游 焜， 王大軍， 王 亮， 王建國

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 肝膽外科， 河南 新鄉(xiāng) 453100

肝癌是臨床上發(fā)病率僅次于食管癌和胃癌的消化系統(tǒng)腫瘤，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。原發(fā)性肝癌起源于肝臟的上皮或間葉組織，且原發(fā)性肝癌的發(fā)病是一個(gè)多因素的復(fù)雜過程，與HBV和HCV感染[2-3]、黃曲霉素[4]、酒精和非酒精因素導(dǎo)致的肝損傷[5-6]等因素有密切關(guān)聯(lián)。NOR1(oxidored-nitro domain containing protein1) 基因是由中南大學(xué)腫瘤研究所克隆的基因，定位于1p34.2,基因組DNA總長33.4 kb，包含11個(gè)外顯子，編碼389個(gè)氨基酸殘基，在人類組織中廣泛表達(dá)[7]。最近發(fā)現(xiàn)該基因與肝癌發(fā)生發(fā)展有著重要關(guān)系，研究[8]顯示，NOR1在人肝癌組織中表現(xiàn)出高表達(dá)水平，且敲除NOR1基因的小鼠對(duì)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)肝癌產(chǎn)生抗性，抑制小鼠肝癌的發(fā)生發(fā)展，說明NOR1基因可能是肝癌相關(guān)的抑瘤、易感基因候選者。Notch基因最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，Notch信號(hào)通路除了在調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、器官的分化和發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用，還對(duì)多種腫瘤的發(fā)展起到調(diào)節(jié)作用[9-10]。近年來，使用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行基因治療及基因功能研究備受關(guān)注。本研究旨在探究敲除NOR1基因后對(duì)Notch信號(hào)通路活性、肝癌裸鼠移植瘤生長、模型裸鼠存活率以及細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，為肝癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性BALB/C裸鼠，4～6周齡，體質(zhì)量16～20 g，共30只，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)[SCXK (湘) 2016-0002]；人肝癌細(xì)胞株HepG2購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自武漢四季青生物制品公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA購自日本TaKaRa公司；蘇木素伊紅染色試劑盒購自碧云天公司；EDTA抗原修復(fù)緩沖液購自福州邁新生物公司；DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司；RIPA裂解液購自碧云天公司；Ki-67、Caspase-3、Notch1、NICD、Hes1、Hey1抗體均購自英國Abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，垂直電泳槽購自美國Bio-Rad公司。本方案經(jīng)由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：2018-12-5)，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人肝癌細(xì)胞株HepG2接種于含10%的胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行傳代，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，待其生長密度達(dá)到50%時(shí)，將無序序列質(zhì)粒 (Scramble) 和siNOR1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。操作步驟按照轉(zhuǎn)染試劑盒執(zhí)行即可，48 h后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞接種于96孔板(100 μl/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入50 μL 1×MTT溶液，孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μl DMSO，用平板搖床搖勻，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)各劑量OD值。

1.4 裸鼠肝癌皮下移植瘤模型的建立及分組 轉(zhuǎn)染后，將各組HepG2細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，分別接種于裸鼠的腋窩皮下，并根據(jù)接種的細(xì)胞將大鼠隨機(jī)分為Control組、Scramble組和siNOR1組，各組10只。飼養(yǎng)30 d，記錄裸鼠死亡時(shí)間和個(gè)數(shù)，30 d取出存活裸鼠皮下移植瘤標(biāo)本, 測(cè)量瘤的體積和質(zhì)量。

1.5 石蠟切片 將各組小鼠頸椎脫臼處死后，取出瘤體及肝、腎、肺、腦剪切成5 mm ×5 mm×5 mm大小的組織塊浸泡于4%多聚甲醛中固定48 h，常規(guī)方法制作厚度為4 μm的石蠟切片。

1.6 免疫組化檢測(cè) 取上述裸鼠模型瘤體組織切片，并按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟處理，滴加3%H2O2封閉過氧化物酶，使用0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行熱修復(fù)，5% BSA室溫封閉2 h，PBS清洗3次后分別孵育一抗Ki-67(1∶200)、Caspase-3(1∶500)，4 ℃封閉過夜，洗去一抗后孵育二抗，經(jīng)DAB顯色后于顯微鏡下觀察并圖像采集。

