楊建華，王曉鵬，楊 筱，張一輝

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009）

肛瘺是肛腸科常見疾病之一，手術(shù)是其唯一根治的辦法，但術(shù)后創(chuàng)面大、愈合時(shí)間長成為影響肛瘺術(shù)后臨床療效的主要問題[1]。雖然目前臨床上各種保留括約肌等微創(chuàng)手術(shù)層出不窮，但傳統(tǒng)手術(shù)方法仍無可替代[2]。肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的愈合療效在一定程度上影響著患者的生活質(zhì)量，由于肛瘺術(shù)后創(chuàng)面長期受糞便污染，部分患者的愈合時(shí)間常常超過4 周，相當(dāng)于西醫(yī)學(xué)定義的慢性創(chuàng)面[3]。對于慢性創(chuàng)面延遲愈合的機(jī)制研究，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與創(chuàng)面受到反復(fù)病原微生物污染導(dǎo)致的持續(xù)炎癥刺激有關(guān)，這些促炎細(xì)胞因子的過度表達(dá)，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）等，均不利于創(chuàng)面的愈合[4]。紫黃生肌膏為我科傳統(tǒng)制劑，由我院省名老中醫(yī)黃禮主任中醫(yī)師所創(chuàng)，臨床使用多年，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的作用[5-6]。因此，我們通過建立大鼠人糞污染創(chuàng)面模型，觀察紫黃生肌膏對于大鼠人糞污染創(chuàng)面愈合及炎癥因子的影響，探討紫黃生肌膏的促愈機(jī)制，并為臨床使用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

雌性4～5 周SD 大鼠84 只，單籠飼養(yǎng)，溫度：（23±4）℃，濕度：（55±5）%。紫黃生肌膏由南京中醫(yī)藥大學(xué)蘇州附屬醫(yī)院藥劑科制備，組方：紫草15 g，大黃10 g，白芷15 g，甘草30 g，當(dāng)歸身30 g，血竭12 g，珍珠粉6 g，白蠟60 g，麻油500 g。重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（商品名：貝復(fù)濟(jì)）由珠海億勝生物制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為：63 000 IU/15 mL，國藥準(zhǔn)字S10980077，產(chǎn)品批號：01171101。糞液的制備：選取正常人的糞便10 g，加入到10 mL 生理鹽水中，攪拌均勻后用離心機(jī)離心，取其上清液，每天現(xiàn)配現(xiàn)用。中性樹（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，10004160）；二甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，1330-20-7）；Rat-TNF-α（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，KGERC102a）；Rat-IL-6（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，KGERC003）；生物倒置顯微鏡（Olympus,BX41）；生物熒光顯微鏡（Olympus,BX43）；酶標(biāo)儀（MD SpectraMax M3）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模 參照付小兵[7]、鄭雪平[8]的造模方法，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，備皮區(qū)用碘伏常規(guī)消毒，用直徑為1.8 cm 的圓形印章分別在大鼠的脊柱兩側(cè)約2 cm 處做一標(biāo)記，然后依據(jù)標(biāo)記制作2 個(gè)圓形創(chuàng)面，深度約0.3 cm，基本達(dá)肌層，壓迫止血后，將約1 mL 糞液涂在創(chuàng)面上，包扎固定。48 h 后去除覆蓋物，觀察創(chuàng)面見傷口有黃膿性分泌物，有糞臭味者為造模成功。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將所有大鼠進(jìn)行數(shù)字編號后按照隨機(jī)數(shù)字表法分成4 組：正常組21 只、模型組21 只、貝復(fù)濟(jì)組21 只和紫黃生肌膏組21 只。

2.3 給藥方法 造模成功后，按照 組別及分組方案開始用藥，各組每天換藥前0.5 h 在創(chuàng)面涂抹糞液1 mL，保持0.5 h 后統(tǒng)一換藥，均常規(guī)用呋喃西林消毒清潔創(chuàng)面。正常組：剪開創(chuàng)面，不涂糞液，外敷無菌紗布，換藥1 次/d；模型組：每天涂抹糞液，外敷無菌紗布，換藥1 次/d；貝復(fù)濟(jì)組：每天涂抹糞液，用貝復(fù)濟(jì)（60 U/cm2）浸潤的紗布敷在創(chuàng)面上，換藥1 次/d；紫黃生肌膏組：每天涂抹糞液，用紫黃生肌膏（0.2 g/cm2）浸潤的紗布敷在創(chuàng)面上，換藥1 次/d。

