南美白對(duì)蝦病原性豚鼠氣單胞菌的分離與藥敏特性

曾憲凱，曹海鵬，穆春華

（1.上海市青浦區(qū)練塘鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，上海鵬豪水產(chǎn)專業(yè)合作社，上海 201715；2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心（ZF1206），上海 201306）

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）是我國重要特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，在浙江、廣西、海南、福建、山東、珠三角、長三角、京津唐等地區(qū)大面積養(yǎng)殖[1]，是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種。2017年，我國南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)160多萬噸[2]。然而，細(xì)菌性病害對(duì)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)生了嚴(yán)重危害，其病原菌種類廣、繁殖速度快、致病力強(qiáng)、發(fā)病率高，通常引起南美白對(duì)蝦內(nèi)臟組織出現(xiàn)不同程度損傷而使其大規(guī)模死亡。其中，以“附肢或游泳足變黃”為典型病癥的黃腿病是南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中的常見病之一[3-4]，但從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料來看，南美白對(duì)蝦黃腿病的研究基礎(chǔ)薄弱，鮮見南美白對(duì)蝦黃腿病病原菌豚鼠氣單胞菌及其防控藥物等方面的詳細(xì)研究報(bào)道，這在一定程度上影響了我國對(duì)南美白對(duì)蝦黃腿病的有效防控。因此，加強(qiáng)黃腿病研究對(duì)促進(jìn)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。2018年7月，上海市青浦區(qū)一養(yǎng)殖場(chǎng)的南美白對(duì)蝦出現(xiàn)了黃腿病，病死率達(dá)到了60%以上，在上海南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)發(fā)生實(shí)為罕見。鑒此，該試驗(yàn)通過對(duì)南美白對(duì)蝦黃腿病病原菌的分離鑒定與藥敏特性研究，以期為確定南美白對(duì)蝦黃腿病的病因與藥物防控提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 材料

自然發(fā)病南美白對(duì)蝦，16尾，平均體質(zhì)量5.12 g，取自上海市青浦區(qū)自然發(fā)病養(yǎng)殖池；健康南美白對(duì)蝦，60尾，大小均勻，體質(zhì)健壯，平均體質(zhì)量8.72 g，由浙江蕭山某養(yǎng)殖場(chǎng)提供；API ID32GN細(xì)菌生化鑒定試劑條，由法國某公司生產(chǎn)；藥敏紙片，由杭州某微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 采用75%酒精對(duì)具有典型發(fā)病癥狀的瀕死南美白對(duì)蝦進(jìn)行表面消毒后，參照Cao等[4]的方法常規(guī)無菌操作取其肝胰腺組織，劃線普通營養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行病原菌的分離，30℃恒溫培養(yǎng)24～32 h后純化分離菌株，并轉(zhuǎn)接至普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上于30℃恒溫培養(yǎng)32 h，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌株的人工回歸感染試驗(yàn) 試驗(yàn)包括3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組各15尾健康南美白對(duì)蝦。試驗(yàn)前用無菌生理鹽水分別洗下普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上各分離菌株的菌苔制成菌濃度為1.0×106CFU/mL的菌懸液。試驗(yàn)組南美白對(duì)蝦分別在靠近尾扇第3腹節(jié)處[5]注射濃度為1.0×106CFU/mL的分離菌株菌懸液，每尾注射0.1 mL；對(duì)照組注射相同劑量的無菌生理鹽水。試驗(yàn)周期為6 d，試驗(yàn)期間水溫控制在28℃，每天記錄試驗(yàn)?zāi)厦腊讓?duì)蝦的死亡數(shù)量，觀察其病癥，并將死蝦及時(shí)撈出進(jìn)行病原菌的再分離，確定其與原病原菌株的一致性。

1.2.3 病原菌的鑒定 參照曹海鵬等[6]的方法，用API ID32GN細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)病原菌株進(jìn)行生理生化鑒定，并委托上海某生物科技有限公司對(duì)病原菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測(cè)序后，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過16S rRNA序列分析對(duì)病原菌株進(jìn)行分子鑒定。

