花蕾型忍冬新種質(zhì)組培技術(shù)研究

曾慧杰， 蔡 能， 王曉明， 李永欣，喬中全， 劉思思， 陳 藝， 王湘瑩

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004； 2.林木無(wú)性系育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

忍冬科忍冬屬植物忍冬L.japonicaThunb是我國(guó)傳統(tǒng)藥材金銀花的藥源植物[1]，應(yīng)用歷史悠久[2]，在制藥、香料、保健食品、飲料、化妝品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[3]。目前我國(guó)栽培的忍冬品種均為花冠開裂的品種，作者在山東進(jìn)行忍冬種質(zhì)資源調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)了花冠不開裂的花蕾型忍冬新種質(zhì)，與現(xiàn)在栽培種相比，具有花蕾期長(zhǎng)、采摘方便、產(chǎn)量高等優(yōu)良特性，開發(fā)利用前景廣闊。因此，對(duì)該種質(zhì)的高效繁育技術(shù)進(jìn)行研究，以期加快其推廣利用。

忍冬植物的繁殖多采用扦插、嫁接和組培方式，其中組織培養(yǎng)具有繁殖速度快，增殖系數(shù)高，不受季節(jié)、氣候、環(huán)境等條件限制，可全年生產(chǎn)的特點(diǎn)[4]。目前市場(chǎng)栽種的‘金豐1號(hào)’[5]、‘蒙花’[6-7]、‘中花1號(hào)’[8]、‘九豐1號(hào)’[9]、‘金花3號(hào)’[10]和‘花瑤晚熟’[11]等忍冬品種已有開展組培研究的報(bào)道；忍冬植物的葉片作為外植體可誘導(dǎo)形成愈傷組織[12-13]，Kim[14]用日本金銀花的合子胚為材料，開展了體胚發(fā)生和植株再生研究，Wang等[15]誘導(dǎo)出了金銀花‘金翠蕾’的體胚。這些研究在忍冬植物的組培方面取得了一定進(jìn)展，為一些品種苗木的快繁提供了技術(shù)支撐。但忍冬植物的組培具有較強(qiáng)的品種差異性，針對(duì)新發(fā)現(xiàn)的花蕾型忍冬新種質(zhì)，還需要研究與其相適宜的組培技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 參試的花蕾型忍冬材料種植在湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)林場(chǎng)的忍冬種質(zhì)資源圃。從健康植株的當(dāng)年新生枝條上剪取嫩枝，要求長(zhǎng)勢(shì)旺，無(wú)破損和病蟲害，嫩枝采集后，用冰袋低溫保濕帶回實(shí)驗(yàn)室，去除葉片，保留葉柄，利用頂端5～6 cm的枝條作為外植體材料。

1.1.2 植物激素 6-BA(6-芐氨基嘌呤)、NAA(萘乙酸)、ABT6(生根粉6號(hào))、IAA(吲哚丁酸)、IBA(吲哚丁酸)和KIBA(吲哚丁酸鉀鹽)等植物激素購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備 超凈工作臺(tái)：SW-CJ-1FD (中國(guó))；超純水系統(tǒng)：MILLIPORG MILLI-Q DIRECT 8(美國(guó))。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 繼代培養(yǎng) 外植體接種到培養(yǎng)基后，選取萌芽的外植體材料進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

(1) 設(shè)計(jì)了MS、3/4MS、DKW、N6共4種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基分別添加BA0.5+NAA0.1+蔗糖40 g·L-1，以篩選適宜的繼代培養(yǎng)基。

(2) 試驗(yàn)篩選出的優(yōu)勢(shì)基本培養(yǎng)基，分別添加BA和NAA植物激素，研究其對(duì)繼代增殖的影響。①設(shè)置4種BA的濃度水平，分別為0.3、0.5、1.0、1.5 mg·L-1，研究BA濃度對(duì)組培苗增殖的影響；NAA濃度固定為0.1 mg·L-1。②設(shè)置4種NAA的濃度水平，分別為0.05、0.1、0.2、0.3 mg·L-1，研究NAA濃度對(duì)組培苗增殖的影響；BA濃度固定為1.0 mg·L-1。

1.2.2 生根培養(yǎng) 從組培苗上分別剪取3.0～3.5 cm長(zhǎng)的小苗，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；以1/2MS為基本生根培養(yǎng)基，添加活性炭150 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1；共設(shè)計(jì)了6種濃度的IBA處理，分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L-1。

