古麗米熱·依米提, 斯坎德爾·白克力, 王延蛟

新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院, 烏魯木齊 830011

肝癌是常見的惡性腫瘤之一, 其發(fā)病機制與癌基因的激活有關[1]。目前，對癌癥發(fā)生發(fā)展的研究主要集中在腫瘤相關基因的表達調控方面[2]。DEN二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)對人體和動物都存在劇毒性,即使是小劑量注射或口服給藥也會造成嚴重的肝損傷。DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型是目前研究分析人類肝細胞癌的發(fā)病機制和過程的理想動物模型[3]。非編碼小RNA與腫瘤類型密切相關[4]。非編碼RNA是一類不編碼蛋白質的基因轉錄產物，PIWI相互作用RNA(piRNA)是一種非編碼RNA[5]。Aravin等[6]在雄性小鼠睪丸組織中分離出一段小RNA，該RNA主要與Argnaute家族PIWI蛋白成員相互作用而將其命名為piRNA，piRNA是長度約為24～31 nt的新型非編碼RNA，piRNA在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[7]。piRNA不僅參與生殖細胞的調控，而且在宮頸癌、胃癌、乳腺癌和膀胱癌等多種癌細胞中均檢測到piRNA的異常表達[8]，piRNA與PIWI蛋白家族成員相結合才能發(fā)揮調控作用。研究表明，PIWI和piRNA的表達水平與腫瘤類型密切相關。PIWI/piRNA調控靶基因的穩(wěn)定性表達、轉錄及轉錄后水平的修飾[9]。已有研究發(fā)現，多種腫瘤中PIWI蛋白高表達，PIWI蛋白異常表達水平與腫瘤的惡性程度顯著相關[10]。PIWI可能還參與胃癌和其他癌癥的發(fā)展，并且是癌癥診斷的一個潛在標記[11]。PIWIL2 mRNA在肝癌中的表達量比腫瘤周圍的肝臟組織的表達量高(P<0.05)，Piwil2基因mRNA的表達與PIWIL2蛋白質的表達相關，PIWIL2有可能成為肝癌的檢測及治療的分子標志物[12]。PIWIL2可以通過控制p53作為STAT3信號通路的正調節(jié)，使p53基因發(fā)生修飾和沉默，從而抑制腫瘤細胞的凋亡發(fā)揮癌基因的作用[13]。PIWI/piRNA通路相關基因Piwil4、Mael和Ddx4作為候選癌基因在多種癌組織中表達，而在肝癌組織中的研究尚未見相關報道。

本研究以建立的大鼠肝癌動物模型為研究對象，通過ELISA方法檢測肝癌模型各組血清腫瘤標記物驗證大鼠肝癌病證動物模型；采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印跡技術(Western-blot)和免疫組織化學方法分別檢測肝癌模型組織中Piwil4、Mael、Ddx4基因mRNA和蛋白的表達水平，探討Piwil4、Mael、Ddx4基因在肝癌中表達水平變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康雄性40只Wistar大鼠(提供單位：新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，動物合格證號：65000700000538)，體重約(150±10)g，月齡約為6月。DEN購自Sigma公司。Mael、Piwil4、Ddx4和GAPDH引物合成自上海生工公司，Mael、Piwil4、Ddx4和GAPDH兔抗鼠單克隆抗體購自ABCAM公司，RNA提取試劑盒購自聚合美生物公司，蛋白裂解液購自Thermo公司。

1.2 肝癌動物模型建立與分組

選取雄性Wistar大鼠40只，飼養(yǎng)3 d后大鼠隨機分成肝癌模型組(自由飲用滅菌水配制的濃度為0.1 mg·mL-1的DEN 溶液，20只)和正常對照組(飲用滅菌水，普通飼料飼養(yǎng)，20只)。滿20周處死動物并取肝組織 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察大鼠肝癌模型肝組織病理形態(tài)學特征

分別取肝癌組小鼠肝組織和正常組小鼠肝組織，4% PFA溶液固定，石蠟包埋兩組肝組織切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理切片檢測組織形態(tài)特征。

1.4 酶聯免疫吸附劑(ELISA)測定模型各組中的腫瘤標記物(HSP、ARF、ASMA)

