徐愛國(guó)

摘 要 本研究探討了影響培菲康膠囊活菌數(shù)的因素：貯存溫度、培養(yǎng)基和四環(huán)素。結(jié)果表明：在25、30和37 ℃放置7 d，每粒膠囊所含長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌及糞腸球菌活菌數(shù)均大于1×107 CFU/g，其中，在25 ℃條件下，活菌數(shù)最多，表明菌株存活率最高；血平板中長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)明顯高于GAM 日本日水和GAM青島日水培養(yǎng)基中的活菌數(shù)，說(shuō)明血平板更適宜長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞 培菲康膠囊 貯存溫度 培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：R944.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2020）17-0071-04

Effects of different storage temperatures， media and tetracycline on the number of living bacteria in Bifico capsules

XU Aiguo*

（SPH Sine Pharmaceutical Laboratories Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT The factors affecting the number of viable bacteria in Bifico capsules were studied， including storage temperatures， media and tetracycline. The results showed that the number of live bacteria of Bifidobacterium longum， Lactobacillus acidophilus and Enterococcus faecalis in each capsule were all more than 1×107 CFU when they were incubated for 7 days at 25， 30 and 37 ℃. The number of the living bacteria and their survival rates were the highest when capsules were stored under 25 ℃. The number of B. longum was significantly higher when cultured on blood medium than the other media tested， which indicated that the blood medium was more suitable for the growth of B. longum.

KEy WORDS Bifico capsules； storage temperature； medium

培菲康膠囊（Live Combined Bifidobacterium， Lactobacillus and Enterococcus Capsules）作為一種復(fù)合微生態(tài)制劑，包含長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌三種主要益生菌，可通過(guò)補(bǔ)充這些益生菌促進(jìn)宿主腸胃增殖新生益生菌，從而在重建宿主腸道菌群、保證腸道微生態(tài)平衡、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)宿主健康中發(fā)揮著重要作用。它在臨床廣泛應(yīng)用于兒童腹瀉、兒童功能性便秘、新生兒黃疸、腸易激綜合征等疾病的治療，對(duì)兒童厭食癥、肝硬化、幽門螺旋桿菌感染、兒童單純性腎病綜合征等也有很好的療效。

活菌數(shù)作為一種可有效考察微生態(tài)制劑有效性的質(zhì)量控制指標(biāo)，也是穩(wěn)定性考察的重要指標(biāo)。目前研究表明保藏溫度[1-4]、保藏時(shí)間[5-6]、培養(yǎng)基類型[5-6]、pH[2，4]及抗生素添加[4，7]是影響微生態(tài)制劑活菌數(shù)的主要因素。為了對(duì)培菲康三元復(fù)合制劑中長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，排除嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的干擾，需要在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素抑制其他兩種菌的生長(zhǎng)，而長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)四環(huán)素不敏感；盡管培菲康推薦保藏溫度為4 ℃，但考慮到患者用藥的實(shí)際情況，我們還考察25、30、37 ℃條件下短期保存的活菌數(shù)變化情況，以便準(zhǔn)確判斷以上因素對(duì)微生態(tài)制劑活菌數(shù)的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化微生態(tài)制劑的生產(chǎn)工藝，提高制劑中的活菌數(shù)及產(chǎn)品穩(wěn)定性提供有效依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

試驗(yàn)菌株來(lái)自微生態(tài)制劑培菲康膠囊，是由長(zhǎng)雙歧桿菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉按照一定比例混合而成的微生態(tài)制劑，三種單菌粉和膠囊均來(lái)自上海上藥信誼藥廠有限公司制藥總廠培菲康車間；培養(yǎng)基為厭氧稀釋液、MRS培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、GAM培養(yǎng)基（批號(hào)20150215，青島日水生物技術(shù)有限公司；批號(hào)290409，日本日水製薬株式會(huì)社）；四環(huán)素（批號(hào)10015839，Sigma公司；批號(hào)130306-201419，中檢院標(biāo)準(zhǔn)品）。

1.2 試劑和培養(yǎng)基配制

1）厭氧稀釋液 胰酪胨20 g，酵母粉10 g，葡萄糖0.5 g，CaCl2 8 mg，MgSO4 8 mg，KH2PO4 40 mg，L-半胱氨酸鹽酸鹽1 g，定容至1 L，pH 7.4，115 ℃濕熱滅菌30 min；

