7株木霉菌對(duì)火龍果3種病原菌的拮抗作用

陳迪 侯巨梅 邢夢(mèng)玉 彥哲 劉銅

摘? 要：本研究利用對(duì)峙培養(yǎng)及發(fā)酵液、揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性測(cè)定，分析了7株木霉菌對(duì)火龍果潰瘍病菌、煤煙病菌和白絹病菌的拮抗作用，并測(cè)定木霉菌幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果表明：通過對(duì)峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)7株木霉菌對(duì)火龍果3種病原菌均有一定的抑制作用，其中木霉菌HL135、FJ069和2325-2分別對(duì)火龍果潰瘍病菌、煤煙病菌和白絹病菌抑制率最大，其抑制率分別為（67.60±0.85）%、（84.85±5.25）%和（80.63±1.20）%。7株木霉菌的發(fā)酵液和揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)3種病原菌也有不同程度的抑制作用。通過對(duì)木霉菌幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)木霉菌SC012具有較高的幾丁質(zhì)酶活性。這些結(jié)果將為開發(fā)木霉菌復(fù)合制劑防治火龍果病害提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：木霉菌;發(fā)酵液;揮發(fā)性物質(zhì);幾丁質(zhì)酶;拮抗活性;火龍果;病原菌

中圖分類號(hào)：S476.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： The antagonistic activity of seven Trichoderma strains against three pathogens of pitaya were analyzed using confront test and determination of antifungal acitivity of fermentation broth and volatile substances， and the chitinase activity of the Trichoderma strains were measured. The seven Trichoderma strains inhibited the growth of three pathogens to some extent. In dual culture， Trichoderma strain HL135， FJ069 and 2325-2 inhibited Neoscytalidium dimidiatum， Blastocladia pringsheimii and Sclerotium rolfsii with the highest inhibition rate of （67.60±0.85）%， （84.85±5.25）% and （80.63±1.20）%， respectively. The fermentation broth and volatile substances of the seven Trichoderma strains had different degree of inhibition on the three pathogens of pitaya. The chitinase activity of Trichoderma SC012 was higher than that of other strains by the determination of chitinase activity. The results would provide a theoretical basis for the development of Trichoderma compound agents to control pitaya disease.

Keywords： Trichoderma; fermentation broth; volatile inhibitors; chitinase; antagonistic activities; pitaya; pathogen

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.018

火龍果（Hylocereus undatus Britt. et Rose）屬于仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus），是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的集水果、花卉為一體的熱帶、亞熱帶果樹，被譽(yù)為保健食品和果品珍品[1]，于20世紀(jì)90年代初引種到中國(guó)臺(tái)灣。隨著種植規(guī)模的擴(kuò)大，火龍果已逐步成為我國(guó)南方地區(qū)農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的重要來源。在火龍果種植過程中，由于種植集中，種植品種單一化，火龍果潰瘍病（Neoscytalidium dimidiatum）、白絹?。⊿clerotium rolfsii）和煤煙?。˙lastocladia pringsheimii）逐年加重，致使火龍果產(chǎn)量和品質(zhì)急劇下降。目前，這些病害的防治主要以化學(xué)防治為主，但化學(xué)防治會(huì)對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境造成危害和破壞作用，也易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，尋求安全有效且環(huán)境友好的病害防治手段將有助于火龍果產(chǎn)業(yè)的綠色健康發(fā)展。

木霉菌（Trichoderma spp.）是廣泛分布于森林、農(nóng)田等潮濕生境中土壤、腐木、落葉以及真菌子實(shí)體上的拮抗微生物[2]，在生物防治中的應(yīng)用和研究非常廣泛。木霉菌對(duì)植物病原菌的廣譜拮抗作用，已被用于曲霉菌（Aspergillus spp.）、腐霉菌（Pythium spp.）、假單胞菌（Pseudomons adaceae）、輪枝孢菌（Pseudomons adaceae）等多種病原菌引起的植物病害的防治[3-6]。本研究擬通過測(cè)定7株木霉菌與火龍果3種病原菌的對(duì)峙培養(yǎng)、發(fā)酵液和揮發(fā)性物質(zhì)抑制作用及幾丁質(zhì)酶的活性，研究木霉菌對(duì)火龍果病原菌的拮抗效果，為下一步開發(fā)木霉菌復(fù)合制劑防治火龍果病害提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? 靶標(biāo)病原菌為引起火龍果潰瘍病的新暗色柱節(jié)孢（Neoscytalidium dimidiatum）、煤煙病的芽枝霉（Blastocladia pringsheimii）和白絹病的齊整小核菌（Sclerotium rolfsii），均由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院謝昌平副教授惠贈(zèng)。哈茨木霉2325-2（T. harzianum）、哈茨木霉XJ035（T. harzianum）、棘孢木霉FJ069（T. asperellum）、棘孢木霉HL119（T. asperellum）、棘孢木霉HL135（T. asperellum）、棘孢木霉JX013（T. asperellum）和棘孢木霉SC012（T. asperellum），均由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院木霉菌研究課題組提供。

