李一芷 燕麗容 袁 媛 徐 倩

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤病因與篩查研究室(110001)

背景：胃癌，特別是腸型胃癌是由非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎-異型增生-癌變的過程發(fā)展而來。目的：探討易于癌變的胃炎(萎縮性胃炎)和不易于癌變的胃炎(非萎縮性胃炎)的炎性細(xì)胞表型特征及其差異表達(dá)基因富集的通路。方法：從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE2669、GSE83389、GSE106656和GSE27411數(shù)據(jù)集，采用R語言篩選差異表達(dá)基因，并采用GSE116312數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證。三個“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”數(shù)據(jù)集篩選出的差異表達(dá)基因與炎性細(xì)胞表型特征基因取交集，篩選出的差異表達(dá)基因行REACTOME和KEGG分析。結(jié)果：在“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”的疾病動態(tài)鏈中，篩選出多種差異表達(dá)基因，以GSE116312數(shù)據(jù)驗(yàn)證后得到5個共同差異表達(dá)基因。3個數(shù)據(jù)集共篩選出85個炎性細(xì)胞表型特征基因，在“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎”疾病鏈中中性粒細(xì)胞比例較高，在“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”疾病鏈中為成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。REACTOME和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”疾病鏈中，差異表達(dá)基因富集于IL-10、IL-4和IL-13信號通路以及抗原處理與呈遞信號通路。結(jié)論：具有癌變潛能胃炎的炎性細(xì)胞表型特征多為巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，多富集于IL信號通路以及抗原處理與呈遞信號通路。

胃癌是世界上發(fā)病率占第四位、致死率占第三位的惡性腫瘤[1-2]。按Lauren分型，將胃癌分為腸型和彌漫型[3]。 彌漫型胃癌的病因和機(jī)制至今未完全清楚[4]，而腸型胃癌是由“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎-異型增生-癌變”的疾病鏈發(fā)展而來[5-6]。 從病理學(xué)角度來看，正常胃黏膜、非萎縮性胃炎、萎縮性胃炎均伴有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤。

一般而言，僅1%～3%的胃炎患者最終發(fā)展成為胃癌[7]。發(fā)展為胃癌的胃炎可能存在某些特定的特征。本研究通過應(yīng)用生物信息學(xué)比較易于癌變的胃炎(萎縮性胃炎)與不易于癌變的胃炎(非萎縮性胃炎)之間的差異表達(dá)基因，并進(jìn)一步分析這些差異表達(dá)基因中炎性細(xì)胞表型特征基因的分布情況，以及這些差異表達(dá)基因涉及的通路，旨在探索易于癌變胃炎的炎性特征及其可能涉及的通路，從而為闡明其涉及的富集通路提供一定的生物信息學(xué)依據(jù)。

資料與方法

一、研究設(shè)計(jì)

從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，并將明顯差異表達(dá)基因在GSE116312數(shù)據(jù)集中進(jìn)行驗(yàn)證；然后與炎性細(xì)胞表型特征基因取交集，篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)一步行REACTOME和KEGG通路分析。

二、微陣列數(shù)據(jù)選取

微陣列數(shù)據(jù)來自于GEO數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞為“非萎縮性胃炎、“萎縮性胃炎”和“異型增生”。納入的數(shù)據(jù)集需滿足以下要求：①樣本來源為人源樣本；②樣本分組需包含“非萎縮性胃炎”、“萎縮性胃炎”和“異型增生”中的兩組；③每組樣本例數(shù)大于3例。 經(jīng)仔細(xì)篩選后，共納入4個GEO數(shù)據(jù)集，分別為GSE2669、GSE83389、GSE106656和GSE27411。GSE2669數(shù)據(jù)集中，正常胃黏膜11例，非萎縮性胃炎26例，萎縮性胃炎22例；GSE83389數(shù)據(jù)集中，萎縮性胃炎62例，異型增生12例；GSE106656數(shù)據(jù)集中，非萎縮性胃炎14例，萎縮性胃炎7例；GSE27411數(shù)據(jù)集中，正常胃黏膜6例，非萎縮性胃炎6例，萎縮性胃炎6例。檢索最新發(fā)表的數(shù)據(jù)集(檢索時間截止至2020年9月30日)，將GSE116312數(shù)據(jù)集作為驗(yàn)證集。

三、炎性細(xì)胞表型特征基因分析

為評估“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”疾病鏈中炎性細(xì)胞表型特征的動態(tài)變化，利用差異表達(dá)基因與炎性細(xì)胞表型特征基因取交集，評估疾病動態(tài)鏈中炎性細(xì)胞表型特征的改變。

