許海方 謝陳南 應(yīng)晨怡 陳錫冰 楊受保

(紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

γ-氨基丁酸A受體相關(guān)蛋白(Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein，GABARAP)在多種組織中廣泛分布，能與多種胞內(nèi)因子發(fā)生互作，高度調(diào)控自噬體的運(yùn)輸[1-3]、自噬體的形成與成熟[4-6]、自噬通量的控制以及對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[7-8]等過(guò)程，從而廣泛參與細(xì)胞和機(jī)體的多種重要的生理病理過(guò)程，如細(xì)胞凋亡[9-10]、免疫應(yīng)答[11-12]和抗腫瘤[13-14]等.本文從分子生物學(xué)特性、互作蛋白及生物學(xué)功能等方面概述了GABARAP的研究進(jìn)展.

1 GABARAP的分子生物學(xué)特性

1.1 GABARAP的家族

GABAA受體相關(guān)蛋白，屬于GABARAPLl、GABARAPL2、GABARAPL3、GABARAPL4、LC3(Microtubule associated protein 1 light chain 3)、酵母Apg8或Aut7p和線蟲(chóng)LGGs蛋白構(gòu)成的古老蛋白家族中的一員，這個(gè)家族蛋白的氨基酸序列從單細(xì)胞的酵母到多細(xì)胞的哺乳動(dòng)物均高度保守，與泛素的三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似，且所有的蛋白均可以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸.目前對(duì)該家族的研究主要集中于酵母、人類和其他模式生物中.1999年Wang等[15]首次利用酵母雜交技術(shù)從人腦cDNA文庫(kù)中篩選并克隆了GABARAP基因.Kneussel等[16]對(duì)GABARAP基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，總結(jié)了GABARAP的進(jìn)化地位.

1.2 GABARAP的結(jié)構(gòu)

人源GABARAP蛋白由117個(gè)氨基酸組成，分子量約為14 kDa，在進(jìn)化上高度保守.氨基酸序列比對(duì)顯示，GABARAP和微管相關(guān)蛋白(Microtubule associated protein，MAP)具有較高的同源性，并且都能與多種其他蛋白相結(jié)合[17].GABARAP由N-端亞結(jié)構(gòu)域(1-26aa)和C-端結(jié)構(gòu)域(27-117aa)組成，其中N-端亞結(jié)構(gòu)域含有α1和α2螺旋，可以和微管蛋白結(jié)合；C-端和泛素的結(jié)構(gòu)很相似，含有4鏈的β折疊和α1、α2兩個(gè)螺旋，可與GABAA受體結(jié)合[15].

1.3 GABARAP的分布與表達(dá)

GABARAP在心、腦、睪丸、卵巢和胰腺等多種組織、器官中廣泛分布，但其分布存在時(shí)間和空間上的差異.Wang等[15]用免疫學(xué)方法證明，GABARAP在神經(jīng)元的胞體和突觸中均有分布，且在心、腦、肝臟和胰腺等組織中均有不同程度的表達(dá).白榮耀[18]發(fā)現(xiàn)GABARAP在雜色鮑的各種組織中廣泛表達(dá)，在大部分組織中的表達(dá)均為中等強(qiáng)度，但在肝胰臟組織中表達(dá)量最高，在血細(xì)胞中表達(dá)量最低；在雜色鮑的胚胎和幼體的發(fā)育過(guò)程中也有表達(dá)，且存在時(shí)間和空間上的差異；且從受精卵到十六細(xì)胞期，GABARAP的表達(dá)比較穩(wěn)定，桑椹胚時(shí)期GABARAP的表達(dá)水平急劇上升，直到原腸胚時(shí)期GABARAP的表達(dá)水平達(dá)到了高峰，之后GABARAP的表達(dá)水平急劇下降至接近受精卵時(shí)期水平.李金玲等[19]發(fā)現(xiàn)從斑馬魚(yú)2個(gè)細(xì)胞的受精卵一直到受精后24小時(shí)的胚胎中，GABARAP都呈高表達(dá)狀態(tài)，且這個(gè)基因極有可能是母體的遺留物.