2.4 取材 用藥后第3、7、14 d 分批次隨機(jī)處死5只大鼠，取大鼠創(chuàng)面中心至創(chuàng)緣部分的肉芽組織，約0.5 cm×0.5 cm，常規(guī)石蠟切片處理。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 84 只大鼠術(shù)后應(yīng)用糞液造模，在48 h 后出現(xiàn)個(gè)別大鼠死亡現(xiàn)象，其中模型組死亡2 只，貝復(fù)濟(jì)組和紫黃生肌膏組各死亡大鼠1 只。其余造模成功大鼠均正常進(jìn)食和飲水，狀態(tài)良好，背部創(chuàng)面見創(chuàng)緣組織水腫及少許滲液和膿苔覆蓋。貝復(fù)濟(jì)組和紫黃生肌膏組創(chuàng)面生長速度較快，肉芽組織色澤好轉(zhuǎn)迅速，肉芽填充速度較模型組快，組織水腫亦較模型組好轉(zhuǎn)快。用藥后第3 d 除正常組大鼠創(chuàng)面肉芽新鮮，色澤紅潤，其余各組大鼠的感染創(chuàng)面色澤均晦暗，創(chuàng)面滲液較多，創(chuàng)緣少許炎性水腫，創(chuàng)面壞死組織較多，尤以模型組大鼠創(chuàng)面較為明顯；用藥后第7 d 見正常組愈合最快，模型組愈合最慢，貝復(fù)濟(jì)組和紫黃生肌膏組的創(chuàng)面較模型組創(chuàng)面色澤稍好，滲液減少，創(chuàng)緣組織水腫好轉(zhuǎn)；用藥后第14 d 正常組大鼠創(chuàng)面較前明顯縮小，紫黃生肌膏組和貝復(fù)濟(jì)組的創(chuàng)面較模型組愈合快，創(chuàng)緣毛發(fā)生長亦較快，肉芽組織填充明顯。

3.2 各組創(chuàng)面愈合率比較 見表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較情況（） %

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較情況（） %

注：與模型組比較，## P ＜0.01；與貝復(fù)濟(jì)組比較，△△P ＜0.01

3.3 各組創(chuàng)面肉芽組織TNF-α 表達(dá)的變化 見表2。

表2 各組大鼠創(chuàng)面TNF-α 表達(dá)的變化（，n=5） pg/mL

表2 各組大鼠創(chuàng)面TNF-α 表達(dá)的變化（，n=5） pg/mL

注：與模型組比較，## P ＜0.01；與貝復(fù)濟(jì)組比較，△△P ＜0.01

3.4 各組創(chuàng)面肉芽組織IL-6 表達(dá)的變化 見表3。

表3 各組大鼠創(chuàng)面IL-6 表達(dá)的變化（，n=5） pg/mL

表3 各組大鼠創(chuàng)面IL-6 表達(dá)的變化（，n=5） pg/mL

注：與模型組比較，## P ＜0.01；與貝復(fù)濟(jì)組比較，△△P ＜0.01

4 討論

傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及很多相互依賴和重疊的階段，包括止血、炎癥、增殖、血管化、基質(zhì)生成和重塑等[9]。許多類型的細(xì)胞參與傷口愈合的每個(gè)階段，包括免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，這些細(xì)胞在基因表達(dá)和表型上發(fā)生了顯著變化[10]。但某些急性或慢性傷口可導(dǎo)致炎癥加劇，破壞創(chuàng)面的連續(xù)反應(yīng)，從而延遲創(chuàng)面的愈合過程，并造成疤痕[11]。然而，完全抑制炎癥可能導(dǎo)致傷口愈合受損，因?yàn)檠装Y是刺激傷口愈合中增殖階段所必需的[12]。因此，控制炎癥對于更好的傷口愈合至關(guān)重要。

