李曄，胡沁媛，周敏，王聰堯，李健 綜述 萬鵬霞 審校

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.眼科；2.耳鼻喉科，廣州 510080)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種常見的機(jī)會(huì)致病菌，是導(dǎo)致各種醫(yī)院獲得性感染的主要原因，也是眼科感染性致盲眼病的常見病原菌之一。近年來伴隨著多重耐藥性菌株的出現(xiàn)，臨床治療的難度大大增加，目前急需研發(fā)新的治療方法及藥物。銅綠假單胞菌的致病性取決于其產(chǎn)生的毒力因子對(duì)宿主的損傷作用，如彈性蛋白酶(Elastase)、堿性蛋白酶、鞭毛蛋白和外毒素A等[1-2]。隨著人們對(duì)銅綠假單胞菌致病機(jī)制的深入研究，特異性抑制毒力因子逐漸成為一種很有前景的治療方法，毒力因子抑制劑的發(fā)現(xiàn)也為有效治療銅綠假單胞菌感染提供了新希望。

Elastase是一種銅綠假單胞菌主要的毒力因子，它通過水解蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)直接損傷宿主組織結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞間緊密連接損傷上皮屏障功能和降解IgA，補(bǔ)體蛋白和SP-A等免疫分子逃避機(jī)體免疫反應(yīng)，對(duì)銅綠假單胞菌的致病性起至關(guān)重要的作用[3]。

作為銅綠假單胞菌主要的毒力因子，靶向Elastase研發(fā)新型抗毒力因子藥物已成為近年來的研究熱點(diǎn)。銅綠假單胞菌角膜炎發(fā)展速度快、致盲率高，Elastase抑制劑可有效降低銅綠假單胞菌的毒性，緩解病原菌對(duì)角膜組織的破壞，幫助人體免疫系統(tǒng)有效清除病原菌，最大程度地保護(hù)患者視力[4]，是一種非常有前景的治療策略。

1 Elastase的生物學(xué)特性

Elastase是一種由銅綠假單胞菌分泌到胞外的重要的毒力因子，分子質(zhì)量為33 kD，屬于金屬蛋白酶家族。它的合成由lasB基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，而lasB基因的表達(dá)由群體感應(yīng)系統(tǒng)Las和Rhl調(diào)控[5]。Elastase的作用比較廣泛，可水解內(nèi)源肽疏水端的氨基酸殘基。Elastase的致病機(jī)制主要是通過水解宿主體內(nèi)的多種蛋白，調(diào)控宿主免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)生物膜的形成。

1.1 Elastase對(duì)組織蛋白的水解活性

Elastase通過降解層黏連蛋白、纖連蛋白、玻璃體結(jié)合蛋白、III和IV型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白造成宿主組織破壞，為銅綠假單胞菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)[6]。同時(shí)，Elastase破壞細(xì)胞間緊密連接增加上皮間通透性從而破壞上皮屏障功能[7-8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)：Elastase可以通過激活蛋白激酶C信號(hào)通路使Occludin和ZO-1等緊密連接蛋白發(fā)生斷裂，并誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重組，導(dǎo)致上皮屏障功能的破壞。在人鼻上皮細(xì)胞培養(yǎng)過程中，加入Elastase可短暫阻斷氣道上皮屏障，下調(diào)跨膜蛋白Claudin-1，Claudin-4，Occludin，Tricellulin，可短暫降低蛋白酶激活受體(PAR-2)的表達(dá)，但對(duì)緊密連接蛋白ZO-1，ZO-2，黏附連接蛋白E-cadherin，β-catenin無明顯影響；同時(shí)，此過程中PKC，MAPK，PI3K，p38，MAPK，JNK，COX-1，COX-2，NF-κB等不同的調(diào)控緊密連接蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路瞬時(shí)下調(diào)[10]。

1.2 Elastase對(duì)宿主免疫反應(yīng)的調(diào)控作用

Elastase通過降解先天免疫分子、加工細(xì)胞受體和炎癥相關(guān)物質(zhì)調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)。Elastase可降解先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的許多組成部分，比如SP-A，SP-D和補(bǔ)體蛋白，以減少細(xì)胞的吞噬作用，為銅綠假單胞菌的入侵掃清了障礙[11-12]。同時(shí)，Elastase可使TNF-α，IFN-γ和MCP-1等細(xì)胞因子和趨化因子失活，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，破壞宿主的先天防御[13]。在銅綠假單胞菌引起的慢性感染性潰瘍中，Elastase可裂解抗菌肽LL-37使其失活，抑制了抗菌肽與細(xì)菌的結(jié)合，從而抑制了其殺菌活性[14]。同時(shí)，在銅綠假單胞菌感染過程中，Elastase可水解尿激酶激活受體蛋白(uPAR)，降低了細(xì)胞與尿激酶結(jié)合的能力，影響上皮細(xì)胞和白細(xì)胞的黏附和遷移，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[15]。