2）MRS培養(yǎng)基 MRS agarose 62 g粉末溶于1 L純化水，121 ℃濕熱滅菌15 min；

3）血平板培養(yǎng)基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，胰酪胨3 g，酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，大豆胨10 g，可溶性淀粉0.5 g，吐溫1 ml，豬肝浸出液170 ml，KH2PO4 2 g，K2HPO4 2 g，MgSO4 0.4 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 20 mg，NaCl 20 mg，MnSO4 13 mg，L-鹽酸半胱氨酸1 g，瓊脂17 g，用純化水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 7.4，115 ℃濕熱滅菌30 min；

4）普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 稱取營(yíng)養(yǎng)瓊脂菌粉36 g粉末溶于1 L純化水，121 ℃濕熱滅菌15 min；

5）GAM培養(yǎng)基 稱取76 g溶于1 L去離子水中，115 ℃滅菌 30 min

6）四環(huán)素溶液 用去離子水配制100 mg/ml的四環(huán)素溶液10 ml，溶解搖勻，用0.22 mm的濾膜過(guò)濾滅菌后保存于4 ℃。

1.3 主要試驗(yàn)設(shè)備

IMH180高端型微生物培養(yǎng)箱和RI-150低溫培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛公司）；KB23低溫培養(yǎng)箱（德國(guó)本德爾公司）；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫(yī)療設(shè)備有限公司）；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 不同存放溫度對(duì)活菌數(shù)的影響

將培菲康膠囊分別放置于25、30、37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中，于存放第1、3、7天各取3粒膠囊，將其菌粉溶解于厭氧稀釋液，充分搖勻，10倍梯度稀釋后，取稀釋液100 ml涂布裝有固體培養(yǎng)基的3個(gè)平皿，置37 ℃培養(yǎng)（長(zhǎng)雙歧桿菌于厭氧環(huán)境培養(yǎng)）48 h，鏡檢無(wú)雜菌，計(jì)算活菌數(shù)，并以空白組為對(duì)照。

1.4.2 不同培養(yǎng)基對(duì)活菌數(shù)的影響

分別取長(zhǎng)雙歧桿菌菌粉3 g，混合菌粉5.5 g，加無(wú)菌生理鹽水27 ml，混勻。梯度稀釋至10-6、10-7，取100 ml涂布于GAM和血平板培養(yǎng)基，于37 ℃厭氧培養(yǎng)7 d，鏡檢無(wú)雜菌，計(jì)算活菌數(shù)。同法將菌液涂布于含不同來(lái)源四環(huán)素的平皿，考察其對(duì)菌落計(jì)數(shù)的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019和SPSS 23數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)菌株的影響

培菲康膠囊于25、30、37 ℃放置7 d后，每粒膠囊所含長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌活菌數(shù)均大于1×107 CFU，符合《中國(guó)生物制品規(guī)程》要求。隨著放置時(shí)間的增長(zhǎng)，培菲康膠囊中的長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌活菌數(shù)在3種存放溫度條件下都會(huì)下降，溫度越高，活菌數(shù)下降的程度越大。相比較而言，三種菌株于25 ℃存放的存活率最高（表1）。

2.2 含或不含四環(huán)素培養(yǎng)基對(duì)菌粉中長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)的影響

結(jié)果表明，長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)四環(huán)素不敏感，培養(yǎng)基含不含四環(huán)素對(duì)單菌粉活菌量影響不明顯；混合菌粉中長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)低于單菌粉計(jì)數(shù)，兩者具有顯著性差異，混合菌粉中長(zhǎng)雙歧桿菌的存活率受嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的影響，其在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基中活菌數(shù)高于不含四環(huán)素的培養(yǎng)基，低于單菌粉的活菌數(shù)，說(shuō)明其他兩種菌在培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌有一定的抑制作用，因此后續(xù)培養(yǎng)基及四環(huán)素對(duì)活菌數(shù)影響的實(shí)驗(yàn)采用單菌粉進(jìn)行計(jì)數(shù)更為有效（表2）。

在血平板、GAM日本日水、GAM青島日水三種培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)，未添加四環(huán)素和添加有中檢院鹽酸四環(huán)素的長(zhǎng)雙歧桿菌活菌計(jì)數(shù)均呈現(xiàn)出血平板培養(yǎng)基中活菌數(shù)最高，與日水培養(yǎng)基差異明顯，GAM日本日水培養(yǎng)基中培養(yǎng)的活菌數(shù)高于GAM青島日水平培養(yǎng)基，但差異不明顯。表明采用血平板檢測(cè)混合菌粉中的活菌數(shù)更準(zhǔn)確（表2）。