上述研究表明GABARAP在多種組織中廣泛分布，特別是在胚胎發(fā)育時(shí)期，GABARAP這種時(shí)間和空間上的差異表明其可能參與胚胎和幼體的發(fā)育過(guò)程，在生物體的生命過(guò)程中發(fā)揮著廣泛而重要的作用.

2 GABARAP的互作蛋白

2.1 ATG13

自噬相關(guān)蛋白13(Autophagy-related protein 13，ATG13)，和ULK1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1)、ULK2(Unc-51 like autophagy activating kinase 2)、FIP200及ATG101(Autophagy-related protein 101)等均為ULK自噬復(fù)合物的重要成員[20-21].Alemu等[22]用pulldown分析證明GABARAP蛋白可與ULK復(fù)合物發(fā)生互作，并且作為自噬開(kāi)始階段的支架組裝在ULK復(fù)合體上，其中，ATG13與GABARAP亞家族有強(qiáng)相互作用.ATG13核心基序C-末端結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變會(huì)強(qiáng)烈地減少其與GABARAP的互作.特別是與核心基序相鄰的酸性殘基的存在對(duì)于其與GABARAP的有效互作至關(guān)重要.上述結(jié)果表明，GABARAP和ATG13之間的互作是直接的，而不是由ULK復(fù)合體的其他成員介導(dǎo)的，并且GABARAP和ATG13的互作在自噬結(jié)構(gòu)的延伸和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.

2.2 微管蛋白

GABARAP不僅在體內(nèi)能和微管共定位，在體外也能和微管蛋白(Tubulin)相互結(jié)合.Wang等[15]發(fā)現(xiàn)GABARAP和微管相關(guān)蛋白1A和1B之間的序列高度相似，并且其蛋白N-端的35個(gè)氨基酸殘基含有微管蛋白的結(jié)合位點(diǎn).Pulldown實(shí)驗(yàn)證明，GABARAP可同時(shí)與GABAA受體及tubulin結(jié)合，促進(jìn)GABAA受體在細(xì)胞膜上的聚集和定位.Coyle等[23]進(jìn)一步將其與Tubulin的結(jié)合位點(diǎn)縮小到了GABARAP的第10～22個(gè)殘基上，并發(fā)現(xiàn)GABARAP的其它區(qū)域可以增加其與微管蛋白的聚合活性，特別是H2螺旋結(jié)構(gòu)域.由此，我們推測(cè)GABARAP可通過(guò)與微管蛋白結(jié)合，來(lái)協(xié)助受體進(jìn)行生命活動(dòng).

2.3 NSF

N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感的融合蛋白(N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein，NSF)是一種ATP酶，在細(xì)胞內(nèi)膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[24-25].Kittler等[26]直接將GABARAP綁定到NSF上，發(fā)現(xiàn)NSF和GABARAP復(fù)合物可以在神經(jīng)元中被檢測(cè)到，并且這兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)膜區(qū)室內(nèi)共定位.同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)GABARAP可通過(guò)與NSF互作，調(diào)節(jié)胞內(nèi)囊泡的運(yùn)輸和胞吐過(guò)程，以釋放出大量的兒茶酚胺等免疫物質(zhì).這意味著GABARAP可通過(guò)與NSF的互作，參與GABAA受體由細(xì)胞質(zhì)向膜上的運(yùn)輸過(guò)程和機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng).

2.4 DDX47

DEAD-boxhelicase 47(DDX47)是一種RNA解旋酶，參與rRNA加工、前體mRNA剪接、蛋白質(zhì)翻譯、RNA降解以及細(xì)胞凋亡等重要的生物過(guò)程[27].Lee等[28]用免疫共沉淀篩選到了GABARAP的結(jié)合配偶體DDX47，并用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)一步證實(shí)GABARAP和DDX47可發(fā)生相互作用.同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)將GABARAP和DDX47 cDNA共轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞系中可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.上述研究表明，GABARAP可通過(guò)與特定蛋白的互作，參與細(xì)胞增殖、自噬、凋亡及免疫反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程.