取血后，室溫下血液凝固2 h，4 ℃過夜，離心(3 000 r·min-1，4 ℃，10 min)，棄不溶物，將血清移至試管，置于-80 ℃保存。按照AFP-L3、HSP-70、ASMA ELISA試劑說明書要求，配標準曲線(AFP：64、32、16、8、4、0 ng·mL-1；HSP：400、200、100、50、25、0 pg·mL-1；ASMA：200、100、50、25、12.5、0 IU·L-1)，加入標準液，加入樣品，洗滌，測450 nm分光光度值，根據標準曲線計算各組血清中腫瘤標記物的表達量。

1.5 實時熒光定量(qRT-PCR)法檢測Piwil4、Mael和Ddx4基因的mRNA表達

用加強型組織/細胞RNA快速提取試劑盒(聚合美生物公司)提取總RNA，反轉錄成cDNA。所用引物均由上海生工公司合成，引物序列見表1。

實時熒光定量qRT-PCR按 SYBR Green RT-PCR試劑盒的操作步驟進行。充分混勻以上反應體系(25 μL)：12.5 μL SYBR Premix ExTaqTM，10.3 μL dd H2O，1 μL cDNA模板，1.6 μL上游引物，1.6 μL下游引物。PCR反應條件為: 95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，Tm30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 10 s延伸，40個循環(huán)(由設定點溫度增加0.5 ℃/s)。結果用目的基因在肝癌模型組相對于正常對照組的mRNA相對模板表達量差異倍數用2-ΔΔCt方法來計算，其中ΔΔCt=(CtTarget-CtGAPDH)處理-(CtTarget-CtGAPDH)對照。

表1 實時熒光定量PCR引物序列及擴增片段

1.6 蛋白質印跡法(Western-blot)檢測Piwil4、Mael和Ddx4基因在蛋白的表達

20周后處死動物并取各組肝組織立即用液氮研磨，加蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒對總蛋白進行定量。加6×電泳上樣緩沖液沸水浴10 min，SDS-PAGE電泳(80 V 30 min，100 V 40 min)，PVDF轉膜(80 mA,2 h 30 min)，封閉，一抗4 ℃孵育過夜(GAPDH 1∶5 000; PIWIL4 1∶1 000；MAEL 1∶2 000；DDX4 1∶1 000)，TBST洗膜5次，HRP標記(山羊抗兔1∶10 000)的二抗孵育2 h，TBST洗膜5次，加入ECL化學發(fā)光試劑進行曝光。

1.7 免疫組織化學法檢測Piwil4、Mael和Ddx4基因的蛋白表達水平

60 ℃溫箱中烘烤60 min；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡15 min，95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇浸泡5 min，洗滌；用沸騰的10 mmol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液洗滌，3% H2O2-甲醇溶液中洗滌15 min，5%山羊血清室溫封閉40 min，加一抗過夜，洗滌，加酶標二抗孵育40 min，洗滌，DAB顯色液顯色10 min，蒸餾水終止顯色，蘇木素染液復染10 min，脫色反藍，封片，顯微鏡拍片。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果與分析

2.1 肝癌組織病理形態(tài)學特征

成功建立大鼠肝癌模型，正常組大鼠肝組織細胞結構完整，肝細胞排列規(guī)則，細胞核形態(tài)正常。肝小葉結構正常，未見纖維間隔，未見細胞水腫，未見壞死肝細胞(圖1)。肝癌模型組大鼠肝細胞呈多角形，異型性明顯，胞漿豐富，嗜酸性，核大，圓形，有清楚的核仁。分化差異癌細胞異型性明顯，常有巨核及多核瘤細胞(圖1)。

圖1 HE染色觀察肝臟病理形態(tài)特征

2.2 肝癌模型組織中腫瘤標記物(HSP、ARF、ASMA)表達水平

結果(圖2)表明，腫瘤標記物AFP肝癌模型組(6.70±3.17)與正常對照組(0.98±0.13)差異極顯著(P<0.05)；腫瘤標記物ASMA肝癌模型組(62.63±2.65)與正常對照組(48.09±4.23)差異極顯著(P<0.05)；腫瘤標記物HSP肝癌模型組(27.43±3.18)與正常對照組(6.64±4.57)差異極顯著(P<0.05)。

