA 法，嚴格按試劑盒說明，檢測患 者血 清 中 IL-6、TNF-α 的 含量( ng·L-1)。

2.3.3 Western blot 檢測潰瘍組織α-SMA、FGF1 蛋白的表達

提取各潰瘍組織蛋白并定量。各組取20 μg 蛋白上樣，經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，4℃分別與一抗α-SMA（1：1000）、FGF1（1：1000）及GAPDH（1：500）蛋白相結(jié)合，搖床過夜；次日分別與山羊抗兔辣根酶標記的二抗（l：5000）結(jié)合反應，ECL 發(fā)光顯色后，凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測，并采用Quantity One 4.6.2 軟件對圖像進行灰度分析，以GAPDH 作內(nèi)參，結(jié)果將目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH 條帶的比值作為參照。

2.4 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 對大鼠口腔潰瘍面積的影響

觀察各組大鼠口腔潰瘍面的大體形態(tài)，結(jié)果顯示無潰瘍出現(xiàn)。注射醋酸后可出現(xiàn)明顯的口腔潰瘍，肉眼觀察潰瘍面的黏膜呈凹陷性缺損，大致呈圓形，表面為黃白色，周圍充血水腫，說明口腔潰瘍模型制備成功。

大鼠口腔潰瘍模型呈現(xiàn)一定自愈性，隨著時間的延長，潰瘍面積逐漸減小。實驗開始時各組大鼠口腔潰瘍面積無顯著性差異；在給藥第 4、8、12 天，與模型組比較，高劑量清咽滴丸組大鼠口腔潰瘍面積均顯著減小，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 清咽滴丸對大鼠口腔潰瘍面積的影響, n=10)

表1 清咽滴丸對大鼠口腔潰瘍面積的影響, n=10)

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，與模型組比較，#P＜0.05

組別 潰瘍面積給藥前 給藥第4 天 給藥第8 天 給藥第12 天空白對照組 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0模型組 28.8±6.4* 26.2±5.4* 16.1±3.2* 8.8±2.1*胖大海低劑量組 27.3±4.8*# 23.5± 3.5*# 14.7±4.3*# 8.0±1.7*胖大海中劑量組 27.2±4.2*# 22.4 ± 3.3*# 15.0±5.5*# 7.3±2.3*#胖大海高劑量組 28.1± 6.0* 14.6± 4.0*# 9.5±4.2*# 4.5±2.2*#

3.2 胖大海對大鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠口腔潰瘍組織中IL-6、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05），說明模型組大鼠出現(xiàn)炎癥反應。與模型組比較，中、高劑量胖大海潤喉滴丸組大鼠口腔潰瘍組織中IL-6、TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見表2。

3.3 胖大海對大鼠口腔潰瘍部位組織中α-SMA、FGF1 水平的影響

結(jié)果顯示（圖11 和表6），與正常組比較，模型組α-SMA、FGF1 蛋白表達均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，各胖大海干預組α-SMA、FGF1 蛋白表達均升高，其中胖大海高劑量組升高最顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清及IL-6 及TNF-a 水平水平比較

表2 各組大鼠血清及IL-6 及TNF-a 水平水平比較

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，與模型組比較，#P＜0.05

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A：BMSCs 組；B: L-6 100ng/mL+50ng/mL 組;C:黃芪多糖干預

表3 胖大海對大鼠口腔潰瘍部位組織中α-SMA、FGF1 水平的影響

4 討論

口腔潰瘍俗稱“口瘡”，是一種常見的發(fā)生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥，發(fā)作時疼痛劇烈，局部灼痛明顯，嚴重者還會影響飲食及語言交流。ROU 是口腔臨床常見多發(fā)病，占口腔潰瘍的90%以上，反復發(fā)作，給患者帶來極大困擾，嚴重影響患者生活質(zhì)量。近來中醫(yī)藥對ROU 的治療已經(jīng)取得了突破性的進展。陳卓等[5]研究發(fā)現(xiàn)清咽滴丸（方中有胖大海、桔梗、梔子、薄荷）可通過抑制口腔潰瘍大鼠TNF-α 水平，減輕大鼠口腔潰瘍面積來加速大鼠口腔潰瘍的愈合。我院制備的胖大海潤喉丸由胖大海、桔梗、木蝴蝶、菊花等加工提煉而成，胖大海，味甘，涼，性寒。能清肺化痰，利咽開音，潤腸通便，為治療咽喉腫痛之要藥；桔梗，味辛、性平，宣肺，利咽，祛痰之功效，對口腔潰瘍有很好的療效；木蝴蝶，具有潤肺利咽的作用；菊花，甘苦，性微寒，具有疏散風熱、清肝明目、清熱解毒的作用。馬勃，其性味辛平，有清肺利咽，止血之功效。上述藥配伍配伍，活血通脈而化瘀，防止瘀血內(nèi)停，清血分實熱，散瘀血留滯；同時全方兼有清熱解毒，涼血斂瘡的功效，配伍具有清而不寒，散而不滯的特點，從而達到防治口腔潰瘍的效果。