2.5 Bcl-2

B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡中的基本調(diào)節(jié)因子，對(duì)維持細(xì)胞和組織的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[29-30].Ma等[31]用核磁共振證明了Bcl-2對(duì)GABARAP具有顯著的親和力，并且兩者的互作取決于與BH4區(qū)域相鄰的Bcl-2的三殘基區(qū)段(EWD).Pulldown實(shí)驗(yàn)證明Bcl-2過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致GABARAP脂化水平顯著降低，從而使得細(xì)胞自噬過(guò)程中吞噬泡的延長(zhǎng)、延伸等環(huán)節(jié)受到抑制.這些結(jié)果支持了GABARAP與Bcl-2復(fù)合物在細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡中的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)建立了細(xì)胞凋亡與自噬之間的潛在的復(fù)雜聯(lián)系，并將GABARAP定義為涉及這種復(fù)雜聯(lián)系的新型互作伙伴.

除了以上蛋白以外，GABARAP還與BNI3L(BCL2 interacting protein 3 like)、ATG4B、ULK1、MAPK15、ERK8、GABRG2(Gamma-aminobutyric acid(GABA)A receptor, gamma)、NBR1(NBR1 autophagy cargo receptor)、WDFY3(WD repeat and FYVE domain containing 3)、CALR(Calreticulin)、ATG7、RASF5(Ras association domain family member 5)、TBD2B(TBC1domain family member 2B)及NEDD4(NEDD4 E3 ubiquitin protein ligase)等蛋白相互作用，廣泛參與細(xì)胞的自吞噬、細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤和癌癥、免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、化學(xué)突觸的傳遞及蛋白質(zhì)定位等生物學(xué)過(guò)程.