1.2.3 組培試驗(yàn)調(diào)查

(1) 繼代培養(yǎng)調(diào)查：每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種3個(gè)基本一致的外植體，3個(gè)重復(fù)；培養(yǎng)30 d后，調(diào)查忍冬組培苗增殖系數(shù)等生長(zhǎng)情況指標(biāo)。

(2) 生根培養(yǎng)調(diào)查：每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種組培苗5株，試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)25 d后，調(diào)查組培苗根系情況。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外植體消毒 試驗(yàn)材料在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理。對(duì)莖段外植體進(jìn)行消毒，將其切取成帶節(jié)莖段，每段長(zhǎng)2～3 cm，莖段先用75%酒精浸泡漂洗10～25 s，再無(wú)菌水沖洗3～4次，然后投入到加有2～3滴吐溫80(濃度0.1%)的升汞溶液中，浸泡3～5 min，最后用無(wú)菌水沖洗4～5次，瀝干備用。

1.3.2 外植體接種 將消毒后莖段外植體，剪取成1～1.5 cm長(zhǎng)的帶芽莖段，腋芽朝上，芽上部分稍短一些，芽下莖節(jié)要插入培養(yǎng)基，須稍長(zhǎng)一些；將下部切出新茬口的莖段，接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基MS上。

1.3.3 培養(yǎng)基制備 培養(yǎng)基的卡拉膠用量為8.0 g·L-1，蔗糖濃度為30～40 g·L-1，添加相應(yīng)的植物激素后，將pH值調(diào)至5.8；培養(yǎng)基用玻璃瓶分裝，每瓶35～40 mL，封蓋后用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20 min，溫度121 ℃，壓力1.1 kg·cm-2。

1.3.4 培養(yǎng)條件 繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境條件宜培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度為1500～2 000 lx，光照時(shí)間為每天12 h。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差的制作，采用Excel 2007軟件按常規(guī)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法汁算分析；數(shù)據(jù)多重比較用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蕾型忍冬新種質(zhì)組培繼代培養(yǎng)

2.1.1 基本培養(yǎng)基對(duì)組培苗繼代的影響 外植體在MS啟動(dòng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，逐步出現(xiàn)植株葉色有轉(zhuǎn)黃的趨勢(shì)，并有部分枯葉和死苗的現(xiàn)象，因此，本研究調(diào)整了基本培養(yǎng)基設(shè)計(jì)，以篩選能保持該忍冬新種質(zhì)組培苗旺盛生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基。

由表1可知，在4種基本培養(yǎng)基3/4MS、MS、N6、DKW上，繼代培養(yǎng)的植株的存活率分別為78.9%、82.2%、51.1%、93.3%，前三種培養(yǎng)基均出現(xiàn)了葉片發(fā)黃的現(xiàn)象，其中N6表現(xiàn)得最為嚴(yán)重，而且葉片也有耷拉下垂的問(wèn)題，平均株高也最低，僅1.85 cm；而效果最好的處理是DKW培養(yǎng)基，不僅存活率最高，平均株高最長(zhǎng)，植株長(zhǎng)勢(shì)也較旺，葉色嫩綠，葉片舒展。

2.1.2 激素濃度對(duì)繼代增殖的影響

(1) BA濃度對(duì)組培苗增殖的影響

由表2可知，在DKW培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不同濃度的BA對(duì)該忍冬新種質(zhì)組培苗的增殖效果和生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著影響。當(dāng)BA濃度在0～1.0 mg·L-1的范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)繁殖系數(shù)和不定芽長(zhǎng)度的影響表現(xiàn)出相似性規(guī)律，均是隨著BA濃度的升高而增加，但BA濃度超過(guò)1.0 mg·L-1后，增殖系數(shù)和不定芽長(zhǎng)度又呈下降趨勢(shì)。因此，在該忍冬新種質(zhì)繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中，BA適合的濃度是1.0 mg·L-1。

表2 BA濃度對(duì)組培苗增殖的影響Tab.2 The effect of BA concentration on proliferation of tissue culture seedlingsBA濃度/(mg·L-1)增殖系數(shù)不定芽長(zhǎng)度/cm0.32.13±0.26 c1.96±0.16 b0.53.06±0.29 b2.35±0.27 a1.04.95±0.54 a2.64±0.31 a1.53.38±0.36 b1.58±0.11 c 注:表中數(shù)據(jù)均為平均值及標(biāo)準(zhǔn)差,不同的小寫字母表示差異顯著。

