李 元，劉 瑞，楚元奎，楊 華

膜聯(lián)蛋白A1(ANXA1)屬于鈣和磷脂結(jié)合蛋白超家族成員，其主要的生物學(xué)作用是以鈣依賴的方式結(jié)合或黏附到脂質(zhì)膜上[1]，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附與遷移、分化及增殖、細(xì)胞死亡信號調(diào)節(jié)、凋亡細(xì)胞的吞噬清除等過程。近年來，越來越多的研究表明ANXA1的表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]，但對于ANXA1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制還有待闡明。因此，本研究通過構(gòu)建ANXA1 shRNA慢病毒質(zhì)粒，將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系，在下調(diào)ANXA1基因表達(dá)的情況下研究其對腫瘤細(xì)胞增殖的影響；同時(shí)探討U87細(xì)胞在ANXA1表達(dá)受到抑制后，甲酰肽受體1(FPR1)的表達(dá)情況以及其對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響，初步明確ANXA1/FPR1途徑在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為開發(fā)新的腫瘤治療靶點(diǎn)和治療途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：293T細(xì)胞及U87細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室保存)；感受態(tài)細(xì)胞Stbl3(上海諾百生物科技有限公司)；pDS019-pl/shRNA/GFP質(zhì)粒(上海諾百生物科技有限公司)；引物Oligo(Invitrogen合成)；T4 DNA ligase(1 U/μl)(EP0061，F(xiàn)ermentas)；質(zhì)粒提取試劑盒(AP-MN-P-250，Ayxgen)；包裝質(zhì)粒Packaging Mix(K4975-00)和轉(zhuǎn)染試劑LipofactamineTM2000 (Invitrogen)；熒光染料SYBR Green I(CS7561，Invitrogen)； Anti-ANXA1 antibody (ab137745，Abcam)；Anti-FPR1 antibody (ab113531，Abcam)；Anti-F-actin antibody (ab205，Abcam)；Anti-G-actin antibody (ab194952，Abcam)；Anti-Tubulin antibody(ab15246，Abcam)；fMLP(F3506，Sigma)；BOC2(A-2200，Bachem)。

1.2 方法

1.2.1 重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)GenBank中ANXA1的cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成3對干擾序列。將合成引物經(jīng)退火、形成雙鏈Oligo，與BsmbI酶切后形成的線性化pDS019-pl/shRNA/GFP質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化后，選取菌落PCR鑒定結(jié)果為陽性的克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，送上海生工生物有限公司測序。

1.2.2 慢病毒包裝及滴度測定： 使用Lipofectamine2000將經(jīng)測序鑒定的3種ANXA1 shRNA重組質(zhì)粒和輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h 后收集上清液，超速離心獲取慢病毒。熒光法測定病毒滴度：含病毒的濃縮上清液感染293T細(xì)胞，24 h后每孔換1 mL新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；感染后48 h，觀察并找出GFP熒光細(xì)胞比例在10%左右的稀釋梯度，記錄下該梯度稀釋液感染的各孔中熒光細(xì)胞的數(shù)目，取平均值。根據(jù)以下公式計(jì)算病毒滴度(BT=TU/mL):TU/ L=(P×n/100 V)×1 /DF(P=GFP +細(xì)胞數(shù)，n=105，V=病毒稀釋液體積=50 μl，DF=稀釋倍數(shù)。測定后重懸于DMEM培養(yǎng)液中，分裝、貯存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 慢病毒侵染效率驗(yàn)證及干擾RNA篩選：感染復(fù)數(shù)(MOI)值測定法驗(yàn)證慢病毒侵染效率。將對數(shù)生長期的U87細(xì)胞接種于96孔板，待其生長至60%～70%融合密度時(shí)，根據(jù)MOI值，加入對應(yīng)量的慢病毒上清液進(jìn)行侵染。分別于侵染24 h和48 h時(shí)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和熒光比率，拍照并確定最佳MOI值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法篩選病毒最佳干擾效率：根據(jù)目的基因序列，設(shè)計(jì)并合成qRT-PCR引物ANXA1 Primer(+)：CCACAACTTCGC AGAGTG；ANXA1 Primer(-)：CAGAACGGGAAACCATAA。根據(jù)MOI測定結(jié)果，收集細(xì)胞提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測，分析干擾效果，并確定最優(yōu)干擾慢病毒。

1.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的篩選及鑒定：取對數(shù)生長期的U87細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后感染病毒。以合適的MOI的病毒液侵染靶細(xì)胞，培養(yǎng)4～6 h 后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行BSD篩選，篩選10 d，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

qRT-PCR及蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測U87細(xì)胞中ANXA1表達(dá)：收集篩選成功的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，Trizol提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR檢測ANXA1基因的表達(dá)，方法同1.2.3。提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜4 h后，加入針對ANXA1(1∶1 000)與Tublin(1∶500)的抗體，4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜后加入相應(yīng)二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測各組細(xì)胞中ANXA1蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 MTT實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后不同實(shí)驗(yàn)組處于對數(shù)生長期的U87細(xì)胞胰酶消化后，稀釋成1.5×104個(gè)/mL，以每孔200 μl接種于96孔板中，分別于接種后24、48和72 h，使用MTT法對細(xì)胞生長情況進(jìn)行測定，根據(jù)各組吸光值繪制生長曲線圖。