7株木霉菌震蕩培養(yǎng)4 d后檢測(cè)幾丁質(zhì)酶活性，結(jié)果表明：木霉菌SC012的幾丁質(zhì)酶活性最高，達(dá)到1.83 U/mL，與其他木霉菌株的幾丁質(zhì)酶活性差異顯著（P<0.05），而木霉菌FJ069的幾丁質(zhì)酶活性最低，為0.83 U/mL，只有木霉菌SC012幾丁質(zhì)酶活性的45%，結(jié)果表明不同木霉菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的能力存在一定的差異。

3? 討論

木霉菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，能夠搶奪病原菌的營(yíng)養(yǎng)和生存空間，致使病原菌的生長(zhǎng)受到抑制[11]。平板對(duì)峙試驗(yàn)可直觀地觀察到木霉菌對(duì)病原菌的抑菌效果，因此可以快速篩選出具有較強(qiáng)拮抗作用的木霉菌株。夏海波等[12]用平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，篩選出8株對(duì)蔬菜病害防治效果良好的菌株。張建等[13]篩選得到9株棘孢木霉，對(duì)桑葚菌核病菌的抑菌率達(dá)到80%以上。Jiang等[14]通過對(duì)峙培養(yǎng)、細(xì)胞學(xué)和超微結(jié)構(gòu)顯示，棘孢木霉CGMCC 6422對(duì)辣椒疫霉病具有較強(qiáng)的抑制作用。本研究通過對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)，篩選到對(duì)火龍果煤煙病菌具有較好拮抗效果的木霉菌FJ069和JX013，對(duì)火龍果白絹病菌具有較好拮抗效果的木霉菌2325-2，抑菌率均達(dá)80%以上。而所有供試木霉菌對(duì)火龍果潰瘍病菌的抑制率均不高，表明對(duì)于生長(zhǎng)速度較快的病原菌，木霉菌難以通過快速生長(zhǎng)占領(lǐng)其生存空間，致使抑制率降低。因此在利用木霉菌防治病原菌時(shí)，應(yīng)以預(yù)防為主，才能達(dá)到更好的防治效果。

幾丁質(zhì)酶是木霉菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶類（CWDEs）之一[15]，木霉菌在重寄生過程中可以通過釋放細(xì)胞壁降解酶降解病原菌的細(xì)胞壁來殺死病原菌，在絲狀真菌中，木霉菌所含的幾丁質(zhì)酶基因是最多的[16]。木霉菌可以產(chǎn)生抗真菌活性的幾丁質(zhì)酶和水解幾丁質(zhì)酶，且不同幾丁質(zhì)酶對(duì)病原菌的拮抗活性表現(xiàn)出特異性，部分幾丁質(zhì)酶無拮抗真菌的活性[17]。本研究測(cè)定了7株木霉菌的幾丁質(zhì)酶活性，其中木霉菌SC012和HL135具有較高的幾丁質(zhì)酶活性，這2株木霉菌在發(fā)酵液和揮發(fā)性物質(zhì)抑菌試驗(yàn)中均表現(xiàn)出了較好的抑菌效果，但在對(duì)峙培養(yǎng)中抑菌效果較差，可能是由于木霉菌SC012和HL135的生長(zhǎng)速度較其他木霉菌慢，不能快速地占領(lǐng)病原物的生存空間，以及其幾丁質(zhì)酶中拮抗真菌活性的幾丁質(zhì)酶較少所致。Lorito等[18-20]通過研究指出，木霉菌幾丁質(zhì)酶只有幾種同時(shí)具有水解幾丁質(zhì)活性和抗真菌活性。李華[21]也發(fā)現(xiàn)木霉菌對(duì)病原菌的生防能力與幾丁質(zhì)酶活性高低沒有直接的相關(guān)性。因此，在評(píng)定木霉菌的拮抗作用時(shí)，應(yīng)當(dāng)結(jié)合多種影響因子進(jìn)行分析。

