基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的五苓散多成分-多靶點-多通路作用機制研究

曹銘晨，于振英，辛兆洋，徐龍，楊智威 ，任煒，邢曉敏，荊凡波

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266000)

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的特點,采用傳統(tǒng)“一個藥物，一個靶標(biāo)，一種疾病”的理念模式難以全面闡述其復(fù)雜的作用機制。系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、計算機輔助藥物設(shè)計等新技術(shù)的發(fā)展，為從系統(tǒng)水平闡明中藥及復(fù)方的作用機制、篩選活性成分、經(jīng)方優(yōu)化和新復(fù)方配伍的研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐[1-2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，整合各種藥物、生物學(xué)數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)手段分析和構(gòu)建藥物-基因-靶點蛋白-疾病的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型，預(yù)測藥物作用靶點，并從生物網(wǎng)絡(luò)平衡的系統(tǒng)水平觀察藥物作用機制，具有整體性、系統(tǒng)性的特點，與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治、組方配伍的原則以及中藥多成分、多靶點調(diào)控機體不謀而合[3]。

五苓散出自漢代張仲景《傷寒論》，由白術(shù)、澤瀉、豬苓、茯苓、桂枝組成，方中諸藥配伍，共奏淡滲利濕、健脾助運、溫陽化氣、解表散邪之功，主治太陽蓄水證(水飲內(nèi)停)，由表證未解、陽氣被遏、膀胱氣化不利、脾不輸精所致。因五苓散利水、利尿作用顯著，不少學(xué)者將其視為中醫(yī)的“利尿劑”[4]。然而，五苓散的藥理作用具有綜合性、非單一性的特點，認(rèn)為五苓散專治蓄水證或用于表證的思想是片面的[5]。五苓散的臨床應(yīng)用廣泛，涉及水腫、泌尿系統(tǒng)、關(guān)節(jié)病、眩暈、頭痛、癲癇、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等[4-6]。

現(xiàn)代藥理學(xué)已在細(xì)胞層面和基因轉(zhuǎn)錄水平上對五苓散開展相關(guān)研究，但動物實驗篩選的周期長、成本高且工作量大，其分子層面機制尚不完全明確。目前尚無應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從系統(tǒng)層面探討五苓散分子作用機制的相關(guān)文獻，本研究系統(tǒng)納入五苓散的活性成分預(yù)測、靶點預(yù)測和藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)分析，從分子水平預(yù)測并探討五苓散多成分、多靶點的整體調(diào)控作用，為深入開展五苓散的基礎(chǔ)實驗研究及臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 研究工具

基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[7]、DrugBank數(shù)據(jù)庫[8]獲取五苓散主要成分信息，基于PharmMapper數(shù)據(jù)庫[9]、全球蛋白質(zhì)資源(universal protein resource，UniProt)[10]、Pubchem數(shù)據(jù)庫[11]預(yù)測可能存在的相互關(guān)系、靶點和基因信息；Cytoscape 3.5.1軟件[12]構(gòu)建化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)；基于DAVID數(shù)據(jù)庫[13]、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[14]、STRING數(shù)據(jù)庫[15]、R語言包3.5.1(R version 3.5.1)[16]進行通路富集分析。

2 研究方法

2.1 中藥化學(xué)成分收集與篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫是整合藥物化學(xué)、藥物代謝動力學(xué)和藥物-靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)-疾病網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)平臺，通過數(shù)學(xué)和計算模型對中藥化學(xué)成分進行毒藥物動力學(xué)(ADME)的預(yù)測，其關(guān)鍵參數(shù)為口服生物利用度 (oral bioavailability, OB)、半衰期(half-life，HL)和藥物相似性評價(drug-likeness，DL)。一般認(rèn)為OB大的化學(xué)成分口服生物利用度好，IDL≥0.15的分子類藥性較高。通過檢索TCMSP、Pubchem數(shù)據(jù)庫，結(jié)合文獻篩選五苓散中已知活性成分中滿足XOB≥20%、IDL≥0.18和THL≥4 h的化合物為候選活性成分。

2.2 分子反向?qū)蛹夹g(shù)預(yù)測五苓散活性成分的潛在靶點

PharmMapper是基于反向藥效團匹配法的化學(xué)小分子潛在靶點和生物活性預(yù)測的服務(wù)器。將五苓散中篩選得到的活性成分以成分名作為關(guān)鍵詞輸入Pubchem數(shù)據(jù)庫中進行檢索,查找并保存各活性成分的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)式為.sdf格式, 提交到PharmMapper進行靶點預(yù)測, 相關(guān)參數(shù)選擇: Generate Conformers=Yes；Maximum Generated Conformations=100；Select Targets Set=Human Protein Targets Only; Number of Reserved Matched Targets=100, 預(yù)測得到與各化合物相關(guān)的target name、gene、Uniprot ID、fit score等參數(shù)。剔除相同靶點后將靶點名輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)一命名為基因名。