四、REACTOME通路分析

利用炎性細(xì)胞表型特征差異表達(dá)基因，使用REACTOME通路數(shù)據(jù)庫(https://reactome.org/PathwayBrowser/#/DTAB=MT&TOOL=AT)進(jìn)行REACTOME通路富集分析，以P<0.05設(shè)定為納入標(biāo)準(zhǔn)。

五、KEGG通路分析

對炎性細(xì)胞表型特征差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，使用R語言Cluster Profile 程序包中的enrichKEGG函數(shù)對差異基因進(jìn)行富集分析，設(shè)定參數(shù)：pvalueCutoff=0.01，qvalueCutoff=0.05。

六、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)對GSE27411以及GSE106656數(shù)據(jù)集中炎性細(xì)胞表型特征差異基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并可視化，以評估差異表達(dá)基因之間可能的相互作用關(guān)系。

七、數(shù)據(jù)處理

采用R軟件(版本3.4.3)進(jìn)行分析。為避免四組數(shù)據(jù)的本底差異，采用單獨(dú)分析再整合的方法進(jìn)行研究。當(dāng)方差齊時，使用Student-t檢驗(yàn)，否則使用Wilcoxon檢驗(yàn)。利用Benjamini & Hochberg法校正P值。P<0.01判定為存在差異。

結(jié) 果

一、“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎-異型增生”中差異表達(dá)基因

GSE2669數(shù)據(jù)集中，正常胃黏膜與非萎縮性胃炎之間有286個明顯差異表達(dá)基因，萎縮性胃炎與非萎縮性胃炎之間有970個明顯差異表達(dá)基因；GSE27411數(shù)據(jù)集中，正常胃黏膜與非萎縮性胃炎之間有744個明顯差異表達(dá)基因，萎縮性胃炎與非萎縮性胃炎之間有1 331個明顯差異表達(dá)基因；GSE83389數(shù)據(jù)集中，萎縮性胃炎與異型增生之間有1 506個明顯差異表達(dá)基因；GSE106656數(shù)據(jù)集中，萎縮性胃炎與非萎縮性胃炎之間有979個明顯差異表達(dá)基因。不同數(shù)據(jù)集中前五位差異表達(dá)基因見表1。

表1 不同數(shù)據(jù)集中位列前5位的差異表達(dá)基因

二、 “非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

采用GSE116312數(shù)據(jù)集對“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”疾病鏈中明顯差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示5個基因在GSE116312中存在與原數(shù)據(jù)集相同調(diào)控方向的差異表達(dá)(圖1)。

圖1 GSE2669、GSE106656和GSE27411數(shù)據(jù)集中“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”差異表達(dá)基因在GSE116312中的驗(yàn)證

三、炎性細(xì)胞表型特征基因分析

共篩選出85個炎性細(xì)胞表型特征基因，所屬炎性細(xì)胞分別為成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”疾病鏈中的比例均較高，分別為24.5%和22.2%。在“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎”中，中性粒細(xì)胞比例為30.6%；在“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”中，成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比例分別為25.0%和22.2%(表2)。

表2 炎性細(xì)胞表型特征基因在“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”疾病動態(tài)鏈中的比例n(%)

四、“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”差異表達(dá)炎性細(xì)胞表型特征基因的富集通路

REACTOME和KEGG通路分析顯示，在“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”疾病鏈中，差異表達(dá)基因主要富集于免疫過程，分別為IL-10、IL-4和IL-13信號通路以及抗原處理與呈遞信號通路(表3)。

表3 “非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”疾病動態(tài)鏈中差異表達(dá)炎性細(xì)胞表型特征基因的通路富集分析

五、PPI網(wǎng)絡(luò)

PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，GSE27411數(shù)據(jù)集中包含8個基因，分別為KIF20A、KIF2C、CENPE、NUSAP1、ACP5、COL1A1、FCGR1A和C5AR1；而GSE106656數(shù)據(jù)集PPI網(wǎng)絡(luò)中包含GSE27411的8個基因，以及另外15個基因(圖2)。

