(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

糖尿病(Diabetes mellitus)是一種以高血糖為主要特征的代謝疾病,長期的高血糖可對人體的多個臟器造成損傷,進(jìn)而引起一系列并發(fā)癥,目前糖尿病已成為除癌癥與心腦血管疾病外對人類生命的又一大威脅[1]。孔石莼多糖(Ulvapertusapolysaccharides,UP)是大型綠藻孔石莼的主要生理活性物質(zhì)[2],研究表明,UP具有降血糖[3]、抗腫瘤[4]、降血脂[5]、抗氧化[6]、調(diào)節(jié)免疫功能[7]等多種生理活性。鋅作為人體必需的微量元素,同時也是胰島素的重要組成部分[8],補(bǔ)鋅對糖尿病及其并發(fā)癥的治療有著良好的促進(jìn)作用[9]。將天然多糖與鋅進(jìn)行絡(luò)合改性,在保留各自獨(dú)特生理活性的基礎(chǔ)上,還可使其共同的活性協(xié)同增效,在保健品、藥品等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[10-11]。然而目前,尚未有研究人員對孔石莼多糖鋅絡(luò)合物(Ulvapertusapolysaccharides-zinc complex,UPZ)的相關(guān)生理活性進(jìn)行探索。

基于此,本研究采用鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)建立Ⅰ型糖尿病小鼠模型,以UP為參照物,以UPZ為試材,通過灌胃給藥試驗(yàn),從臟器指數(shù)、血糖、血脂代謝,體內(nèi)抗氧化等方面綜合評價UP及UPZ對糖尿病小鼠糖脂代謝及抗氧化能力的干預(yù)作用,為UP及UPZ的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

UP(多糖含量53.35%)、UPZ(鋅含量約為10%) 均為實(shí)驗(yàn)室自制,制備方法見參考文獻(xiàn)[12];STZ 上海源葉生物科技有限公司;鹽酸二甲雙胍緩釋片 天方藥業(yè)有限公司;硫酸鋅 恒鑫食品配料有限公司;甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒 南京建成生物工程研究所;清潔級ICR雄性小鼠,體重(25±2) g 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院,SYXK(閩)2018-0006。

HGM-114血糖儀、血糖試紙 歐姆龍有限公司;CF15RN高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;SYNERGY酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司;UV-1800PC紫外可見光分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司;BSA223S分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Ⅰ型糖尿病鼠的建模 參考相關(guān)文獻(xiàn),并稍作修改[13-14]。健康ICR小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后,禁食16 h,隨機(jī)選取10只作為正常組,其余小鼠以200 mg/kg·BW的劑量腹腔注射10 mg/mL的STZ溶液(0.1 mol/L pH=4.3檸檬酸緩沖液配制),正常組小鼠注射同體積檸檬酸緩沖液;注射72 h后,斷尾采血,測定小鼠空腹血糖(取血前,小鼠禁食12 h),血糖≥11.1 mmol/L的小鼠視為造模成功,確定為Ⅰ型糖尿病鼠,未成模小鼠剔除。

1.2.2 分組與給藥 取造模成功的糖尿病小鼠81只,隨機(jī)分為9組,每組9只,分別是模型對照組,UP與UPZ低、中、高劑量組(劑量均依次為:75、150、300 mg/kg BW/d),無機(jī)鋅(硫酸鋅)對照組(按鋅含量計15 mg/kg BW/d),陽性對照組(鹽酸二甲雙胍300 mg/kg BW/d);其中硫酸鋅劑量的設(shè)置以成人硫酸鋅片每天治療攝入量(300 mg,其中鋅含量68 mg)為依據(jù),并參考前人研究[15],按照人與試驗(yàn)動物等效劑量系數(shù)換算得到;UPZ低、中、高劑量的鋅含量分別設(shè)為硫酸鋅含量的0.5、1、2倍。所有小鼠每天固定時間灌胃給藥1次,各組均按0.15 mL/10 g BW持續(xù)灌胃4周;模型組與正常組每日灌胃蒸餾水,給藥組分別對應(yīng)灌胃上述的試樣溶液。