2.3 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將候選活性成分、相關(guān)靶點信息導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點(node)代表化合物、基因、蛋白質(zhì)等靶點，節(jié)點與節(jié)點之間的連接(edge)代表相互作用，節(jié)點度值(Degree)表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點連接的路線數(shù)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

STRING數(shù)據(jù)庫是儲存已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)之間直接、間接相互作用信息的數(shù)據(jù)庫，對每個蛋白相互作用程度都有一個P值，值高則蛋白相互作用的置信度高。五苓散活性成分的相關(guān)靶點基因上傳至在線STRING數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白相互作用信息，選取打分值大于0.9的最高置信度的數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，探索五苓散靶點蛋白在系統(tǒng)水平上的相互作用。

2.5 GO富集分析

David數(shù)據(jù)庫整合多種數(shù)據(jù)庫信息，采用改進的Fisher精確檢驗算法對基因集進行富集分析，采用David v6.8數(shù)據(jù)庫對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進行基因本體GO(gene ontology)富集分析，探索五苓散活性成分的靶點蛋白在基因功能中的作用，獲取分析結(jié)果的P值，應(yīng)用R軟件繪制GO富集分析結(jié)果的條形圖。

2.6 KEGG通路富集分析

利用Cytoscape軟件對KEGG通路富集分析中的信號通路構(gòu)建靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用David V6.8數(shù)據(jù)庫對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進行KEGG生物通路富集分析，探索五苓散活性成分的靶點蛋白在信號通路中的作用。將活性成分的相關(guān)靶點基因列表導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，勾選OFFICIAL_GENE_SYMBOL、Gene list、Submit list，選擇基因功能分類工具，修改背景為人類，選擇Pathway，篩選P<0.01的通路確定為可靠通路，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫進行通路注釋和分析。利用R語言對主要代謝通路、生物過程進行繪圖分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 五苓散活性化合物的篩選

根據(jù)藥學(xué)參數(shù)篩選出五苓散中50種潛在的活性化合物，表1列出主要活性化合物的參數(shù)如分子量(molecular weight，M)、脂水分配系數(shù)(Lipid-water partition coefficient，ALogP)、生物利用度 (Oral bioavailability, OB)、腸上皮通透性(Caco-2)、血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)、半衰期(Half-life，HL)和藥物相似性評價(drug-likeness，DL)。

表1 五苓散組分活性成分及其藥動學(xué)參數(shù)

續(xù)表1

3.2 五苓散化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將五苓散中活性成分看作整體，構(gòu)建的化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中(圖1)共含459個節(jié)點( 50個化合物節(jié)點和409個靶點節(jié)點)，該網(wǎng)絡(luò)通過化合物-靶點的相互作用，揭示了五苓散的潛在相互作用關(guān)系。根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)分析網(wǎng)絡(luò)中度值較大的潛在關(guān)鍵靶點，五苓散化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)平均度值為5.4，每個靶點平均度值為3.02，其中50個靶點能與大于等于20個化合物發(fā)生相互作用，證明了五苓散多成分與多靶點共同作用的特點?；衔?靶點網(wǎng)絡(luò)中度值≥20 的關(guān)鍵靶點包括RNA冷休克域結(jié)合蛋白E1(CSDE1)、磷酸核糖焦磷酸合成酶1(PRPS1)、17β-雌二醇脫氫酶IV(HSD17B4)、酪蛋白水解蛋白酶P(CLPP)、含?；鵆oa結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白7(ACBD7)、鋅-α2糖蛋白(AZGP1)、鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶IV(Camk4)、Glu/Asp豐富羧基端域Cbp/p300相互作用反式激活因子2(CITED2)、G蛋白信號調(diào)節(jié)因子6(RGS6)、轉(zhuǎn)錄起始因子TFIID亞基13(TAF13)等。其中，度值較高的CSDE1、PRPS1和HSD17B4分別能與46、44和42個化合物發(fā)生相互作用。

圖1 五苓散化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Compound-target network of Wulingsan