1.2.6 Western Blot檢測FPR1及肌動(dòng)蛋白(G-actin與F-actin)表達(dá)情況：常規(guī)培養(yǎng)U87細(xì)胞、control shRNA U87細(xì)胞、FPR1-shRNA U87細(xì)胞及ANXA1-shRNA U87細(xì)胞，在ANXA1-shRNA U87細(xì)胞中分別加入FPR1抑制劑BOC2及其激活劑fMLP，作用24 h后收集不同處理組細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白定量后行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉后，分別加入適量的針對FPR1(1∶500)、F-actin(1∶250)、G-actin(1∶1 000)與Tublin(1∶500)的抗體，4℃孵育過夜。用TBST洗膜后加入相應(yīng)二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h。TBST洗膜后化學(xué)發(fā)光法檢測各組細(xì)胞中FPR1、F-actin及G-actin蛋白表達(dá)變化。用Image J軟件對Western Blot 圖像進(jìn)行灰度掃描。

2 結(jié)果

2.1 陽性克隆的PCR鑒定：經(jīng)測序驗(yàn)證，結(jié)果顯示(見圖1，目錄后)3個(gè)插入序列與shRNA序列完全一致，證實(shí)ANXA1表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 慢病毒包裝及滴度測定：熒光顯微鏡下293T細(xì)胞中有大量GFP熒光表達(dá)，顯示病毒包裝成功。經(jīng)計(jì)算，3個(gè)重組質(zhì)粒慢病毒滴度分別為RNAi1：1.3×109TU/mL；RNAi2：1.3×109TU/mL；RNAi3：9.0×108TU/mL。

2.3 慢病毒侵染效率驗(yàn)證及干擾篩選：在MOI=30～60時(shí)，細(xì)胞陽性比例(熒光率)較高、細(xì)胞狀態(tài)較好。將干擾慢病毒以MOI值30侵染靶細(xì)胞。侵染48 h 后收集細(xì)胞提取總RNA，以qRT-PCR驗(yàn)證干擾效率。慢病毒對ANXA1基因干擾效率分別是95.570%、71.743%、68.720%。

2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立與鑒定：用4 μg/mL BSD作為篩選濃度，建立ANXA1 shRNA 的腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，熒光顯微鏡下可見熒光強(qiáng)度達(dá)90%以上(見圖2，目錄后)。

提取細(xì)胞總RNA及總蛋白，行qRT-PCR及Western Blot檢測，結(jié)果顯示：干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中，ANXA1基因及蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組(見圖3，目錄后)，證明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.5 ANXA1蛋白下調(diào)對U87細(xì)胞增殖的影響：將ANXA1-shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)U87細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48和72 h后，MTT法檢測各組細(xì)胞的生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與control shRNA組及U87對照組相比，ANXA1-shRNA干擾組在培養(yǎng)72 h 后細(xì)胞增殖能力明顯下降，細(xì)胞生長明顯被抑制(P<0.05)；與control shRNA組相比，ANXA1-shRNA干擾組的細(xì)胞生長24、48和72 h 的抑制率分別為81.5%、83.2%和85.0%，而兩對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 ANXA1對FPR1表達(dá)的影響：為了檢測ANXA1對FPR1的影響，在ANXA1 shRNA細(xì)胞中分別加入FPR1抑制劑BOC2及其激活劑fMLP，結(jié)果顯示，與對照組相比，干擾ANXA1表達(dá)后，F(xiàn)PR1蛋白表達(dá)水平明顯降低，ANXA1與FPR1抑制劑協(xié)同作用時(shí)，F(xiàn)PR1蛋白表達(dá)水平顯著降低。干擾ANXA1表達(dá)后再加入FPR1外源激活劑fMLP時(shí)，F(xiàn)PR1蛋白表達(dá)增加，見圖3(目錄后)。

2.7 ANXA1通過FPR1對U87細(xì)胞中F-actin/G-actin比值的影響：為了進(jìn)一步研究FPR1在ANXA1促腫瘤細(xì)胞遷移侵襲中的作用，在ANXA1-shRNA細(xì)胞中分別加入FPR1抑制劑BOC2及其激活劑fMLP后，提取不同處理組的細(xì)胞總蛋白，用特異性肌動(dòng)蛋白抗體(G-actin與F-actin)檢測肌動(dòng)蛋白的相對含量，分析F-actin與G-actin的比值。結(jié)果顯示：與對照組相比，分別干擾FPR1、ANXA1及同時(shí)干擾ANXA1與FPR1，F(xiàn)-actin/G-actin的比值分別下調(diào)。加入FPR1外源激活劑fMLP后，F(xiàn)-actin/G-actin的比值增加，見圖4(目錄后)。