1.2.4 病原菌藥敏特性的測(cè)定 參照紙片擴(kuò)散法[7]測(cè)定病原菌株的藥敏特性，并根據(jù)杭州濱河微生物試劑有限公司的《紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)》，判定病原菌株對(duì)抗生素的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離

從自然發(fā)病的南美白對(duì)蝦的肝胰腺組織中分離到3株疑似病原菌株，暫命名為QPX1、QPX2、QPX3。人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，僅菌株QPX1感染南美白對(duì)蝦后南美白對(duì)蝦出現(xiàn)了死亡，試驗(yàn)?zāi)厦腊讓?duì)蝦的病死率達(dá)到了100%，而且試驗(yàn)?zāi)厦腊讓?duì)蝦的病癥與自然病癥基本相同，并從人工感染的病蝦肝胰腺中又可再次分離到與原菌株生理生化特性一致的菌株，由此判定菌株QPX1是引起該病的病原菌。

表1 分離菌株對(duì)南美白對(duì)蝦人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

2.2 病原菌的鑒定

菌株QPX1的生理生化鑒定結(jié)果表明(表2)，菌株QPX1為豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae），與豚鼠氣單胞菌對(duì)照菌株[6，8]生理生化特性有96.9%的一致性。此外，通過NCBI網(wǎng)站中的BLASTN軟件將菌株QPX1的16S rRNA基因序列（GenBank收錄號(hào)：MK652096）與GenBank中已知菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行了同源性比較（表3），發(fā)現(xiàn)菌株QPX1的16 S rRNA基因序列與GenBank中豚鼠氣單胞菌菌株的16 S rRNA序列自然聚類，同源性達(dá)到了99%～100%。通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株QPX1 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）進(jìn)一步表明，菌株QPX1與豚鼠氣單胞菌菌株J2（GenBank收錄號(hào)：KP262414）的親緣關(guān)系最近。結(jié)合生理生化鑒定以及16S rRNA基因序列分析的結(jié)果，判定QPX1為豚鼠氣單胞菌。

表2 菌株QPX1的生理生化特征

注：＋，陽性；－，陰性；d，存在種間差異。

表3 菌株QPX1的16 S rRNA基因序列與GenBank中已知豚鼠氣單胞菌菌株16 S rRNA基因序列同源性

2.3 病原菌的藥敏特性

菌株QPX1對(duì)14種抗生素的敏感試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，菌株QPX1對(duì)阿莫西林、多粘菌素B、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、卡那霉素、吡哌酸、新霉素、慶大霉素、氟苯尼考、鏈霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、奈替米星等13種抗生素高度敏感，對(duì)四環(huán)素耐藥。

表4 菌株QPX1的藥敏特性

3 討論與分析

3.1 豚鼠氣單胞菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害性

豚鼠氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖重要病原菌，具有廣泛的致病性，已經(jīng)引起南方鲇（Silurus meriordinalis）[9]、日本鰻鱺（Anguilla japonica）[10]、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）[6]、花 鱸（Lateolabrax japonicus）[11]、草魚（Ctenopharyngodon idellus）[12]、匙吻鱘（Polyodon spathula）[13]等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病死亡，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖具有極強(qiáng)的危害性。然而，從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料來看，關(guān)于豚鼠氣單胞菌對(duì)南美白對(duì)蝦致病的詳細(xì)報(bào)道較少，僅李梅等[5]曾報(bào)道豚鼠氣單胞菌引起廣東養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦發(fā)生以“足須發(fā)紅、肝胰腺腫大”為典型病癥的疾病，而豚鼠氣單胞菌引起南美白對(duì)蝦黃腿病的研究尚未報(bào)道。該試驗(yàn)對(duì)南美白對(duì)蝦黃腿病病原菌豚鼠氣單胞菌進(jìn)行了分離鑒定，篩選了潛在防控藥物，研究結(jié)果可作為南美白對(duì)蝦黃腿病的藥物防控提供依據(jù)。