1.2.3 小鼠體重測定 從灌胃給藥開始后,每周對各組小鼠的體重進(jìn)行測定。

1.2.4 小鼠空腹血糖測定 灌胃給藥0、2、4周后,各組動物均禁食12 h,剪尾采血,測定空腹血糖值。

1.2.5 小鼠糖耐量測定 灌胃給藥4周后,各組小鼠禁食12 h,分別按2 g/kg BW的劑量灌胃葡萄糖(配制成濃度為133 mg/mL的溶液),剪尾采血,分別測定0、30、60、120 min 時的血糖值,觀察各組小鼠在喂食葡萄糖后各時間點(diǎn)的血糖水平變化,并按照下列公式計算血糖曲線下面積(Area under the curve,AUC)[16]。

式中,A、B、C、D分別為灌胃葡萄糖溶液0、30、60、120 min時小鼠的血糖值。

1.2.6 小鼠臟器指數(shù)測定 小鼠灌胃給藥4周后,禁食12 h,稱重。引頸法處死小鼠,迅速摘除其脾臟、肝臟、腎臟,使用生理鹽水漂洗后濾紙吸干、稱重,按照以下公式計算其臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(mg/g)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

1.2.7 小鼠血清血脂指標(biāo)測定 灌胃給藥4周后,各組小鼠禁食12 h,采用眼球摘除法取各試驗(yàn)組小鼠的血液,靜置,待其分層后,以3000 r/min離心10 min,取上清液得血清。按照試劑盒說明測定其血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C濃度。

表1 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物對糖尿病小鼠體重的影響Table 1 Effects of UP and UPZ on weight of diabete mice

注:與正常組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)；與陽性對照組相比，▲表示差異顯著(P<0.05)，▲▲表示差異極顯著(P<0.01)；與硫酸鋅對照組相比，Δ表示差異顯著(P<0.05)，ΔΔ表示差異極顯著(P<0.01)。表2～表6同。

1.2.8 小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)測定 準(zhǔn)確剪切一定質(zhì)量的肝臟組織,按質(zhì)量體積比(g∶mL)1∶9加入冰生理鹽水,研磨成濃度10%的肝臟勻漿,于冷凍離心機(jī)4 ℃、3000 r/min下離心10 min,收集上清液,按試劑盒說明對小鼠肝臟組織中MDA含量、CAT、SOD、GSH-Px活性進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用軟件DPS v7.05對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,各組數(shù)據(jù)之間的多重比較使用LSD法,其中,以P>0.05為差異不顯著,P<0.05為顯著,P<0.01為極顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。因在試驗(yàn)過程中有個別小鼠死亡,各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)以n=8進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖尿病小鼠造模情況

與正常組小鼠相比,各組經(jīng)過STZ造模的小鼠精神萎靡、行動遲緩,其進(jìn)食、飲水、排尿量明顯增多,墊料容易潮濕,符合糖尿病患者“三多”的典型癥狀;經(jīng)測定,各組小鼠空腹血糖均高于11.1 mmol/L,說明糖尿病小鼠造模成功。

2.2 UP與UPZ對糖尿病小鼠體重的影響

多飲、多食、多尿、身體消瘦是糖尿病人常見的癥狀,即俗稱的“三多一少”[17-18]。從表1中可以看出,在試驗(yàn)開始時,與正常組小鼠相比,其余各組病鼠體重均極顯著(P<0.01)下降。灌胃4周后,正常組小鼠的體重逐漸上升,模型組病鼠體重則呈下降趨勢,推測該現(xiàn)象為糖尿病引發(fā)病鼠機(jī)體代謝紊亂所致。灌胃4周后,除UP低劑量組外,UP中、高劑量組、UPZ低劑量組病鼠的體重顯著(P<0.05)高于模型組,UPZ中、高劑量組病鼠的體重則極顯著(P<0.01)高于模型組,且UPZ中、高劑量組病鼠的體重與陽性對照組無顯著差異(P>0.05),甚至略高,說明UP、UPZ對糖尿病小鼠的體重減輕均有一定減緩作用;且同劑量下,UPZ的效果顯著(P<0.05)優(yōu)于UP,中劑量UPZ的效果顯著(P<0.05)優(yōu)于鋅含量相同的硫酸鋅。