木霉菌可以產(chǎn)生較豐富的抗生次生代謝產(chǎn)物，目前已經(jīng)確定的抗生代謝產(chǎn)物已經(jīng)超過了140種，而且不同菌株之間產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類存在一定差異[22]。例如，陳凱等[23]發(fā)現(xiàn)綠色木霉LTR-2產(chǎn)生的吡喃酮類物質(zhì)5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-2-酮在20 mg/L的濃度下對(duì)11種植物病原菌均有抑制作用。Liu等[24]從哈茨木霉中提取的6種蒽醌類化合物，以及Vinale等[25]從木霉T. cerinum的培養(yǎng)濾液中分離出一種新的羥基內(nèi)酯對(duì)灰葡萄孢菌具有抑制作用。本研究中，7株木霉菌的發(fā)酵液對(duì)3種病原菌均有抑制作用，但木霉菌HL135對(duì)火龍果煤煙病菌的抑制率達(dá)（50.00±3.77）%，而木霉菌FJ069對(duì)火龍果煤煙病的抑制率僅為（34.78±0.00）%，表明木霉菌產(chǎn)生抗生次生代謝物的種類有一定的差異。

除了產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物外，木霉菌還可以產(chǎn)生一些抗病原真菌的活性揮發(fā)性物質(zhì)，其中揮發(fā)性物質(zhì)吡喃酮-6-戊基-2H-吡喃-2-酮（簡(jiǎn)稱6PP）研究較為廣泛，在多種木霉菌中被檢測(cè)到。例如，Vos等[26]報(bào)道了木霉菌揮發(fā)性物質(zhì)6PP對(duì)立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢菌均具有抑制作用。另外木霉菌產(chǎn)生的一些揮發(fā)性小分子化合物能夠誘導(dǎo)植物的抗性反應(yīng)，例如，Martínez-Medina等[27]報(bào)道了棘孢木霉T-34和哈茨木霉T-78產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠引發(fā)擬南芥的系統(tǒng)性防御反應(yīng)，提高對(duì)灰霉病的抗性，且能促進(jìn)根部對(duì)鐵離子的吸收。本研究結(jié)果顯示，木霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌有一定的抑制作用，其中，木霉菌SC012和木霉菌HL135的揮發(fā)性物質(zhì)都顯示出較強(qiáng)抑菌活性，表明這2株木霉菌可能產(chǎn)生具有抑菌活性的揮發(fā)性物質(zhì)。供試木霉菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制率在3.49%～37.84%之間，低于對(duì)峙培養(yǎng)對(duì)病原菌的抑制率（57.58%～84.85%）以及發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制率（26.09%～77.08%），表明木霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制率不高，暗示了木霉菌產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)的主要作用不僅僅為抑菌，可能還具有誘導(dǎo)植物抗性等其他作用。目前對(duì)于木霉菌揮發(fā)性物質(zhì)的研究不多，對(duì)于揮發(fā)性物質(zhì)的成分以及作用等尚待進(jìn)一步挖掘和研究。

木霉菌種類繁多，生防機(jī)制復(fù)雜[28]，在生防過程中對(duì)病原菌的生防機(jī)制包括競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等作用，且菌株之間的生防能力也存在著較大的差異[29]。在本研究中，木霉菌HL135有較高的幾丁質(zhì)酶活性，且其揮發(fā)性物質(zhì)、發(fā)酵液均有較強(qiáng)的抑菌率，但其發(fā)酵液對(duì)火龍果潰瘍病菌抑制效果較差，木霉菌FJ069的幾丁質(zhì)酶活性最低，但其發(fā)酵液對(duì)火龍果潰瘍病菌的抑制率都較其他6株木霉菌高，雖然木霉菌JX013的幾丁質(zhì)酶活性不高，且其對(duì)火龍果白絹病菌、火龍果潰瘍病菌的抑制效果均不理想，但是其對(duì)峙培養(yǎng)、發(fā)酵液以及揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)火龍果煤煙病菌有著良好的抑制效果。因此，在篩選生防菌的時(shí)候，應(yīng)該結(jié)合多因素篩選方法，才能夠合理地篩選出針對(duì)不同病原菌、不同拮抗特點(diǎn)的生防菌株。針對(duì)不同木霉菌對(duì)不同病原菌的防治效果具有差異的特點(diǎn)，可以采用不同木霉菌復(fù)配使用，以提高對(duì)多種病原菌的綜合防治效果。

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