1.7 Western Blot檢測(cè) 取各組模型裸鼠瘤體組織，并充分勻漿，使用預(yù)冷RIPA裂解液充分裂解后提取各組裸鼠瘤體組織總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗脫后孵育一抗，4 ℃條件下孵育過夜，PBST洗脫一抗，加入對(duì)應(yīng)二抗室溫下孵育2 h，PBST洗脫后，加入BCL，進(jìn)行曝光，計(jì)算灰度值。

1.8 HE染色 取上述裸鼠模型各組織器官石蠟切片，分別在二甲苯中進(jìn)行脫蠟，再經(jīng)梯度酒精水化。將切片置于蘇木紫溶液中染色7 min后，蒸餾水洗凈后將切片放于0.5%鹽酸乙醇中30 s，自來水輕輕沖洗10 min，放入伊紅染液中浸泡3 min，蒸餾水浸泡，梯度酒精進(jìn)行脫水后經(jīng)二甲苯透明后滴加中性樹膠進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 3組裸鼠質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率比較 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，siNOR1組NOR1敲除效率顯著低于Control組(P<0.05)(圖1)，表明NOR1敲除成功。

2.2 3組裸鼠細(xì)胞增殖情況比較 采用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，siNOR1組第3、4、5、6天細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著高于Control組(P值均<0.05)(圖2)。

2.3 3組裸鼠腫瘤體積與質(zhì)量的比較 從建模第20天開始，與Control組相比，siNOR1組第20、25、30 天移植瘤體積顯著減小[(418.71±78.24)mm3vs (149.6.16±60.05)mm3、(864.22±125.66)mm3vs (239.83±100.51)mm3、(1468.45±199.78)mm3vs (446.54±147.09)mm3，P值均<0.05]；第30天時(shí)取出移植瘤，與Control組相比，siNOR1組移植瘤質(zhì)量顯著減小[(0.45±0.07)g vs (0.12±0.04)g，P<0.05](圖3)。

2.4 3組裸鼠Ki-67、Caspase-3、Notch、NOR1陽性表達(dá)率的比較 與Control組相比，siNOR1組移植瘤組織中Ki-67、Notch、NOR1陽性表達(dá)率顯著降低[Ki-67：(48.98±9.75)% vs (11.51±5.09)%；Notch: (62.51±9.26)% vs (18.75±4.61)%；NOR1:(76.33±8.31)% vs (16.57±3.76)%,P值均<0.05]，Caspase-3陽性表達(dá)率顯著升高[(6.39±4.67)% vs (38.03±9.28)%,P<0.05](圖4)。

注：a,第30天時(shí)移植瘤大?。籦、c，與Control組比較，*P<0.05。

圖3敲除NOR1基因?qū)σ浦擦錾L的影響

2.5 3組裸鼠生存率及Survivin蛋白表達(dá)量的比較 與Control組相比，siNOR1組模型裸鼠30 d內(nèi)生存率顯著高于Control組[(77.66±6.75)% vs (25.32±4.63)%，χ2=6.897,P<0.05]；Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，siNOR1組Survivin蛋白表達(dá)水平顯著降低(0.34±0.06 vs 0.02±0.01,P<0.05)(圖5)。

2.6 3組裸鼠Notch1、NICD、Hes1、Hey1蛋白表達(dá)量的比較 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，siNOR1組Notch1、NICD、Hes1、Hey1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(Notch1：0.16±0.03 vs 0.03±0.01；NICD：0.26±0.05 vs 0.04±0.02；Hes1：0.35±0.04 vs 0.06±0.02；Hey: 0.29±0.06 vs 0.05±0.02，P值均<0.05)(圖6)。

2.7 3組裸鼠各器官損傷程度比較 Control組和Scramble組小鼠肝組織肝索紊亂，肝細(xì)胞呈大小不等的空泡樣變，嗜酸性變，可見小灶性壞死；局部腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞有變性甚至壞死脫落，腎小管基底膜裸露；肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔內(nèi)可見壞死細(xì)胞，肺泡間隔增寬且有炎癥細(xì)胞浸潤；腦中神經(jīng)元胞核邊界不清，核仁腫脹或消失，核固縮濃染，空泡變性多，細(xì)胞間隙增大，呈無序排列。而siNOR1組中裸鼠各組織器官損傷情況均得到有效緩解(圖7)。

注：a，病理圖片(免疫組化，×400 )；b，與Control組比較，*P<0.05。

圖4敲除NOR1基因?qū)i-67、Caspase-3、Notch、NOR1表達(dá)的影響

圖6敲除NOR1基因?qū)otch信號(hào)通路的影響

圖7裸鼠各器官病理圖片(HE染色，×400)