2.3 UP與UPZ對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

表2可以看出,灌胃前,STZ造模的各組病鼠的空腹血糖濃度均極顯著(P<0.01)高于正常組小鼠,且各造模組之間無顯著差異(P>0.05)。在試驗(yàn)周期內(nèi),正常組小鼠的血糖無顯著(P>0.05)變化,而模型組病鼠的血糖則一直處于較高水平。第4周,除UP低劑量組病鼠的空腹血糖顯著(P<0.05)低于模型組外,其余各給藥組病鼠的空腹血糖均極顯著(P<0.01)低于模型組,并呈明顯的量效關(guān)系;其中UP高劑量組、UPZ中、高劑量組病鼠的空腹血糖與陽性對照組無顯著差異(P>0.05),且UPZ高劑量組病鼠的空腹血糖顯著(P<0.05)低于同劑量的UP組,說明UPZ比UP具有更好干預(yù)病鼠血糖上升的效果。

表2 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物 對糖尿病小鼠空腹血糖的影響Table 2 Effects of UP and UPZ on blood glucose of diabetes mice

2.4 UP與UPZ對糖尿病小鼠糖耐量的影響

糖耐量即是指動物體對血糖濃度的調(diào)節(jié)能力[19]。從表3可看出,灌胃葡萄糖溶液后,各組小鼠的血糖均上升,并在60 min左右均達(dá)到峰值,在60～120 min內(nèi),各組小鼠血糖呈下降趨勢;至120 min,正常組小鼠的血糖與0 min時已無顯著差異(P>0.05),而其余各組病鼠的血糖仍顯著(P<0.05)高于0 min,其中,UP低劑量組病鼠的血糖顯著(P<0.05)低于模型組,其余各給藥組病鼠的血糖則極顯著(P<0.01)低于模型組。AUC是一種反映血糖水平的指標(biāo),相較于單點(diǎn)的血糖值,通過計算AUC可更為全面地分析血糖變化的時間和程度,其值越小,說明糖耐量越強(qiáng)。結(jié)合AUC值可發(fā)現(xiàn),模型組病鼠的AUC極顯著(P<0.01)大于正常組小鼠,說明STZ誘導(dǎo)的糖尿病明顯損傷了小鼠的糖代謝機(jī)能;而各給藥組病鼠的AUC除UP低劑量組顯著(P<0.05)小于模型組外,均極顯著(P<0.01)小于模型組;其中UPZ中、高劑量組小鼠的AUC與陽性對照組無顯著差異(P>0.05);但各給藥組與正常組間仍存在極顯著差異(P<0.01)。結(jié)果表明,UPZ改善糖尿病小鼠血糖代謝,提高其糖耐量的效果優(yōu)于UP。

表3 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物對糖尿病小鼠糖耐量的影響Table 3 Effects of UP and UPZ on glucose tolerance of diabetes mice

表4 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響Table 4 Effects of UP and UPZ on organ index of diabetes mice

2.5 UP與UPZ對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響

在糖尿病患者過于亢進(jìn)的糖代謝下,作為糖代謝的最重要器官,肝臟、腎臟往往會發(fā)生腫大[20];而當(dāng)糖尿病導(dǎo)致生物體免疫功能損傷時,機(jī)體最大的免疫器官脾臟則會發(fā)生器官萎縮[21];因此通過對臟器指數(shù)的測定,可以較為直觀地體現(xiàn)機(jī)體器官受糖尿病損傷的程度。從表4可以看出,與正常組相比,模型組病鼠的肝臟、腎臟指數(shù)極顯著(P<0.01)升高,脾臟指數(shù)極顯著(P<0.01)降低。UP中劑量組、UPZ低劑量組病鼠的肝臟指數(shù)顯著(P<0.05)低于模型組,而UP高劑量組、UPZ中、高劑量組病鼠的肝臟指數(shù)則極顯著(P<0.01)低于模型組。且UP與UPZ高劑量組病鼠的肝臟指數(shù)與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)。UP高劑量、UPZ中劑量組病鼠的腎臟指數(shù)顯著(P<0.05)低于模型組,而UPZ高劑量組小鼠的腎臟指數(shù)極顯著(P<0.01)低于模型組,且三者與陽性對照組均無顯著差異(P>0.05)。各給藥組病鼠的脾臟指數(shù)較模型組均有不同程度地上升,但并未產(chǎn)生顯著差異(P>0.05)。綜上,UPZ對受試糖尿病小鼠臟器損傷的修復(fù)作用優(yōu)于同劑量的UP。