(2) NAA濃度對(duì)組培苗增殖的影響

由表3可知，在DKW培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，當(dāng)BA濃度保持在1.0 mg·L-1時(shí)，NAA濃度與增殖系數(shù)呈負(fù)相關(guān)，隨著NAA濃度的升高，增殖系數(shù)卻逐漸降低，當(dāng)NAA濃度為0.05 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)最大值為4.86，其次是濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)為4.74，當(dāng)NAA濃度達(dá)到0.3mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)最小為3.27。

表3 NAA濃度對(duì)組培苗增殖的影響Tab.3 The effect of NAA concentration on proliferation of tissue culture seedlingsNAA濃度/(mg·L-1)增殖系數(shù)不定芽長(zhǎng)度/cm0.054.86±0.47 a1.75±0.16 c 0.14.74±0.52 a2.24±0.26 ab0.24.26±0.39 b2.48±0.28 a 0.33.27±0.35 c2.12±0.19 b 注:表中數(shù)據(jù)均為平均值及標(biāo)準(zhǔn)差,不同的小寫字母表示差異顯著。

就不定芽長(zhǎng)度而言，當(dāng)NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，不定芽的平均長(zhǎng)度最長(zhǎng)為2.48 cm，排第二是當(dāng)NAA濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，不定芽長(zhǎng)2.24 cm；而當(dāng)NAA濃度為0.05 mg·L-1的處理時(shí)，雖然增殖系數(shù)最高，但不定芽最短，僅1.75 cm。平衡考慮增殖系數(shù)與不定芽?jī)蓚€(gè)方面，在增殖培養(yǎng)中，NAA較適宜的濃度是0.1 mg·L-1。

可見適宜該忍冬種質(zhì)繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：DKW+BA1.0+NAA0.1+蔗糖40 g·L-1，增殖系數(shù)4.7。

2.2 花蕾型忍冬新種質(zhì)組培生根培養(yǎng)

由表4可知，IBA濃度對(duì)忍冬新種質(zhì)組培苗生根的影響顯著，隨著IBA濃度的上升，生根率、平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)均呈“上升-下降”的變化趨勢(shì)；其中，不添加IBA時(shí)，生根率為0，生根情況最好的是IBA濃度為3.0 mg·L-1的處理，生根率96.5%，平均根數(shù)4.6條，平均根長(zhǎng)2.73 cm，均顯著高于其他處理。該忍冬新種質(zhì)適宜的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA3.0+活性炭150 mg·L-1，生根率96.5%。

表4 IBA濃度對(duì)組培苗生根影響Tab.4 The effect of IBA concentration on of rooting cul-ture of tissue culture seedlingsIBA濃度/(mg·L-1)生根率/%平均根數(shù)/條平均根長(zhǎng)/cm0 0001.065.42.420.952.088.34.181.963.096.54.612.734.084.74.091.575.070.23.111.48

3 結(jié)論與討論

優(yōu)良的忍冬種質(zhì)資源只有得到推廣應(yīng)用，才能充分展現(xiàn)其優(yōu)良特性，產(chǎn)生最大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益，而優(yōu)良種質(zhì)的推廣運(yùn)用離不開科學(xué)的繁育技術(shù)，尤其是高效的組培快繁技術(shù)。

(1) 花蕾型忍冬新種質(zhì)組培的基礎(chǔ)培養(yǎng)選擇DKW時(shí)存活率最高93.3%，植株長(zhǎng)勢(shì)也較旺，葉色嫩綠，葉片舒展，這可能是因?yàn)槿潭鳛槟举|(zhì)藤本，在培養(yǎng)特性上，與木本植物的培養(yǎng)更為接近。

(2) 花蕾型忍冬新種質(zhì)繼代培養(yǎng)基中BA濃度在0～1.0 mg·L-1的范圍內(nèi)時(shí)，繁殖系數(shù)和不定芽長(zhǎng)度均隨著BA濃度的升高而增加，NAA濃度與增殖系數(shù)呈負(fù)相關(guān)；綜合考慮繁殖系數(shù)和不定芽長(zhǎng)度，適宜的繼代培養(yǎng)基為DKW+BA1.0+NAA0.1，增殖系數(shù)達(dá)4.7。

(3)花蕾型忍冬新種質(zhì)組培生根培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，隨著IBA濃度的上升，生根率、平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)均呈“上升-下降”的變化趨勢(shì)，適合的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA3.0+活性炭150 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，生根率96.5%，平均根數(shù)4.6條，平均根長(zhǎng)2.73 cm。