3 討論

膜聯(lián)蛋白A1(ANXA1)是一個(gè)37 kDa 的鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白，在細(xì)胞中含量較高(占細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的0.5%～2%)，主要參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及信號傳導(dǎo)、調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架蛋白間的相互作用等膜表面一系列依賴于鈣調(diào)蛋白的活動(dòng)[4]。ANXA1可以與細(xì)胞骨架上的F-actin和G-actin結(jié)合并相互作用，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的聚合作用，并與G-actin的結(jié)合蛋白相互作用，參與膜相關(guān)細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，通過這種翻譯后的修飾過程參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)活動(dòng)的調(diào)節(jié)。

越來越多的研究表明，膜聯(lián)蛋白A1的表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，ANXA1表達(dá)水平在不同類型的腫瘤中有差異，在同一腫瘤的不同類型中也有顯著變化，可能與腫瘤的侵襲遷移相關(guān)[5]。在乳腺腫瘤中，通過檢測大鼠腺癌細(xì)胞中ANXA1表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性發(fā)現(xiàn)，ANXA1表達(dá)程度可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)[6]。Kim等在黑色素細(xì)胞瘤的高轉(zhuǎn)移潛能B16/BL6和低轉(zhuǎn)移潛能B16/F10細(xì)胞系中，通過siRNA證實(shí)了ANXA1參與該腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，推測ANXA1通過激活甲酰肽受體(FPR)家族來調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力[7]。FPR1作為G蛋白耦聯(lián)受體家族成員之一，能夠被細(xì)菌源性多肽如N-甲酞-甲硫酰-亮氨酰-苯丙氨酰胺(fMLP)和一些宿主源性的多肽如來源于腫瘤細(xì)胞的ANXA1等激活，進(jìn)而介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。在結(jié)腸腺癌細(xì)胞中，應(yīng)用siRNA干擾ANXA1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ANXA1可以調(diào)節(jié)結(jié)腸腺癌的遷移侵襲，而該功能是通過功能性N-甲酰肽受體(nFPRs)活化介導(dǎo)的[8]，nFPRs可以誘導(dǎo)極化F-actin聚集[9-10]，后者可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[11]。F-actin參與腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移及運(yùn)動(dòng)，使腫瘤細(xì)胞與周圍基質(zhì)的黏附力下降并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移、運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍侵襲性生長[12]，因此F-actin是衡量腫瘤細(xì)胞惡性程度的一個(gè)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)前期采用免疫組織化學(xué)法，分析了20例胃炎與80例胃癌標(biāo)本中ANXA1的表達(dá)情況，顯示ANXA1在胃癌組織中高表達(dá)。通過研究ANXA1表達(dá)與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ANXA1在胃癌組織中的高表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，而與患者年齡、性別、胃壁侵犯、分期、分化等無顯著相關(guān)性，提示ANXA1可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展及早期血行、局域引流淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[13]。

為了進(jìn)一步研究ANXA1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，及其可能通過nFPRs誘導(dǎo)F-actin重構(gòu)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移，本實(shí)驗(yàn)以ANXA1基因?yàn)榘谢?，使用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)了3對特異性shRNA序列，構(gòu)建了3個(gè)干擾慢病毒載體，qRT-PCR檢測結(jié)果表明重組質(zhì)粒均可顯著抑制ANXA1的表達(dá)，尤以RNAi1重組質(zhì)粒的干擾效率最佳。將其導(dǎo)入U(xiǎn)87細(xì)胞后，經(jīng)qRT-PCR及Western Blot驗(yàn)證，顯著抑制ANXA1的表達(dá)。隨后進(jìn)行的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ANXA1下調(diào)對U87細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，說明ANXA1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定的作用。同時(shí)，我們也檢測了ANXA1對FPR1表達(dá)的影響。在ANXA1-shRNA細(xì)胞中分別加入FPR1抑制劑BOC2及其激活劑fMLP，結(jié)果顯示ANXA1可以影響FPR1的表達(dá)，ANXA1可能通過激活FPR來介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲，但其對腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲影響的機(jī)制尚不十分清楚。肌動(dòng)蛋白是構(gòu)成細(xì)胞骨架微絲的基本成分，以球狀單體肌動(dòng)蛋白(G-actin)或絲狀聚合體肌動(dòng)蛋白(F-actin)形式存在，G-actin經(jīng)聚合成為F-actin。F-actin含量增加提示細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白發(fā)生聚合，反之則提示細(xì)胞內(nèi)F-actin發(fā)生解聚。一些研究表明nFPRs可以誘導(dǎo)F-actin聚集進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[9-10]。因此，我們檢測了細(xì)胞中F-actin、G-actin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)或同時(shí)干擾ANXA1及FPR1均可下調(diào)F-actin/G-actin比值；而在ANXA1干擾細(xì)胞中加入FPR1外源激活劑fMLP后，F(xiàn)-actin/G-actin的比值增加，抑制FPR1表達(dá)可下調(diào)ANXA1對F-actin、G-actin表達(dá)的影響，表明ANXA1可能通過FPR1影響肌動(dòng)蛋白的重構(gòu)，進(jìn)一步改變腫瘤細(xì)胞遷移侵襲特性。