眾所周知炎癥因子與復發(fā)性口腔潰病的發(fā)生發(fā)展預后呈相關性，患者無論是漬病組織還是外周血中，都檢測到炎性細胞因子有異常增高或降低的趨勢。細胞因子中TNF-a 及IL-6 均是具有多種生物活性的，由免疫細胞合成分泌的多肽類因子，它們能調(diào)節(jié)多種細胞生理功能，在機體炎癥、免疫應答、急性反應中起著非常重要的調(diào)控作用。IL-6 作為一種多效促炎的細胞因子，由B 淋巴細胞、單核細胞、以及部分腫瘤細胞分泌而成，它參與炎癥以及免疫反應的多功能炎性因子。IL-6 常通過各種途徑促進與參與口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展[6]。Ambrosch A 等[7]認為無論是否存在細菌傷口IL-6 的水平都可作為有用的評估饋痕性炎癥敏感性和特異性的血清學標志物。還有人認為雖然復發(fā)性口腔潰病的治療效果可以通過口腔淸痕數(shù)目，間隔時間和發(fā)生的頻率評估，也可以監(jiān)測血清IL-6 水平來評價藥物的治療效果[8]。TNF-a 主要由單核巨唆細胞產(chǎn)生的細胞因子，可誘導包括自身在內(nèi)的多種細胞因子以及一些炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，損傷組織，繼而加重炎癥反應[9]。張琳[10]等用雙抗體夾心法研究在復發(fā)性口腔淸蕩患者中TNF-a 的變化及臨床意義，發(fā)現(xiàn)復發(fā)性口腔漬蕩患者血清中TNF-a 的含量可明顯增高，提示參與了其病理過程。姜軍松[11]等釆用結(jié)晶紫染色法探討腫瘤壞死因子與復發(fā)性口掩的關系，以細胞作為革細胞，對復發(fā)性口腔潰蕩活動期與緩解期患者及口腔粘膜外傷患者的外周血單個核細胞分泌的水平進行生物活性檢測，表明在致病機理方面占有重要地位。.本實驗結(jié)果表明模型大鼠口腔潰瘍部位組織中IL-6、TNF-α 水平顯著升高，中、高劑量胖大海潤喉丸可使口腔黏膜組織中IL-6、TNF-α 水平明顯下降，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。從而表明胖大海潤喉丸可以通過下調(diào)炎癥因子，減輕口腔潰瘍的程度、促進潰瘍愈合。這與相關文獻[12]報道是相一致的。

近年來有關FGF1、α-SMA 蛋白的異常表達在口腔潰瘍發(fā)生、發(fā)展中的作用備受關注[13]。FGF1 是成纖維生長因子家族的成員之一，可誘導成纖維細胞的增殖生長[14-16]。α-SMA 是活化的成纖維細胞的蛋白標志物，它表達的增高提示著成纖維細胞的活化增多[17-18]。Ya Qing Tan 等[19]認為FGF1 促進組織愈合與其誘導纖維母細胞的增殖分化、促進血管再生以及誘導更多的營養(yǎng)素和氧運送至損傷區(qū)域有關。Lee 等[20]研究發(fā)現(xiàn) Wnt/β-catenin 信號通路在組織愈合上發(fā)揮重要作用，當 β-catenin 的表達下降時，會出現(xiàn) α-SMA 減少，組織愈合緩慢。 α-SMA 的表達還應該受Wnt/β-catenin 信號通路的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，與模型相比較，中、高劑量組胖大海潤喉丸FGF1、α-SMA 的蛋白表達含量均明顯增高（P＜0.05）。表明胖大海潤喉丸可能通過上調(diào)FGF1、α-SMA 蛋白含量，促進潰瘍愈合期成纖維細胞大量活化增殖，參與潰瘍愈合。

綜上所述，胖大海潤喉丸通過降低炎性因子水平，上調(diào)FGF1、α-SMA 蛋白含量，從而促進了口腔潰瘍潰病臨床愈合，縮短病程，減少復發(fā)。顯示了胖大海潤喉丸獨具的特色和優(yōu)勢，具有效果顯著、作用確切等特點，有良好的推廣應用價值。