3.2 豚鼠氣單胞菌的致病機(jī)理分析

一般來說，病原菌的致病性與其毒力因子的產(chǎn)生密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道[14-15]，豚鼠氣單胞菌能夠產(chǎn)生多種毒力因子。陽濤等[14]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，南方鲇源豚鼠氣單胞菌胞外產(chǎn)物具有蛋白酶、脂酶、明膠酶和脲酶活性，具有很強(qiáng)的溶血毒性和細(xì)胞毒性；熊靜等[15]研究表明，鰻源豚鼠氣單胞菌胞外產(chǎn)物具有溶血、酪蛋白酶和卵磷脂酶活性。該試驗(yàn)證實(shí)豚鼠氣單胞菌對(duì)南美白對(duì)蝦具有致病性，可能與這些毒力因子的產(chǎn)生有關(guān)。至于豚鼠氣單胞菌引起南美白對(duì)蝦黃腿病的發(fā)病機(jī)理，目前尚未確定，可能是由于豚鼠氣單胞菌感染南美白對(duì)蝦后產(chǎn)生毒力因子，引起肌肉等組織出現(xiàn)病變和壞死，導(dǎo)致病蝦黃色素病理性沉積，表現(xiàn)出附肢變黃。當(dāng)然，除了豚鼠氣單胞菌的自身因素外，該病的發(fā)生與池底腐敗有機(jī)質(zhì)累積造成的病原菌滋生、養(yǎng)殖戶投喂飼料不當(dāng)也有較大的關(guān)系。

3.3 豚鼠氣單胞菌的藥敏特性分析

不同來源的豚鼠氣單胞菌常常具有藥敏特性的差異性。何永龍等[12]從草魚體內(nèi)分離的豚鼠氣單胞菌菌株JS對(duì)恩諾沙星、復(fù)方新諾明、氟苯尼考等抗生素高度敏感，對(duì)多粘菌素B中度敏感，對(duì)阿莫西林耐藥；韋陽道等[13]從患病匙吻鱘體內(nèi)分離的豚鼠氣單胞菌菌株GXKJDX02對(duì)多粘菌素B、氟苯尼考、復(fù)方新諾明等抗生素耐藥，對(duì)恩諾沙星高度敏感。該試驗(yàn)也對(duì)豚鼠氣單胞菌菌株QPX1的藥敏特性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)菌株QPX1對(duì)阿莫西林、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、恩諾沙星等抗生素均高度敏感，與韋陽道等[13]分離的鱘源豚鼠氣單胞菌對(duì)多粘菌素B、氟苯尼考、復(fù)方新諾明等抗生素的敏感性有所不同，與何永龍等[12]分離的草魚源豚鼠氣單胞菌對(duì)阿莫西林的敏感性不同。此外，菌株QPX1對(duì)磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等常見水產(chǎn)用抗生素均高度敏感，說明菌株QPX1對(duì)常規(guī)水產(chǎn)用抗生素并未產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，為該病的合理用藥防控提供了科學(xué)依據(jù)。然而，值得指出的是，豚鼠氣單胞菌的藥敏特性會(huì)隨著時(shí)間的推移均會(huì)發(fā)生變化，因而非常有必要長期監(jiān)測(cè)豚鼠氣單胞菌對(duì)常規(guī)水產(chǎn)藥物的敏感性，以避免臨床盲目用藥。與此同時(shí)，養(yǎng)殖者也應(yīng)該認(rèn)清抗生素濫用對(duì)豚鼠氣單胞菌耐藥性產(chǎn)生、水產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類健康造成的潛在危害性，在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中要采用藥敏試驗(yàn)篩選有效藥物進(jìn)行抗生素的合理應(yīng)用[16]，嚴(yán)格貫徹和落實(shí)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的獸用抗菌藥使用減量行動(dòng)，推進(jìn)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的綠色發(fā)展。

4 結(jié)論

上海青浦養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦黃腿病的病原菌是豚鼠氣單胞菌，生產(chǎn)上可選用新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等漁用抗生素進(jìn)行防治。