(1．皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室, 安徽 蕪湖 241002；2．安徽師范大學(xué)基因疾病與健康生物醫(yī)學(xué)安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽省中藥日化產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心, 安徽 蕪湖 241000)

0 引 言

微衛(wèi)星標(biāo)記(Microsatellite)，又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequences Repeats，SSRs)。廣泛存在于原核生物以及真核生物的基因組中，通常位于基因組的非編碼區(qū)中。

玉竹是百合科黃精屬多年生草本植物，主要分布在長(zhǎng)江流域[1]，是一種重要的藥用植物，具有養(yǎng)陰清熱、生津止咳功效，因此被廣泛種植并應(yīng)用于中藥制作。近年來，有報(bào)道稱，來自玉竹根狀莖的同質(zhì)異黃酮可能能夠抑制高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的形成，因此，這種植物可以作為一種新型的自然產(chǎn)品來減輕糖尿病并發(fā)癥[2]。此外，玉竹根狀莖常被用作冠狀動(dòng)脈心臟病、糖尿病、肺結(jié)核和再生障礙性貧血等疾病的輔助療法。玉竹還具有很強(qiáng)的觀賞性，是不可多得的觀賞佳品。我國(guó)醫(yī)藥業(yè)對(duì)玉竹的需求量非常巨大，然而，大量的森林砍伐和環(huán)境變化導(dǎo)致玉竹野生種群數(shù)量急劇下降。

玉竹的形態(tài)已經(jīng)被廣泛的研究，包括花粉形態(tài)[3]，核型和細(xì)胞分類學(xué)[4]。雖然有兩種黃精屬的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的報(bào)道[5～6]，但還沒有針對(duì)玉竹微衛(wèi)星引物的報(bào)道。為了分析玉竹自然種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，本文描述了核微衛(wèi)星標(biāo)記物[7]的發(fā)展。為今后保護(hù)和合理利用玉竹資源具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

選取安徽省岳西縣鷂落坪自然保護(hù)區(qū)11個(gè)玉竹樣品，云南省昆明9個(gè)玉竹樣品，安徽省瑯琊山20個(gè)玉竹樣品為材料。新鮮葉片經(jīng)硅膠干燥后于-20 ℃保存。選取玉竹干燥后的葉片樣品，經(jīng)液氮研磨，提取新鮮葉片基因組DNA。

1.2 方 法

1.2.1 基因組的提取和酶切

采用改良CTAB法提取玉竹葉片中基因組DNA[8]，運(yùn)用磁珠富集法[9～11]，對(duì)多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行了分離和鑒定。本實(shí)驗(yàn)所提取的玉竹基因組DNA需要檢測(cè)其濃度以及純度，這一進(jìn)程需要使用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳，提取的DNA在-20℃下保留備用，再利用限制性內(nèi)切酶Sau3AI對(duì)500 ng基因組DNA進(jìn)行酶切。PCR反應(yīng)體系(20 μl)為：DNA 1 μl，10 x Buffer 2 μl，Sau 3AI酶1 μl，無菌水補(bǔ)充至20 μl，用瓊脂糖凝膠純化試劑盒對(duì)300～900 bp的產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.2 酶切產(chǎn)物與接頭連接和富集微衛(wèi)星片段

由兩個(gè)接頭OligoA(5’-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3’)和OligoB(5’-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’)將上一步中純化的片段連接起來。連接引物的DNA片段在95 ℃下變性10 min，雜交化的單鏈3’親和素標(biāo)記的(CT)15Oligo探針在65℃下退火30min,在磁珠懸浮液中加入“微衛(wèi)星探針-包括微衛(wèi)星DNA的單鏈DNA”復(fù)合體，充分搖勻，室溫?cái)R置30 min，在擱置期間需間斷輕輕搖勻，將懸浮狀態(tài)的磁珠沉淀下來。通過上述方法得到單鏈DNA片段，需經(jīng)過PCR擴(kuò)增將其恢復(fù)為DNA雙鏈，另外為了后續(xù)的TA克隆做充足準(zhǔn)備，需通過GoTaq⑧DNA聚合酶在其末端加A。PCR反應(yīng)體系如下：

25μlPCR富集反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序如下：94°C預(yù)變性4min；94°C變性45s，在最優(yōu)退火溫度中復(fù)性35s(表1)，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72°C終延伸8 min[12]。

1.2.3 微衛(wèi)星文庫(kù)構(gòu)建及陽(yáng)性克隆菌株的菌落PCR檢測(cè)