A：數(shù)據(jù)集GSE27411；B數(shù)據(jù)集GSE106656

討 論

在“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”的疾病動態(tài)變化過程中，炎性細(xì)胞的種類和數(shù)量變化蘊(yùn)含著非常豐富的生物學(xué)信息。本研究對GEO數(shù)據(jù)庫中全部可獲得的胃癌癌前狀態(tài)的信息進(jìn)行分析，納入了包含“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎-異型增生”變化過程的共計(jì)4個數(shù)據(jù)集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了逾千個差異表達(dá)基因，并與GSE116312數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，共發(fā)現(xiàn)了5個共同差異表達(dá)基因。進(jìn)一步分析炎性細(xì)胞特征表型基因發(fā)現(xiàn)，在“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎”疾病鏈中，中性粒細(xì)胞比例較高(30.6%)，而“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”疾病鏈中，成纖維細(xì)胞比例較高(25.0%)。中性粒細(xì)胞的主要功能為細(xì)胞的吞噬和消化，是機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時最先被招募至損傷位置的細(xì)胞，能通過釋放殺菌蛋白、細(xì)胞因子和活性氧等物質(zhì)發(fā)揮作用，是活動性胃炎的主要效應(yīng)分子。有研究顯示，腫瘤微環(huán)境中浸潤的中性粒細(xì)胞能削弱T細(xì)胞免疫，促進(jìn)胃癌的發(fā)展[8-9]。在“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎”動態(tài)變化中，中性粒細(xì)胞是否發(fā)揮類似作用成為促炎因素，還有待進(jìn)一步探索。成纖維細(xì)胞的主要功能為細(xì)胞修復(fù)。非萎縮性胃炎發(fā)展成為萎縮性胃炎時，胃黏膜變薄，固有腺體減少，是胃黏膜因各種原因?qū)е聯(lián)p傷的進(jìn)一步表現(xiàn)，可能與成纖維細(xì)胞增多相關(guān)。有研究[10-11]證實(shí)胃異型增生微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞能分泌癌細(xì)胞惡化所需的微環(huán)境因子，如Wnt5A等，從而發(fā)揮促腫瘤作用。說明成纖維細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中的一員，具有促進(jìn)、維持腫瘤細(xì)胞惡性表型的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”的疾病動態(tài)變化中的比例均較高，分別為24.5%和22.2%。說明巨噬細(xì)胞在疾病變化全程中可能均發(fā)揮重要作用。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞扮演重要角色[12-14]，能通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移[14-17]。Lin等[18]發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞分泌的CXCL8與CD8+T細(xì)胞浸潤減少有關(guān)，CXCL8通過作用于巨噬細(xì)胞，可減少巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1，進(jìn)而抑制CD8+T細(xì)胞的功能，使腫瘤細(xì)胞獲得免疫逃逸。本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在胃黏膜微環(huán)境炎性細(xì)胞中的比例較高，但其是否是易于癌變胃炎的特征以及其在癌變中的功能仍未明確，有待進(jìn)一步探索。

本研究進(jìn)一步行炎性細(xì)胞表型特征差異表達(dá)基因的富集通路分析，在“非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”疾病鏈中，多種與免疫活動相關(guān)的代謝通路發(fā)生了變化，主要富集于IL-10、IL-4和IL-13信號通路、抗原處理與呈遞信號通路等。IL-10是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是公認(rèn)的炎癥和免疫抑制因子，能抑制單核巨噬細(xì)胞的抗原遞呈作用[19-21]。Zhang等[22]的研究顯示分泌IL-10的巨噬細(xì)胞表型在多種腫瘤類型中發(fā)揮促進(jìn)免疫逃逸的作用，并與胃癌患者預(yù)后差有關(guān)。由此可見，IL-10信號通路和巨噬細(xì)胞在腫瘤形成以及癌前狀態(tài)中均發(fā)揮重要作用，并可能是某些特定炎癥易于癌變的重要原因，有待后續(xù)研究進(jìn)一步闡述。 IL-4和IL-13在一定程度上分享共同的受體和信號通路，是導(dǎo)致過敏反應(yīng)的關(guān)鍵性細(xì)胞因子[23]。IL-4和IL-13能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的活性，可能與腫瘤生長有關(guān)[24]。本研究顯示IL-4和IL-13信號通路可能在胃癌癌前狀態(tài)中起有作用。同時，抗原處理與呈遞信號通路的改變也是特定胃炎易于癌變的重要原因，有待后續(xù)研究的進(jìn)一步探索。

PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)了8個比較重要的差異表達(dá)基因，其中4個基因構(gòu)成了一個比較重要的網(wǎng)絡(luò)(KIF20A-KIF2C-CENPE-NUSAP1)。在這4個基因中，KIF20A和KIF2C均為驅(qū)動蛋白家族成員；CENPE為著絲粒蛋白，是一個與細(xì)胞周期相關(guān)的驅(qū)動蛋白樣分子；NUSAP1與紡錘體的形成有關(guān)。PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建顯示在非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎的變化過程中，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的相互作用可能發(fā)揮重要功能。

總之，本研究結(jié)果顯示，在“正常胃黏膜-非萎縮性胃炎-萎縮性胃炎”的疾病動態(tài)鏈中存在多種差異表達(dá)基因。相對于非萎縮性胃炎而言，萎縮性胃炎更傾向于癌變可能與微環(huán)境中炎性細(xì)胞表型特征基因的改變有關(guān)，成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可能發(fā)揮了重要作用；IL家族信號通路以及抗原處理與呈遞信號通路亦可能發(fā)揮了重要作用。但本研究結(jié)論仍需行進(jìn)一步研究證實(shí)，從而有助于胃癌發(fā)病的防控。