1.3 Elastase調(diào)節(jié)生物膜的形成

銅綠假單胞菌生物膜的形成是造成其耐藥性的關(guān)鍵原因，lasB過表達(dá)會(huì)干擾銅綠假單胞菌生物膜中細(xì)胞外多聚物的組成和理化性質(zhì)，從而增加細(xì)胞外鼠李糖脂的濃度，導(dǎo)致鼠李糖脂和總碳水化合物含量升高，藻酸鹽含量降低，生物膜疏水性和黏度增強(qiáng)，有助于初始微菌落和三維生物膜結(jié)構(gòu)形成[16]。

綜上，Elastase通過水解蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)破壞宿主正常組織結(jié)構(gòu)與功能，逃避宿主免疫防御和調(diào)節(jié)生物膜形成在銅綠假單胞菌的發(fā)病過程發(fā)揮重要作用，Elastase抑制劑的開發(fā)具有一定治療價(jià)值和巨大的研究前景。

2 毒力因子作為治療靶點(diǎn)的研究現(xiàn)狀

毒力因子是構(gòu)成細(xì)菌毒力的主要物質(zhì)，表示細(xì)菌致病能力的強(qiáng)弱[17]，以細(xì)菌毒力因子為靶點(diǎn)，針對(duì)性的抑制或阻斷細(xì)菌毒力是最近建立的抗微生物策略，抗毒力因子藥物被稱為“第二代”抗生素[18]。

目前有很多研究者致力于抗毒力因子藥物的研發(fā)，并取得了一定的成果，如抑制鼠傷寒沙門氏菌致病力的化合物L(fēng)ED209和抑制霍亂弧菌毒性的人工合成抑制劑Virstatin[19-20]。研究[21-22]發(fā)現(xiàn)：絲氨酸蛋白酶抑制劑可用來治療丙型肝炎[21]，在高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療中引入天冬氨酸蛋白酶抑制劑，可延長(zhǎng)艾滋病毒感染者的生存期，并改善其預(yù)后[22]。革蘭陽性菌轉(zhuǎn)肽酶SrtA是調(diào)控金黃色葡萄球菌致病力的重要蛋白質(zhì)，通過藥物篩選和結(jié)構(gòu)改造，研究者找到全新結(jié)構(gòu)的SrtA抑制劑，有效地抑制SrtA的活性，能夠有效降低金黃色葡萄球菌的毒力。這類小分子化合物在體外不殺菌或者抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，但是在動(dòng)物模型中極大地提高了感染動(dòng)物的生存率[23-24]。

3 Elastase抑制劑的研究現(xiàn)狀

3.1 抗菌藥物及臨床常用藥物

研究[25]發(fā)現(xiàn)：亞抑菌濃度狀態(tài)下[即藥物濃度低于最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)]的紅霉素顯著抑制了Elastase等毒力因子的產(chǎn)生以及生物膜的形成，使銅綠假單胞菌的致病性大大降低。1/2 MIC濃度的哌拉西林/三唑巴坦抑制銅綠假單胞菌的毒力因子、生物膜的形成和氧化應(yīng)激反應(yīng)的敏感性，環(huán)丙沙星(1/4 MIC)在不影響銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的前提下，可抑制銅綠假單胞菌泳動(dòng)能力和Elastase等毒力因子的產(chǎn)生和生物膜的形成[26]，提示β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等抗菌藥物在發(fā)揮殺菌或抑菌活性的同時(shí)，本身具有一定的抗炎作用，且它能調(diào)控細(xì)菌毒力因子以及引起宿主防御反應(yīng)，相同的亞抑菌濃度下，頭孢他啶抑制作用強(qiáng)于環(huán)丙沙星，阿奇霉素強(qiáng)于慶大霉素[27]。

阿司匹林作為臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，在6 mg/mL濃度時(shí)不影響銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)，顯著抑制Elastase、綠膿菌素等毒力因子的產(chǎn)生[28]。黃藤素作為一種中成藥，具有抗菌活性，亦被發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度狀態(tài)下可抑制銅綠假單胞菌Elastase等毒力因子的產(chǎn)生[29]。驅(qū)蟲藥氯硝柳氨和降糖藥——二甲雙胍也可明顯抑制銅綠假單胞菌Elastase等毒力因子合成及生物被膜形成[30]。