3 討論

原發(fā)性肝癌是常見的消化道惡性腫瘤疾病，但由于原發(fā)性肝癌的病因及確切分子機(jī)制尚不完全清楚，且各種治療手段存在局限性，肝癌患者的病死率較高，嚴(yán)重威脅人類健康[11]。近年來，肝癌綜合治療策略仍在不斷發(fā)展和細(xì)化中[12]。其中，Notch信號(hào)通路已被證明在多種癌癥中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，有望成為癌癥治療的關(guān)鍵通路[13]。而NOR1基因也已被證實(shí)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有望成為肝癌治療的靶基因。

本研究發(fā)現(xiàn)敲除NOR1基因后人肝癌HepG2細(xì)胞移植瘤生長受到顯著促進(jìn)，同時(shí)Ki-67表達(dá)水平顯著下降，Caspase-3表達(dá)水平顯著升高。在惡性腫瘤中，細(xì)胞不受控制的增殖是腫瘤形成的關(guān)鍵原因。Ki-67是分布于細(xì)胞核內(nèi)與增殖相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，與細(xì)胞的有絲分裂密切相關(guān)，是反應(yīng)腫瘤細(xì)胞分裂增殖的標(biāo)志物[14]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下的程序性死亡，可有序去除受損細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可以發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長作用[15]。Caspase是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶家族，并參與細(xì)胞的生長、分化與凋亡調(diào)節(jié)[16]。其中Caspase-3是Caspase家族中的重要一員。有研究[17]顯示，NOR1基因過表達(dá)可改變PDK1表達(dá)和線粒體Bax-Bcl2平衡從而抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)，引起鼻咽癌細(xì)胞在缺氧環(huán)境凋亡,發(fā)揮出抑癌作用。相反，Xiang等[18]研究顯示，NOR1基因在肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出高表達(dá)NOR1水平，可能作為肝癌的抑制基因發(fā)揮作用。結(jié)合已有研究，NOR1基因可能在不同的腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用，而在肝癌細(xì)胞中NOR1基因可能發(fā)揮抑癌作用，抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除NOR1基因可顯著下調(diào)Survivin蛋白和Notch信號(hào)通路下游Notch1、NICD、Hes1和Hey1蛋白表達(dá)水平，并且敲除NOR1基因移植瘤裸鼠30 d內(nèi)存活率顯著高于NOR1基因高表達(dá)移植瘤裸鼠。存活蛋白Survivin是凋亡抑制蛋白家族成員，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，參與控制細(xì)胞分裂并抑制細(xì)胞凋亡，與肝癌的浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性發(fā)展密切相關(guān), 可作為肝癌基因治療的新靶點(diǎn)[19]。Notch信號(hào)可通過相鄰細(xì)胞之間的相互作用進(jìn)而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞增殖分化、器官發(fā)育的調(diào)控作用[20]。有研究[21]顯示，Survivin蛋白在人肝癌組織中高表達(dá)，而在正常肝組織中沒有存活蛋白的表達(dá)，且Survivin高表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于低表達(dá)患者。You等[22]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NOR1基因可上調(diào)Notch信號(hào)通路下游Notch1、NICD、Hes1和Hey1蛋白表達(dá)水平，顯著提升HepG2或Hep3 B淋巴細(xì)胞的增殖和遷移能力。結(jié)合已有研究，本研究結(jié)果提示，敲除NOR1基因可通過Notch信號(hào)通路抑制HepG2細(xì)胞移植瘤生長。

腫瘤細(xì)胞黏附性降低是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移侵入周遭正常組織的重要特征，也是腫瘤治療中的關(guān)鍵。在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞分泌特殊物質(zhì)，溶解及破壞周圍組織，引起侵襲部位炎癥反應(yīng)，造成組織損傷[23]。有研究[24]顯示，肝細(xì)胞核因子1β可通過激活Notch信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞分化，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果顯示，Control組和 Scramble組裸鼠的肝、腎、肺、腦均有不同程度的組織損傷，而敲除NOR1基因后組織損傷均好轉(zhuǎn)。提示，敲除NOR1基因可抑制HepG2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，敲除NOR1基因可有效下調(diào)Notch信號(hào)通路下游蛋白及Survivin蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制HepG2細(xì)胞裸鼠移植瘤生長，提高裸鼠模型生存率，抑制HepG2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。接下來筆者團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步探究NOR1基因及Notch信號(hào)通路對(duì)HepG2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換、侵襲以及向肝癌干細(xì)胞分化的影響。