2.3 不同來(lái)源四環(huán)素對(duì)活菌數(shù)的影響

Sigma鹽酸四環(huán)素與中檢院鹽酸四環(huán)素（質(zhì)量濃度均為100 mg/ml）對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌計(jì)數(shù)的影響不同。與未添加四環(huán)素培養(yǎng)基中活菌數(shù)相比，添加有四環(huán)素（Sigma）的培養(yǎng)基中，長(zhǎng)雙歧桿菌的活菌數(shù)數(shù)量減少了大約100倍；而在添加四環(huán)素（中檢院）的培養(yǎng)基中，長(zhǎng)雙歧桿菌的活菌數(shù)數(shù)量減少了不到10倍（表3），說(shuō)明了長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)兩廠商四環(huán)素的敏感性存在一定的差異。

3 討論

多元復(fù)合活菌制劑中對(duì)目標(biāo)菌種的計(jì)數(shù)具有較高的難度，既要抑制非目標(biāo)菌種的生長(zhǎng)又要保證目標(biāo)菌種的正常生長(zhǎng)，而在計(jì)數(shù)培養(yǎng)基中添加適量的抗生素是最長(zhǎng)用的方法之一。培菲康為三元混合活菌制劑，長(zhǎng)雙歧桿菌作為主要益生菌之一，其對(duì)不同培養(yǎng)基有不同的適應(yīng)性。本研究中，長(zhǎng)雙歧桿菌在血平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有較高的活菌數(shù)，在進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)的GAM培養(yǎng)基中活菌數(shù)都較低，說(shuō)明血平板培養(yǎng)基中所含的營(yíng)養(yǎng)成分更適合長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)。研究也表明長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)不同來(lái)源四環(huán)素具有不同的耐受性，本研究中同一種培養(yǎng)基種添加不同品牌的四環(huán)素，長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)也表現(xiàn)出明顯差異性，其中Sigma鹽酸四環(huán)素對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)具有較大影響，說(shuō)明在實(shí)際運(yùn)用中，應(yīng)多加考慮抗生素品牌、效價(jià)及保存期等多種因素。

本研究表明影響培菲康膠囊中活菌數(shù)檢測(cè)的主要因素有貯存溫度、培養(yǎng)基及抗生素?？紤]患者的實(shí)際情況，短途運(yùn)輸或短時(shí)間非正常情況保存的條件下長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的活性穩(wěn)定性，通過(guò)試驗(yàn)說(shuō)明在25 ℃條件下培菲康膠囊具有更好的穩(wěn)定性，活菌維持更高。血平板培養(yǎng)基更適于混合菌粉中長(zhǎng)雙歧桿菌活菌量的檢測(cè)。長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)不同廠家抗生素——四環(huán)素的敏感性存在一定的差異。同濃度抗生素對(duì)活菌量影響差異的出現(xiàn)，是否是不同廠家抗生素存在效價(jià)差異或菌體自身抗性的不同，還有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 李志成， 張連斌， 王碧德， 等. 發(fā)酵溫度對(duì)凍干乳酸菌發(fā)酵劑活菌數(shù)的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2006， 15（2）： 156-158.

[2] 張?zhí)m威， 申美艷， 張曉光. 培養(yǎng)溫度pH值對(duì)保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌混合生長(zhǎng)的影響[J]. 食品與機(jī)械， 1996， 12（5）： 26-27.

[3] 李德斌. 雙岐桿菌微膠囊技術(shù)的研究[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2004.

[4] 劉超齊， 王平， 常娟， 等. 益生菌對(duì)溫度、pH及抗生素耐受性的研究[J]. 飼料研究， 2016， 61（12）： 19-25.

[5] 孫合美， 汪官保， 張?zhí)鹛穑?等. 不同水分含量及發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵飼料pH和乳酸菌活菌數(shù)的影響[J]. 廣東飼料， 2014， 23（3）： 27-28.

[6] 李紅軍， 周國(guó)英， 路宗巖， 等. 杉木炭疽病拮抗菌HY32的發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2014， 50（12）： 94-100.

[7] 李晶晶， 汲全柱， 朱海明， 等. 一株枯草芽孢桿菌YB-6的篩選、生物學(xué)特性及發(fā)酵工藝的研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2017， 60（11）： 49-54.

[8] 王畢英， 王洪麗， 劉彥民. 微生態(tài)制劑活菌數(shù)方法研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工， 2018， 17（24）： 77-79.