綜上，許多臨床常用藥物對(duì)Elastase酶活性具有抑制作用，從而能夠有效減弱銅綠假單胞菌的致病力，提示臨床上治療銅綠假單胞菌感染合并其他疾病時(shí)，在選擇治療其他疾病的藥物時(shí)，可以考慮其對(duì)銅綠假單胞菌毒力因子Elastase的抑制效果，為臨床用藥提供更多了選擇和依據(jù)，但是未來臨床應(yīng)用仍需要進(jìn)一步研究。

3.2 螯合劑

由于Elastase屬于金屬肽酶類，螯合劑能有效去除鋅離子和鈣離子以及與Elastase催化位點(diǎn)相互作用，對(duì)其活性有較大的抑制作用[31]。目前主要應(yīng)用的螯合劑是乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，其能有效阻斷Elastase的蛋白水解活性，但是螯合劑具有劇毒性，臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究。Ca-EDTA是一種毒性較低的螯合劑，已被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于急性和慢性鉛中毒。Ca-EDTA對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的金屬酶有較好的抑制作用，特別是對(duì)Elastase具有顯著的抑制作用。8 μg/mL Ca-EDTA與人肺泡上皮細(xì)胞(A549)共培養(yǎng)，能有效減弱銅綠假單胞菌上清菌液對(duì)其的毒性作用[32]。同時(shí)，小鼠經(jīng)鼻內(nèi)接種銅綠假單胞菌上清液，并接受100 mg/kg Ca-EDTA處理后，存活率高于未處理組，后者在120 h內(nèi)死亡。

考慮到螯合劑對(duì)Elastase酶活性的抑制作用，一些研究者通過將寡肽和金屬螯合部分人工結(jié)合合成新的潛在抑制劑，氨基甲酸酯、磷酸基、硫醇和巰基乙酰基被報(bào)道具有顯著的金屬離子螯合能力，如Cathcart等[33]通過篩選后發(fā)現(xiàn)金屬螯合二肽N-mercaptoacetyl-Phe-Tyr-amide對(duì)Elastase酶活性具有明顯的抑制作用，且除了能抑制其對(duì)人工合成底物的降解，對(duì)Elastase降解天然底物核苷二磷酸激酶(NDK)和IgG也有顯著的抑制作用。同時(shí)，巰基乙酰胺衍生物具有良好的抗Elastase作用，能通過抑制活性位點(diǎn)抑制Elastase的水解作用[34]。

3.3 群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制劑

銅綠假單胞菌通過分泌和和感知群體感應(yīng)信號(hào)分子啟動(dòng)群體感應(yīng)系統(tǒng)，調(diào)控毒力因子的產(chǎn)生。銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)包括4個(gè)子系統(tǒng)：LAS系統(tǒng)、RHL系統(tǒng)、PQS系統(tǒng)和IQS系統(tǒng)。其中LAS系統(tǒng)可調(diào)控Elastase、堿性蛋白酶和外毒素的表達(dá)。RHL系統(tǒng)可調(diào)控鼠李糖脂的形成，而PQS系統(tǒng)可增強(qiáng)Elastase和綠膿菌素的表達(dá)[35]。事實(shí)上，QS各子系統(tǒng)對(duì)于毒力因子的調(diào)控機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜且相互交叉重疊，各毒力因子是否單獨(dú)由某個(gè)基因控制尚不明確，仍需大量實(shí)驗(yàn)論證。

一些研究發(fā)現(xiàn)很多植物中提取的天然化合物因?yàn)槠渑cQS信號(hào)分子結(jié)構(gòu)類似，通過人工改造結(jié)構(gòu)后可發(fā)揮抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用。呋喃酮類化合物是第1個(gè)被描述的群體感應(yīng)分子，其衍生物呋喃酮C-56能夠減少胞外Elastase的表達(dá)和降低殼多糖酶的活性[36]，但是這些藥物的臨床有效性和安全性還仍需進(jìn)一步證實(shí)和研究。

3.4 植物提取物

許多植物提取物體外具有抑制Elastase活性的功效，其中研究較多的是大蒜素，其可抑制銅綠假單胞菌Elastase等毒力因子表達(dá)，減弱其毒力，干擾生物膜分化成熟。并有臨床研究[37]表明：服用大蒜提取物可以顯著改善肺囊性纖維化患者的肺功能、體重和癥狀評(píng)分。植物提取物有希望作為藥物應(yīng)用于臨床抗感染治療，因此越來越多的國(guó)內(nèi)外研究者致力于發(fā)現(xiàn)存在潛在Elastase抑制作用的植物提取物。近年來研究[38]發(fā)現(xiàn)茯苓提取物，姜黃素和黃芩苷等植物提取物都具有Elastase抑制作用。但是這些研究幾乎都只停留在體外實(shí)驗(yàn)，植物提取物的成藥可能性以及臨床有效性和安全性仍需進(jìn)一步證實(shí)和研究。