2.6 UP與UPZ對糖尿病小鼠血清血脂指標(biāo)的影響

胰島素不僅對糖代謝至關(guān)重要,同時也是脂代謝不可或缺的調(diào)節(jié)激素。大量研究表明,糖尿病的發(fā)生常常導(dǎo)致血脂代謝紊亂[22]。從表5可知,除陽性對照組病鼠血清的HDL-C與正常組無顯著差異(P>0.05)外,其他各組病鼠血清的TC、TG、LDL-C均較正常組極顯著(P<0.01)上升,而HDL-C則均極顯著(P<0.01)降低。相較模型組,UP高劑量組、UPZ中、高劑量組病鼠血清的TC、TG、LDL-C均極顯著(P<0.01)降低,HDL-C均極顯著(P<0.01)上升;UP中劑量組病鼠血清的TG顯著(P<0.05)降低,HDL-C極顯著(P<0.01)上升;而UPZ低劑量組病鼠血清的LDL-C極顯著(P<0.01)降低,HDL-C極顯著(P<0.01)上升。

表5 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物對糖尿病小鼠血脂的影響Table 5 Effects of UP and UPZ on blood lipids of diabetes mice

表6 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物對糖尿病小鼠抗氧化能力的影響Table 6 Effect of UP and UPZ on antioxidant function of diabetes mice

提示兩試樣對病鼠血脂代謝的紊亂均有一定的校正作用,且校正程度與劑量呈正相關(guān)關(guān)系,其中UPZ高劑量組病鼠血清的TG、LDL-C、HDL-C與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)。從表5中還可獲悉,UPZ中劑量組病鼠的各項(xiàng)血脂指標(biāo)值優(yōu)于鋅含量相同的硫酸鋅組,特別是TG較硫酸鋅組顯著(P<0.05)降低;且UPZ各劑量組病鼠血清的TC、LDL-C顯著(P<0.05)低于相應(yīng)劑量UP組,說明UPZ對糖尿病小鼠的血脂代謝的校正作用較UP顯著(P<0.05)增強(qiáng)。

2.7 UP與UPZ對糖尿病小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

機(jī)體內(nèi)過量自由基的氧化作用與其衰老、疾病等有著直接的聯(lián)系。CAT、SOD、GSH-Px為生物體內(nèi)十分重要的抗氧化酶,具有抑制自由基產(chǎn)生、減少氧化損傷的作用[23-24]。MDA則是機(jī)體自由基作用于脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)物。通過對這些指標(biāo)進(jìn)行測定,可以直觀地反映機(jī)體的抗氧化能力,其中抗氧化酶活性越強(qiáng),MDA含量越低,說明機(jī)體對氧化作用的抑制能力越強(qiáng),即抗氧化能力越強(qiáng)。表6數(shù)據(jù)顯示,與正常組相比,模型組病鼠肝臟CAT、SOD、GSH-Px的活性均極顯著(P<0.01)降低,而MDA含量極顯著(P<0.01)增加,說明STZ誘導(dǎo)的糖尿病使小鼠肝臟的抗氧化能力受到明顯損傷。經(jīng)過4周的灌胃,除UP低、中劑量組外,其余各給藥組小鼠肝臟的CAT、SOD、GSH-Px活性均極顯著(P<0.01)高于模型組,MDA含量均極顯著(P<0.01)低于模型組;而UP中劑量組小鼠肝臟的CAT、GSH-Px活性亦顯著(P<0.05)高于模型組;說明兩試樣對糖尿病小鼠的肝臟抗氧化能力均有一定的改善作用,且存在明顯的量效關(guān)系。另外,UPZ的改善效果極顯著(P<0.01)強(qiáng)于同劑量的UP。中劑量UPZ對病鼠肝臟MDA含量、CAT活性的改善效果顯著(P<0.05)強(qiáng)于鋅含量相同的硫酸鋅,對SOD活性的改善效果極顯著(P<0.01)強(qiáng)于鋅含量相同的硫酸鋅。