圖2 肝癌模型組織中腫瘤標記物表達變化

2.3 肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4基因的mRNA表達水平

結果(圖3)表明，肝癌模型組織中Piwill4、Mael和Ddx4mRNA相對表達水平分別為114.8±15.74、5.66±2.02、15.07±6.17，正常對照組mRNA相對表達水平分別為1.18±0.23、1.27±0.27、1.57±0.49。在肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA表達水平明顯高于正常肝組織(P<0.05)。

2.4 Western-blot法檢測肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白表達水平

結果(圖4)表明，肝癌模型組中PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白表達水平分別為2.23±0.49、0.14±0.02、1.36±0.12，正常對照組蛋白表達水平分別為0.85±0.15、0.04±0.05、0.71±0.11。在肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL和DDX4 蛋白表達水平明顯高于對應的正常肝組織(P<0.05)。

圖3 肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4 mRNA的相對表達水平

圖4 肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL、DDX4蛋白表達水平

2.5 免疫組織化學法檢測肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白表達水平

結果(圖5)表明，肝癌模型組中PIWIL4、MAEL、DDX4蛋白表達水平分別為879.9±12.64、904.6±8.73、874.8±7.95，正常對照組蛋白表達水平分別為292.0±3.55、343.1±8.05、290.5±6.09。在肝癌模型組織中PIWIL4、MAEL、DDX4蛋白表達水平明顯高于對應的正常肝組織，在肝癌模型組織中高表達(P<0.05)。

圖5 PIWIL4、MAEL和DDX4蛋白的表達水平

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類健康，目前認為其發(fā)病受遺傳因素和環(huán)境因素雙重影響。對肝癌的發(fā)生及發(fā)展主要集中在腫瘤相關基因的調控等方面的研究。

PIWI/piRNA不僅在人睪丸和造血干細胞大量表達，也在多種腫瘤組織和腫瘤細胞株有異常表達。在乳腺癌等腫瘤中，PIWI蛋白在腫瘤表達量與惡性程度呈正相關[14]。PIWI蛋白含量用于判斷腫瘤惡性程度在胃癌、胰腺癌、食管鱗狀細胞癌、肉瘤和肝細胞癌的研究中已得到證實[15]。

Piwil2與Piwil4都是PIWI家族亞成員，PIWIL2在惡性腫瘤中過度表達使抑癌基因沉默，促進腫瘤的發(fā)展[16]。Piwil2基因的高表達誘導抗凋亡基因Bcl-xL的過表達，引起STAT3基因的表達上升，激活STAT3/BCL-XL通路抑制腫瘤細胞凋亡[17]。在結腸癌及其癌旁組織中，Piwil2的異常表達可促進腫瘤的轉移與病人生存期呈負相關[18]。PIWIL4蛋白參與修復p53蛋白的突變，促進p53蛋白發(fā)揮功能[19]，PIWIL4蛋白的低表達會影響miRNA的穩(wěn)定性[20]。2010年蘇暢等[21]發(fā)現Piwil4基因在人宮頸癌組織中的表達水平較正常組織髙，能夠促進細胞的生長活性和增殖能力，并能抑制其凋亡。

Mael與Ddx4(Vasa)基因與PIWI通路相關，研究發(fā)現Mael基因在結直腸癌等癌組織中異常高表達[22]。徐景波等[23]研究發(fā)現DDX4高表達與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。李斌等[24]研究發(fā)現，靶向沉默Ddx4基因可明顯抑制裸鼠食管鱗癌細胞成瘤，Ddx4基因沉默可能是通過抑制 PI3K的活性，由此參入并下調 PI3K/Akt 信號通路，進而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用。

本研究對肝癌模型中的腫瘤標記物在肝癌模型組織中的腫瘤標記物含量高于正常對照組含量，可以推測腫瘤標記物在肝癌模型組織中的表達升高。qRT-PCR及Western-blot方法檢測，結果表明肝癌模型組織中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA和蛋白表達水平明顯高于對應的正常組織(P<0.05)。Piwil基因mRNA的表達與PIWIL蛋白質的表達有相關性。提示Piwi基因的mRNA表達及蛋白表達與肝癌的惡性程度及預后有關。綜上所述，研究表明，Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA及蛋白在肝癌模型組織中高表達，對肝癌的早期診斷提供一定的依據。肝癌模型組織中PIWI基因表達水平有望作為肝癌的檢測及治療的一種分子標志物。