3.5 人工合成化合物和納米技術(shù)

多種植物中提取的天然化合物因其與Elastase分子結(jié)構(gòu)類似，通過人工改造結(jié)構(gòu)后，可體外抑制Elastase酶活性。納米技術(shù)是目前發(fā)展新型抗毒力因子的熱點(diǎn)，通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件，研究人員可以篩選出能夠與靶蛋白特異性結(jié)合，進(jìn)而抑制信號(hào)分子的人工合成酶[39]。氧化鋅納米粒子(ZnO2-NPs)可有效抑制Elastase酶活性，200 μg/mL ZnO2-NPs可完全抑制Elastase的水解作用，并可促進(jìn)皮膚傷口愈合，減少潰瘍的發(fā)生、發(fā)展。為降低納米材料的毒性，從植物提取物中提取生物分子與金屬離子的結(jié)合在納米材料的生物合成中得到了廣泛的研究。由于金屬離子的穩(wěn)定性，生物納米化合物的制備提高了納米化合物的安全性和穩(wěn)定性。NS-ZnNPs是一種從黑種草籽萃取合成的生物納米化合物，它可以有效抑制銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，減少Elastase的產(chǎn)生，從而減弱銅綠假單胞菌的致病力[40]。高度生物相容的G-Ag NPs的基質(zhì)內(nèi)給藥顯著減輕了兔眼金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)菌性角膜炎和細(xì)菌感染誘導(dǎo)的角膜新生血管形成，但是對(duì)于銅綠假單胞菌角膜炎的治療效果有待于進(jìn)一步研究[41]。納米技術(shù)的應(yīng)用有利于新型抗毒力因子藥物的研發(fā)，但是其臨床應(yīng)用的有效性及安全性仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

隨著耐藥菌株的出現(xiàn)，新的抗銅綠假單胞菌感染藥物的研究越來越緊迫，抗細(xì)菌毒力因子的治療策略提供了一個(gè)新的對(duì)抗細(xì)菌感染的治療方法，這種治療方式不直接殺死細(xì)菌，而是解除其武裝或削弱細(xì)菌的毒力，幫助人體的免疫系統(tǒng)有效清除病原菌，不僅對(duì)細(xì)菌具有很小的選擇壓力，不易產(chǎn)生耐藥菌株，并且對(duì)人體正常菌群影響較小[42-44]，具有巨大的研究前景。作為銅綠假單胞菌主要的毒力因子，Elastase在銅綠假單胞菌毒力中的關(guān)鍵作用使其成為開發(fā)抑制劑作為抗微生物劑的潛在靶標(biāo)。Elastase抑制劑可以與抗生素聯(lián)合使用，以最大限度地發(fā)揮抗菌作用，減弱銅綠假單胞菌的致病力，改善臨床上銅綠假單胞菌感染患者的預(yù)后[45-46]。目前已有一種Elastase抑制劑吸入制劑進(jìn)入臨床前期試驗(yàn)，用于治療囊性纖維化患者慢性銅綠假單胞菌感染，現(xiàn)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的第一階段[47]。早期Burns等[48]的研究證實(shí)了Elastase抑制劑治療銅綠假單胞菌角膜炎動(dòng)物模型的有效性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)人工合成的Elastase抑制劑膦酰二肽對(duì)Elastase也有較強(qiáng)的抑制作用，并將Elastase酶溶液與磷酰胺共接種至兔眼，可使彈力酶相關(guān)性角膜損傷延遲12 h[49]。Kawaharajo等[50]將人工合成巰基乙酰胺衍生物制成眼藥水劑型用來治療銅綠假單胞菌性角膜炎，并獲得了專利，但是由于存在安全性不足等局限性，Elastase抑制劑的藥物開發(fā)仍需進(jìn)一步研究。盡管靶向Elastase研發(fā)抗毒力因子藥物治療銅綠假單胞菌感染是一個(gè)非常具有前景的治療策略，但是Elastase抑制劑的藥物研究才剛剛開始，在眼科方面應(yīng)用相對(duì)較少，它的臨床應(yīng)用仍然需要很長(zhǎng)一段路要走，相信隨著對(duì)銅綠假單胞菌致病機(jī)制的深入了解，我們能有效應(yīng)對(duì)“后抗生素”時(shí)代的到來。