3 GABARAP蛋白的功能

3.1 調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬

自噬是一種保守的細(xì)胞內(nèi)降解方式，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著不可或缺的作用.自噬的過(guò)程主要分為啟動(dòng)階段、自噬體的延伸、成熟和降解階段，涉及超過(guò)40個(gè)自噬相關(guān)蛋白[32].其中，GABARAP蛋白是自噬的良好標(biāo)記，在自噬體的形成和成熟過(guò)程中參與這些蛋白的調(diào)控.(1)自噬的起始階段：GABARAP蛋白可與ATG13、ULK1、ULK2和FIP200互作，并作為自噬開(kāi)始階段的支架組裝在ULK復(fù)合體上.中心體GABARAP在饑餓條件下可運(yùn)輸自噬結(jié)構(gòu)，GABARAP通過(guò)特異性激活ULK復(fù)合體，調(diào)節(jié)自噬體形成過(guò)程中的高爾基體伴侶WAC(WW domain containing adaptor with coiled-coil)和GM130蛋白質(zhì)，并將其從中心體運(yùn)輸.此外，GABARAP還能和自噬體形成的上游調(diào)控因子MAPK15、ERK8發(fā)生相互作用，從而誘導(dǎo)自噬的起始.(2)吞噬泡的延長(zhǎng)、延伸階段：GABARAP蛋白對(duì)于雙膜結(jié)構(gòu)的延伸是不可或缺的.GABARAP具有氨基端螺旋和由具有疏水口袋的β-鏈組成的C-末端，其C端甘氨酸殘基被ATG4蛋白酶酶切后產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)GABARAP-Ⅰ，再依次通過(guò)激活A(yù)TG7、ATG3(泛素E2樣酶)和ATG12復(fù)合物，將切割的GABARAP與磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)綴合產(chǎn)生GABARAP-Ⅱ，吸附在自噬體膜上，以促進(jìn)膜融合、延伸[33-34].(3)吞噬泡將底物包裹的階段：GABARAP與ALFY(Autophagy-linked fyve protein)的結(jié)合是選擇性結(jié)合，是ALFY對(duì)LC3B募集所必需的，可組裝一些蛋白質(zhì)到早期吞噬泡產(chǎn)生的位置，促進(jìn)自噬前體的形成.此外，GABARAP也可通過(guò)與E3泛素連接酶相互作用調(diào)節(jié)線粒體自噬，與Dvl2(Dishevelled 2)結(jié)合，負(fù)調(diào)節(jié)Wnt通路[35-36].(4)自噬體形成與成熟階段：GABARAP介導(dǎo)自噬過(guò)程中PI4KIIα(Phosphatidylinositol 4-kinase type 2 alpha)靶向調(diào)節(jié)PtdIns4P(Phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase catalytic subunit type 2 alpha)依賴性自噬體-溶酶體的融合.PI4KIIα可產(chǎn)生磷酸肌醇4磷酸鹽(PI4P)，并將GABARAPs從核周高爾基體區(qū)域結(jié)合到自噬體，若GABARAP、PI4KIIα缺失或過(guò)度表達(dá)會(huì)引起自噬流的減少，從而導(dǎo)致自噬體的大量積聚[37-38].此外，GABARAP蛋白可通過(guò)HOPS(Homotypic fusion and vacuole protein sorting)與PLEKHM1(Pleckstrin homology domain containing protein family member 1)一起調(diào)節(jié)自噬體-溶酶體融合.更有趣的是，GABARAPL2和GABARAP蛋白的酶促和化學(xué)脂質(zhì)化形式均可促進(jìn)膜融合，而LC3的脂質(zhì)化形式執(zhí)行類似功能的程度要比GABARAP低得多.與LC3亞家族相比，這一發(fā)現(xiàn)揭示了GABARAP亞家族在膜融合中的優(yōu)先作用[4].

上述研究表明，自噬體的形成和成熟等過(guò)程受到GABARAP蛋白的高度調(diào)控，GABARAP在細(xì)胞定位、自噬體的形成、自噬體的運(yùn)輸、自噬體與溶酶體的融合、自噬通量的控制以及對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬等過(guò)程中均起到了關(guān)鍵性的作用.

3.2 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是真核細(xì)胞體內(nèi)的基本穩(wěn)態(tài)過(guò)程之一，在發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，GABARAP家族成員不僅參與細(xì)胞的自噬過(guò)程，而且還與細(xì)胞凋亡有關(guān).Salah等[11]用DMBA(7,12-dimethylbenz(a)anthracene)處理小鼠使之致癌，觀察乳腺上皮細(xì)胞和導(dǎo)管的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)相比于正常的小鼠，在GABARAP缺陷的小鼠體內(nèi)的乳腺上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞和導(dǎo)管的數(shù)量減少得更快，導(dǎo)管生長(zhǎng)的長(zhǎng)度也顯著短于所有其他組小鼠.這些結(jié)果表明將GABARAP缺陷的小鼠暴露在致癌物DMBA中時(shí)，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，并使得細(xì)胞死亡數(shù)量顯著增長(zhǎng).Lee等[28]發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染GABARAP及其互作蛋白DDX47可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡.冉莉等[9]通過(guò)qPCR發(fā)現(xiàn)用白藜蘆醇處理乳腺癌細(xì)胞，可以抑制細(xì)胞內(nèi)GABARAPL1的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

上述研究提示了GABARAP在細(xì)胞凋亡中的調(diào)節(jié)作用，但其調(diào)節(jié)機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的探討.