3 討論與結(jié)論

糖尿病主要分為Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠期糖尿病等。Ⅰ型糖尿病盡管發(fā)病率較低,但起病急驟、癥狀嚴(yán)重,患者生活質(zhì)量差,且其病理機(jī)制尚存在許多不明確之處,故進(jìn)行Ⅰ型糖尿病的研究對糖尿病防治領(lǐng)域具有重要的意義[25]。胰島素的絕對缺乏是Ⅰ型糖尿病最主要的生理特征,缺乏胰島素的調(diào)節(jié),動物體利用和轉(zhuǎn)化葡萄糖的過程將受到抑制,從而導(dǎo)致血糖升高和一系列并發(fā)癥。

長期的高血糖會導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過高的糖化反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生與發(fā)展,從而對各個臟器造成慢性損傷,并導(dǎo)致機(jī)體的抗氧化能力下降[26-27]。同時,胰島素對脂質(zhì)代謝亦有重要的調(diào)節(jié)作用,當(dāng)機(jī)體缺乏胰島素時,脂肪合成減少,分解加強(qiáng),從而引起血脂升高,故糖尿病患者在血糖升高的同時往往會出現(xiàn)血脂代謝紊亂。迄今為止,有關(guān)天然多糖對糖尿病的治療效果表明,多糖對糖尿病的干預(yù)作用機(jī)制主要包括:促進(jìn)機(jī)體胰島β細(xì)胞再生,改善胰島素分泌;恢復(fù)胰島素抵抗,提高其作用效率;改善免疫系統(tǒng)和抗氧化能力;調(diào)節(jié)糖脂代謝,促進(jìn)機(jī)體對葡萄糖的吸收利用等[28-30]。本研究結(jié)果顯示,UPZ與UP均可有效緩解糖尿病小鼠的“三多一少”癥狀,降低其空腹血糖,提高糖耐量;同時降低病鼠血清中的TC、TG、LDL-C濃度,提高HDL-C濃度,改善其血脂指標(biāo),推測兩試樣可能可以促進(jìn)病鼠胰島β細(xì)胞的修復(fù)和再生,改善胰島素的分泌,在一定程度上緩解糖尿病小鼠的糖脂代謝紊亂[31];UPZ與UP還可降低糖尿病小鼠的肝臟、腎臟指數(shù),說明兩者對病鼠的肝臟、腎臟具有保護(hù)和修復(fù)作用,可拮抗高血糖對臟器造成的慢性損傷,抑制代謝器官的腫大[32];此外二者還可顯著(P<0.05)提升糖尿病小鼠肝臟中CAT、SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性,降低MDA含量,通過增強(qiáng)病鼠體內(nèi)抗氧化酶的活性,恢復(fù)其清除自由基的能力,減輕氧化應(yīng)激對小鼠機(jī)體的損害,也是兩者改善糖尿病小鼠各項(xiàng)癥狀的途徑之一[33]。

本研究結(jié)果表明,UPZ對Ⅰ型糖尿病小鼠糖脂代謝與體內(nèi)抗氧化的干預(yù)效果均明顯強(qiáng)于同劑量的UP;而且中劑量UPZ的干預(yù)效果亦明顯強(qiáng)于鋅含量相同的硫酸鋅(無機(jī)鋅),推測可能是UP與鋅絡(luò)合后,不僅提高了原多糖降血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化等活性,同時亦增強(qiáng)了鋅的生理活性。UPZ作為一種新型的生物補(bǔ)鋅劑,具備良好的生理活性,在食品、保健品等領(lǐng)域有著廣闊的開發(fā)前景。