通過磁珠富集法獲得了PCR產(chǎn)物，對(duì)其進(jìn)行純化濃縮，并將Ligation Mix 5 μl、pMD19-T vectors(TaKaRa)1uL, PCR產(chǎn)物4 uL加入到微量離心管中，通過短暫離心使上述混合液匯集到管底，之后將其在16°C低溫水浴連接2h。通過轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選，挑白色菌落取陽(yáng)性克隆，挑至含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 225rpm 振蕩培養(yǎng)4 h。用接頭引物Oligo A和引物(CT)15進(jìn)行菌落PCR，PCR反應(yīng)體系如下：

15 μlPCR驗(yàn)證反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增程序：在94°C下預(yù)變性3min；94°C變性35s，60°C退火35s，72°C延伸1min；共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min[12]。檢測(cè)得到具有兩條或三條含微衛(wèi)星片段的陽(yáng)性克隆。

1.2.4 多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選與數(shù)據(jù)分析

對(duì)55個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行了測(cè)序，其中包含了大量二核苷酸和三核苷酸的重復(fù)序列，使用PREMIER 5.0軟件為包含重復(fù)序列(26 bp ≤ 重復(fù)序列≤ 65 bp)的基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)四十五對(duì)引物，對(duì)3個(gè)玉竹自然種群的40個(gè)個(gè)體的等位基因多態(tài)性進(jìn)行篩選能穩(wěn)定擴(kuò)增的引物(表2)。用摸索好最適擴(kuò)增條件的引物對(duì)3個(gè)玉竹自然種群的40個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，從中篩選出可穩(wěn)定擴(kuò)增的引物。利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),然后使用變性劑在95℃變性8 min，然后再進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測(cè)，對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析，利用遺傳數(shù)據(jù)分析[13]計(jì)算HE和Ho，并測(cè)試是否偏離位點(diǎn)間的連鎖不平衡以及哈溫平衡。利用CERVUS 3.0軟件[14]測(cè)定多態(tài)性信息和等位基因數(shù)量(表2)。表1列出了新開發(fā)的微衛(wèi)星位點(diǎn)的詳細(xì)信息。

2 結(jié)果和分析

表1列出了新開發(fā)的微衛(wèi)星位點(diǎn)的詳細(xì)信息。獲得了9個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中5個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Na數(shù)目從3到6個(gè)不等，其平均數(shù)為4.2。這些微衛(wèi)星位點(diǎn)的H0范圍為0000～0.875；HE范圍為0.520～0.760。哈迪-溫伯格平衡檢測(cè)表明，5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均符合哈迪-溫伯格平衡，位點(diǎn)Pc4,Pc5,Pc6 和Pc7顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.05)，這可能是擴(kuò)增過程中出現(xiàn)了無效等位基因。在12個(gè)位點(diǎn)中進(jìn)行兩兩比較(Po2-Po3,Po1-Po5,Po2-Po5,Po3-Po5,Po2-Po7,Po5-Po7,Po5-Po8,Po7-Po8,Po1-Po9,Po3-Po9,Po5-Po9,Po7-Po9)表現(xiàn)出顯著的位點(diǎn)間的連鎖不平衡。本實(shí)驗(yàn)的樣本容量較小是偏離連鎖不平衡和哈迪-溫伯格平衡的原因之一。偏離哈迪-溫伯格平衡的原因也可能是地理上的限制。在當(dāng)前研究中4個(gè)位點(diǎn)偏離的一個(gè)重要原因是人口數(shù)量。野生環(huán)境中遺傳多樣性的減少很可能是由于人類活動(dòng)的影響。長(zhǎng)期以來人類活動(dòng)的影響可能導(dǎo)致了本研究中所篩選的等位基因多樣性較低。但開發(fā)的這些多態(tài)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記可以用來評(píng)估玉竹和其他相關(guān)物種的遺傳變異。此外，這些標(biāo)記物可以作為未來標(biāo)記輔助育種的微衛(wèi)星的潛在來源。

表1 從玉竹中獲得的9對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的特征

* 表示明顯偏離Hardy-Weinberg平衡(P< 0.05).Ta為最佳退火溫度

表2 由玉竹微衛(wèi)星標(biāo)記獲得的種群參數(shù)

N：樣本量; Na: 等位基因數(shù); HO：觀察雜合度HE：預(yù)期雜合度; PIC：多態(tài)信息含量

3 討 論

本研究通過構(gòu)建微衛(wèi)星文庫(kù)，采用磁珠富集法開發(fā)玉竹微衛(wèi)星，成功得到了多態(tài)微衛(wèi)星并應(yīng)用于玉竹不同種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析中。傳統(tǒng)方法直接從基因組文庫(kù)中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)，費(fèi)時(shí)間，效率低。磁珠富集法是一種快速、高效的構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)的方法，近年來，磁珠富集法被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)研究中[9～11]。