3.3 PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)

基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，構(gòu)建了五苓散的在靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖2) 。PPI網(wǎng)絡(luò)包含155個節(jié)點和527條相互作用關(guān)系(連線)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)，其中介數(shù)(betweenness centrality，BC)和度值大于均值(介數(shù)=0.0255，度值=6.8)的關(guān)鍵節(jié)點，包括CSDE1、CITED2、RANBP2、HSD17B4、TAF13、SOD2、ARHGAP11、ARHGEF12、CAMK4、TP53等，其中，度值最高的CSDE1能與45個蛋白發(fā)生相互作用，度值緊隨其后的CITED2和RANBP2分別能與42和39個蛋白發(fā)生相互作用。

圖2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Protein-protein interaction network of Wulingsan

3.4 GO功能富集分析

根據(jù)調(diào)整的P值(Padjust<0.005)列出前20條GO途徑(圖3)，說明五苓散在細(xì)胞組成相關(guān)條目主要涉及細(xì)胞溶質(zhì)；生物過程相關(guān)條目主要涉及細(xì)胞對有機物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、上調(diào)代謝進程、含氮物質(zhì)代謝、有機物循環(huán)代謝進程等方面；分子功能相關(guān)條目主要涉及催化活性、蛋白結(jié)合、有機物循環(huán)結(jié)合、小分子結(jié)合、離子結(jié)合及轉(zhuǎn)運活性等方面。

圖3 GO通路富集分析條形圖Fig.3 Bar graph of the GO pathway enrichment analysis

3.5 KEGG分析

KEGG通道分析主要涉及膀胱癌、前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗等途徑，通路富集基因ID見表2。根據(jù)調(diào)整的P值(Padjust<0.05)列出前10條通路(圖4)。

表2 KEGG通路富集分析靶點基因ID

圖4 KEGG通路富集分析點狀圖Fig.4 Dot plot of the KEGG pathway enrichment analysis

4 討論與結(jié)論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法確證了五苓散在人體水液代謝平衡中的調(diào)節(jié)作用。五苓散的活性成分通過影響細(xì)胞溶質(zhì)、有機物質(zhì)和刺激的反應(yīng)、上調(diào)代謝、小分子物質(zhì)、離子、蛋白的結(jié)合、轉(zhuǎn)運活性等途徑，調(diào)控人體內(nèi)水液代謝及電解質(zhì)的平衡。五苓散幾乎參與了水液代謝的全過程，其主病證也大多與水液代謝障礙有關(guān)，不局限在“利小便”。研究表明五苓散具有根據(jù)機體的狀態(tài)及時雙向調(diào)節(jié)水液代謝的作用，機體脫水狀態(tài)時呈抗利尿作用，而水腫狀態(tài)時則產(chǎn)生利尿作用，使水液輸布有道[17]。此外，KEGG富集分析提示膀胱癌、前列腺癌代謝通路與五苓散存在高度相關(guān)性，這兩個靶器官與人體的水液代謝密切相關(guān)，從另一方面反映了五苓散作為“中醫(yī)利尿劑”的高度選擇性。目前尚未有五苓散應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)腫瘤治療的研究，已有研究表明HSD17B4在前列腺癌、膀胱癌、肝癌組織和細(xì)胞中表達明顯增加，而五苓散與HSD17B4[18]存在高度親和性，HSD17B4通過氧化較高生物活性的雌二醇為低活性的雌酮，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)雌二醇的分泌量而影響腫瘤進展[19]。五苓散是否通過影響類固醇激素代謝過程從而影響泌尿系統(tǒng)腫瘤的發(fā)展進程，有待進一步研究。