在傷口愈合過程中，TNF-α 和IL-6 是主要的再上皮化和炎癥介質(zhì)啟動(dòng)因子，直接或間接（通過誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子和生長因子）影響成纖維細(xì)胞功能的修復(fù)作用[13]。雖然TNF-α 能刺激皮膚成纖維細(xì)胞增殖，但它能阻止內(nèi)皮細(xì)胞增殖并導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。低水平的TNF-α 可以間接刺激炎癥，增加巨噬細(xì)胞產(chǎn)生生長因子，從而增強(qiáng)傷口愈合[14]。持續(xù)性炎癥和組織破壞則是由TNF-α 的過度產(chǎn)生引起的。眾所周知，過度炎癥是損傷創(chuàng)面愈合的重要原因之一，長期升高TNF-α可通過增加成纖維細(xì)胞凋亡和減少金屬蛋白酶組織抑制劑、生長因子和膠原的表達(dá)而導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合[15-16]。IL-6 同樣是一種促炎和抗炎的細(xì)胞因子，主要來源是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和Th2 細(xì)胞等，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進(jìn)膠原沉積和血管生成中起重要作用[17]。IL-6 參與了傷口愈合的各個(gè)階段，其過度激活或抑制均可影響創(chuàng)面的愈合進(jìn)程[18]。在本實(shí)驗(yàn)中，第3 d 模型組大鼠人糞污染創(chuàng)面TNF-α 和IL-6 的表達(dá)量明顯高于正常組（P＜0.01），說明大鼠創(chuàng)面在人糞污染后局部炎癥反應(yīng)明顯加重，創(chuàng)面中的TNF-α 和IL-6 等促炎細(xì)胞因子明顯升高，處于過度激活狀態(tài)，從而會導(dǎo)致了創(chuàng)面的延遲愈合。通過第7 d 和第14 d 的創(chuàng)面愈合率情況，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型組創(chuàng)面的愈合進(jìn)程較慢，明顯低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

紫黃生肌膏由我院省名老中醫(yī)黃禮主任中醫(yī)師根據(jù)生肌玉紅膏化裁而來，生肌玉紅膏出自《外科正宗》，乃歷代瘡家之圣藥，臨床治療慢性創(chuàng)面療效顯著[19]。但近年來因傳統(tǒng)制劑中多含有輕粉等有毒成分，臨床使用受限，許多效果較好的名方驗(yàn)方漸淡出臨床。為了繼承和發(fā)揚(yáng)祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，在結(jié)合現(xiàn)代藥理基礎(chǔ)之上，黃禮主任中醫(yī)師去除生肌玉紅膏中的輕粉，加入了大黃和珍珠粉。研究表明，大黃外用具有抑菌抗炎、收斂生肌功效，能夠抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌以及銅綠假單胞菌等的生長[20]?，F(xiàn)代臨床中大黃外治多用于慢性下肢潰瘍、糖尿病足感染、慢性竇道等疾病，白明等[21]通過實(shí)驗(yàn)觀察外用大黃對小鼠耳廓腫脹、大鼠足跖腫脹、創(chuàng)傷性皮膚潰瘍以及痔瘡模型的影響，發(fā)現(xiàn)不同品種的大黃均能夠抑制小鼠的耳廓腫脹和大鼠的足跖腫脹，促進(jìn)潰瘍皮膚角質(zhì)層、鱗狀細(xì)胞層和局部病理組織的恢復(fù)，加快大鼠創(chuàng)傷性皮膚潰瘍和肛周皮膚潰瘍的愈合。珍珠粉外用具有清熱解毒生肌之功效，研究證實(shí)，水溶性珍珠粉有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的作用[22]。

紫黃生肌膏在我科臨床使用多年，對于肛瘺術(shù)后、慢性下肢潰瘍以及糖尿病足潰瘍等均具有良好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)研究通過大鼠人糞污染創(chuàng)面建立肛瘺術(shù)后慢性感染創(chuàng)面模型，進(jìn)一步證實(shí)紫黃生肌膏能夠提高大鼠人糞污染創(chuàng)面的愈合率，加快創(chuàng)面的愈合速度，且可以下調(diào)創(chuàng)面TNF-a、IL-6 促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制創(chuàng)面炎癥因子的釋放，減輕創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，該作用可能是通過下調(diào)p38MAPK 信號通路來實(shí)現(xiàn)。