在實(shí)驗(yàn)過程中，采用實(shí)驗(yàn)室往屆彭艷秋等人的方法[15]，陽(yáng)性克隆率可達(dá)30-40%。一些關(guān)鍵步驟在磁珠富集的過程中值得討論。首先，獲取高質(zhì)量的玉竹基因組DNA是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。高質(zhì)量的基因組DNA是后續(xù)步驟的有利保證，如文庫(kù)構(gòu)建和引物篩選。其次，接頭與酶切后基因組DNA片段連接效率的高低也影響了實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，連接效率可以通過連接后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳照片來判斷。最后，磁珠富集是過程中最為關(guān)鍵的一步。雜交后的洗脫條件對(duì)磁珠富集來說是重要的影響因素，其中洗脫條件包括洗脫溫度以及洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)度。如果洗脫溫度高，SSC濃度低，洗脫過程動(dòng)作過于劇烈，這樣會(huì)導(dǎo)致很多含有微衛(wèi)星的片段丟失；如果洗脫條件不夠嚴(yán)謹(jǐn)，就可能會(huì)產(chǎn)生非特異性片段，使文庫(kù)中產(chǎn)生假陽(yáng)性克隆，因此，根據(jù)磁珠的使用說明，并調(diào)整實(shí)驗(yàn)中的若干洗脫條件才能達(dá)到最佳的富集效果。

4 結(jié) 語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)中，觀察雜合度高于預(yù)期雜合度，說明該玉竹居群遺傳多樣性較好。一般通過哈溫平衡定律來衡量群體遺傳結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定。本研究利用9對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)安徽滁州瑯琊區(qū)玉竹居群進(jìn)行遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡常數(shù)(p<0.05)。這一結(jié)果造成的主要原因可能是：

(1) 位點(diǎn)間的連鎖反應(yīng)以及非等位基因之間遺傳共適應(yīng)的差異?；蜻B鎖是指位于同一染色體上的不同位點(diǎn)的非等位基因之間的非隨機(jī)組合效應(yīng)。如果位點(diǎn)之間出現(xiàn)連鎖反應(yīng)，會(huì)造成非等位基因之間的連鎖不平衡現(xiàn)象，最終形成的配子的概率會(huì)出現(xiàn)偏離哈溫平衡的現(xiàn)象[16]。在自然群體中，連鎖不平衡現(xiàn)象會(huì)出現(xiàn)在中性位點(diǎn)；而在隨機(jī)交配群體中，連鎖不平衡現(xiàn)象不強(qiáng)烈[17]，本實(shí)驗(yàn)中連鎖不平衡分析表明有12對(duì)位點(diǎn)出現(xiàn)了連鎖不平衡，分別是(Po2-Po3,Po1-Po5,Po2-Po5,Po3-Po5,Po2-Po7,Po5-Po7,Po5-Po8,Po7-Po8,Po1-Po9,Po3-Po9,Po5-Po9,Po7-Po9)(p<0.05)，在一定程度上可能也導(dǎo)致哈溫平衡偏離現(xiàn)象。

(2) 樣本數(shù)量地域較小。增大玉竹采集的地域和數(shù)量，比如擴(kuò)大到整個(gè)安徽的玉竹居群，甚至全國(guó)范圍內(nèi)的玉竹可能會(huì)增大位點(diǎn)等位基因的數(shù)量。

(3) 群體本身處于日益瀕危狀態(tài)與近親繁殖。玉竹作為中藥材需求量巨大，野生玉竹無法滿足市場(chǎng)的需求，而且近年來滁州經(jīng)濟(jì)的開發(fā)對(duì)玉竹的生境影響較大。同時(shí)，當(dāng)玉竹面臨環(huán)境脅迫時(shí)候，會(huì)采用無性繁殖的方式，這對(duì)物種的基因交流產(chǎn)生不利影響。

(4) 無效等位基因的出現(xiàn)。通過軟件Micro-Checker的分析發(fā)現(xiàn)，偏離哈溫平衡常數(shù)的4個(gè)位點(diǎn)中都有無效等位基因的出現(xiàn)。因此，我們認(rèn)為導(dǎo)致上述情況發(fā)生的主要原因可能是位點(diǎn)間連鎖不平衡以及無效等位基因的存在。采集不同地域之間的玉竹，擴(kuò)大樣本數(shù)量，將可能有助于進(jìn)一步分析遺傳結(jié)構(gòu)。

近年來，野生中藥植物資源的生境急劇惡化，種質(zhì)多樣性下降，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)中藥資源進(jìn)行研究、創(chuàng)新及再生，以科技為先導(dǎo)，通過諸如中藥分子標(biāo)識(shí)育種、組織細(xì)胞培養(yǎng)、藥用植物基因和基因工程等方法，實(shí)現(xiàn)中藥資源的長(zhǎng)期可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，對(duì)促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和中藥資源利用與保護(hù)具有重大而又深遠(yuǎn)的意義。