痛風(fēng)是人體嘌呤代謝紊亂和(或)血尿酸增高的疾病，其生化標(biāo)志是高尿酸血癥，主要與機體長期嘌呤代謝紊亂、尿酸排泄障礙有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為痛風(fēng)性疾病屬“熱痹”、“痛痹”范疇，治療以“活血止痛、利水滲濕”為原則[20]。五苓散的病機為津液運化失常、水濕停聚，從其病機出發(fā)辨證運用治療痛風(fēng)亦有顯效。本研究發(fā)現(xiàn)五苓散的活性成分與有機物質(zhì)的代謝、循環(huán)及含氮物質(zhì)的代謝途徑密切相關(guān)。研究表明磷酸核糖焦磷酸合成酶1(PRPS1)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)及黃嘌呤氧化酶(XO)的基因多態(tài)性與嘌呤代謝異常密切相關(guān)，已有7個超活性的PRPS1單堿基突變被證明與尿酸生成增多和遺傳性痛風(fēng)有關(guān)[21]。反向分子對接技術(shù)顯示五苓散活性成分與PRPS1存在高度親和性，提示其除通過促進水液排泄的作用加速尿酸排出外，還可能通過影響PRPS1的活性而發(fā)揮調(diào)節(jié)嘌呤代謝的作用。目前研究藥物抑制尿酸生成機制的靶點主要集中在XO，五苓散是否通過PRPS1靶點調(diào)控嘌呤代謝值得深入地研究。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以慢性、對稱性多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹鞯穆宰陨砻庖咝约膊?，中醫(yī)認(rèn)為屬于“痹癥”范疇，其病因病機主要為濕濁留滯體內(nèi)不化，循經(jīng)竄絡(luò)，流注關(guān)節(jié)。RA治療應(yīng)以化氣利水、健脾祛濕為原則，五苓散應(yīng)用于RA治療取得良好效果。本文推測五苓散可能通過調(diào)節(jié)骨骼間隙液的狀態(tài)來影響流體剪切力(fluid shear stress，F(xiàn)SS)，從而在骨關(guān)節(jié)炎癥的治療上發(fā)揮重要作用。研究指出FSS是骨骼細(xì)胞在體內(nèi)受到的主要受力形式，骨骼的應(yīng)力通過骨骼組織間隙液流動，F(xiàn)SS作用于骨骼細(xì)胞，調(diào)控成骨細(xì)胞代謝，通過影響骨細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化等過程參與骨骼系統(tǒng)改建[22]。Lim等[23]研究發(fā)現(xiàn)，下頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過FSS作用后，骨唾液酸蛋白、Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶和骨橋蛋白等表達增強，說明FSS促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達。FSS還通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5途徑(ERK5)誘導(dǎo)環(huán)氧合酶2(COX-2)基因的表達，在骨關(guān)節(jié)炎癥進程中發(fā)揮重要作用[24]。此外，Ezrin、Radixin、Moesin蛋白影響成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖而在RA進程中發(fā)揮重要作用，五苓散可能通過調(diào)控此通路影響RA進程[25]。

五苓散活性成分與心血管系統(tǒng)疾病的某些靶點如鋅-α2糖蛋白(Zinc-alpha-2-glycoprotein, AZGP1)、FSS等也存在高度親和性。研究表明FSS在動脈粥樣硬化的進展上發(fā)揮重要的作用，體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在不同F(xiàn)SS作用下，其micro RNAs表達水平出現(xiàn)顯著差異，進而調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的生長周期和凋亡以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[26-27]。Kohlstedt等[28]發(fā)現(xiàn)FSS通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞AMPKα2途徑，上調(diào)p53的磷酸化和miR-143/145的表達，抑制內(nèi)皮血管緊張素轉(zhuǎn)換酶表達；CHEN等[29]的研究表明FSS通過上調(diào)miR-101的表達，抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表達和內(nèi)皮細(xì)胞增殖。此外，慢性心力衰竭患者尿液中的AZGP1水平升高[30]，五苓散是否能降低慢性心衰患者的AZGP1水平還有待研究。

此外，五苓散可能在神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控方面發(fā)揮作用?！督饏T要略》指出五苓散可用于癲眩之水氣病，凡辯證屬水氣濕濁泛濫所致癲癇、頭痛、眩暈病者，用本方可獲良效，有報道指出五苓散治療偏頭痛、頑固性偏頭痛、癲癇效果良好[4-6]。反向分子對接分析提示五苓散活性成分可能與CSDE1、CAMK4、AZGP1、ACBD7存在高度親和性，這些靶點與神經(jīng)系統(tǒng)存在密不可分的聯(lián)系。如CSDE1可能是自閉癥的風(fēng)險基因，通過影響STX1A來影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[31]；ACBD7是一種強效的厭食性神經(jīng)肽，通過黑皮質(zhì)素系統(tǒng)的瘦素來發(fā)揮厭食或產(chǎn)熱作用，以調(diào)節(jié)機體的能量代謝平衡[32]；CAMK4參與小鼠小腦組織的長時程抑制信號途徑，其在基因和蛋白水平的表達程度將影響小鼠小腦的學(xué)習(xí)和記憶功能。還有研究發(fā)現(xiàn)AZGP1可能是治療癲癇的潛在新靶點，通過抑制TGF-β介導(dǎo)的ERK磷酸化以及TNF-α和IL-6介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥從而抑制癲癇發(fā)作[33]，臨床辨證應(yīng)用五苓散治療癲癇取得了較好效果，是否通過此靶點發(fā)揮抗癲癇作用尚不明確。五苓散在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的應(yīng)用和研究并不多見，值得深入研究。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對五苓散的活性成分和作用機制進行了探討，對可能的作用靶點和代謝通路展開分析，為深入研究五苓散的分子作用機制提供了新方向。