3.3 在癌癥和腫瘤中的功能作用

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明異常自噬與多種疾病和惡性腫瘤密切相關(guān)，因此研究自噬相關(guān)基因GABARAP與腫瘤的關(guān)系對(duì)于全面認(rèn)識(shí)癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有非常重要的意義.Salah等[11]發(fā)現(xiàn)經(jīng)DMBA處理的GABARAP缺陷小鼠中，腫瘤的形成顯著下降.夏燕[13]和李瑞湘[39]發(fā)現(xiàn)GABARAPLl在肝癌和結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，并且其下調(diào)表達(dá)與乙肝病毒感染、肝炎史以及手術(shù)后生存時(shí)間有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性；同時(shí)，過(guò)表達(dá)GABARAPL1蛋白可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖.

上述研究為GABARAP參與體內(nèi)腫瘤發(fā)生提供了有力證據(jù)，證實(shí)了GABARAP家族蛋白能夠顯著抑制癌細(xì)胞的無(wú)限增殖，與多種癌癥的臨床病理特征具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性.因此探討GABARAP與腫瘤的關(guān)系，對(duì)于全面認(rèn)識(shí)癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及開(kāi)發(fā)特異性GABARAP抑制劑作為腫瘤靶向治療的新型藥物具有非常重大的意義.

3.4 參與免疫應(yīng)答

目前，許多自噬相關(guān)基因都已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用.Salah等[11]發(fā)現(xiàn)用DMBA處理GABARAP缺陷的小鼠后，淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生更高水平的IL-2和IFN-γ，機(jī)體也能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量促炎癥因子，如IL-1β和IL-6等，從而激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，進(jìn)行免疫應(yīng)答.周智[40]分析了鰻弧菌刺激后中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中EsGABARAP的時(shí)序表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)血淋巴細(xì)胞中EsGABARAP的表達(dá)水平顯著上調(diào)，高達(dá)空白對(duì)照組的7倍多.白榮耀[18]檢測(cè)了溶藻弧菌感染后雜色鮑血細(xì)胞和肝胰臟中SaGABARAP的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SaGABARAP基因的表達(dá)在血細(xì)胞和肝胰臟中均顯著上調(diào)，但在這兩個(gè)不同的組織器官中表達(dá)上調(diào)的時(shí)間和程度不同.在血細(xì)胞中，SaGABARAP基因轉(zhuǎn)錄水平在溶藻弧菌感染3h后最高；而在肝胰臟中，SaGABARAP的表達(dá)水平則在溶藻弧菌感染24h后達(dá)到峰值.

上述研究表明，GABARAP與免疫反應(yīng)存在著密切的關(guān)系.病原或外界抗原誘導(dǎo)刺激，能夠誘導(dǎo)GABARAP mRNA表達(dá)水平上調(diào)或促炎癥因子的產(chǎn)生，參與免疫應(yīng)答.

4 結(jié)論

GABARAP是一類家族同源性很高，在進(jìn)化上高度保守的蛋白，在促進(jìn)GABAA受體聚集和定位，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和凋亡、參與免疫應(yīng)答、抑制腫瘤和癌癥等方面發(fā)揮著十分重要的作用.但目前有關(guān)GABARAP的研究主要集中在一些模式生物中，在無(wú)脊椎動(dòng)物中的報(bào)道較少.對(duì)于GABARAP家族蛋白在自噬中的功能作用有較多的研究報(bào)道，但對(duì)其在細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)和抗腫瘤等方面的研究尚不夠深入，尤其對(duì)其作用的分子機(jī)制則鮮有報(bào)道.今后，首先從廣度上，相信會(huì)有更多不同進(jìn)化地位生物體的GABARAP蛋白被鑒定并開(kāi)展功能分析；其次，從深度上，利用CRISPR/Cas9、RNAi和免疫共沉淀等各種技術(shù)方法，有望探明GABARAP蛋白的功能作用及其詳細(xì)的分子機(jī)制，為利用GABARAP蛋白開(kāi)展細(xì)胞自噬、凋亡與分子免疫等基礎(chǔ)研究，以及腫瘤等疾病的診治提供新思路、新靶點(diǎn).