二氫楊梅素的檢測、藥效及藥代學(xué)研究進展

羅 俊，劉 丹，丁利君

（廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

隨著現(xiàn)代人對生活水平的需求不斷提高，人們開始對自身健康以及食品營養(yǎng)安全等問題越來越重視。二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DMY)是葡萄科蛇葡萄屬的一種木質(zhì)藤本植物中的黃酮類化合物，又名雙氫楊梅素、蛇葡萄素、白蘞素等，是一種雙氫黃酮醇化合物。該類植物廣泛分布于我國如廣東、廣西、云南、湖南、湖北、江西等多個省。DMY在植物中其分布狀態(tài)以老葉較高，嫩枝葉次之，莖枝與根中微量[1]。DMY作為一類比較特殊的天然黃酮類產(chǎn)物，在植物中單體含量高，常被廣泛用作新型毒副作用低的產(chǎn)品。目前，已有大量研究者對DMY進行研究，本文擬對從DMY的含量測定、結(jié)構(gòu)鑒定、藥效和藥代等方面進行綜述，以期為DMY的深入研究及進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 DMY的含量測定和結(jié)構(gòu)鑒定

DMY是一種多酚羥基雙氫黃酮醇，是黃酮類化合物的一種，具有多種生物活性。天然黃酮類化合物的表征和定量分析對許多研究者來說都是一個挑戰(zhàn)。目前對黃酮化合物(DMY)含量和結(jié)構(gòu)的檢測主要分為光譜法和色譜法。

1.1 光譜法

黃酮類化合物的紫外光譜圖主要有環(huán)肉桂酰系統(tǒng)引起的吸收帶I(300～550 nm)和環(huán)苯酰系統(tǒng)引起的吸收帶Ⅱ(240～280 nm)[2]。紫外分光光度法(Ultraviolet and Visible spectrophotometry，UV)主要包括ZrOCl2·8H2O顯色法、AlCl3顯色法和直接檢測法[3]。目前紫外分光光度法對總黃酮的檢測原理主要是亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法，通過有色絡(luò)合物的特征吸收峰實現(xiàn)檢測目的。覃潔萍等[4]通過測定藤茶樣品溶液與ZrOCl2絡(luò)合前后的吸光度差值確定DMY的含量。安豐田等[5]通過紫外可見分光光度法測酶解法提取的藤茶中DMY含量。成桂鳳等[6]比較了DMY的直接UV法和AlCl3顯色法，以經(jīng)純化的DMY為標準品，在波長為291 nm處測定藤茶中總黃酮的含量。林淑英等[7]采用紫外-可見光譜掃描法研究pH值、溫度以及金屬離子對于DMY化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。另外，通過加入診斷試劑，測定紫外-可見光譜圖，可解析出黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)[8]。

黃酮類化合物的鑒定是依賴多種光譜學(xué)方法進行解析。傅立葉變換紅外光譜法(Fourier Transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)可以用于從自然資源中分離的復(fù)雜黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定[9]。Wang等[10]提出FT-IR可以快速地區(qū)分外消旋體(±)DMY與同質(zhì)(+)DMY，借助與茶堿共結(jié)晶的作用，確定了同質(zhì)(+)DMY的絕對構(gòu)型為(2R，3R)。核磁共振波譜(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)和質(zhì)譜(Mass Spectrometry，MS)也可用于研究黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。核磁共振氫譜和碳譜可以為黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供豐富的化學(xué)信息，MS分析基于電離化學(xué)物質(zhì)和離子的質(zhì)量荷電比，可以用來研究多酚類黃酮化合物的結(jié)構(gòu)[11]。Outtrup[12]使用1H-NMR、13C-NMR和MS對DMY的純度和空間結(jié)構(gòu)完整性進行了研究。占春熙等[13]也用MS、NMR等方法對藤茶中的提取物進行結(jié)構(gòu)分析，分析證明提取物是二氫楊梅素。

1.2 色譜法

利用薄層色譜(Thin Layer Chromatography，TLC)、高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、高速逆流色譜(High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)和高效逆流色譜(High Performance Countercurrent Chromatography，HPCCC)等色譜技術(shù)，可以對DMY等植物提取物中黃酮類化合物進行含量測定和結(jié)構(gòu)鑒定。TLC具有快速、操作簡便、穩(wěn)定、準確等特點，可以對黃酮類化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定、含量測定。謝雪佳等[14]利用薄層色譜法研究冷卻結(jié)晶工藝中關(guān)鍵參數(shù)對DMY純度的影響。何桂霞等[15]采用薄層掃描法測定藤茶中DMY的含量，結(jié)果顯示藤茶中DMY的含量為38.17%～38.54%。

HPLC法有簡便、快速、檢測準確度高等特點，是一種較理想的黃酮類化合物的鑒別和定量方法。陳圖鋒等[16]采用高效液相色譜法在波長290 nm處測定藤茶中DMY含量，結(jié)果顯示DMY的質(zhì)量濃度含量在0.15～94.00 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。鄒海民等[17]采用C18柱反相高效液相色譜檢測法對醒酒護肝產(chǎn)品中DMY進行含量檢測，可用于醒酒護肝產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

黃酮類化合物色譜分析還包括HSCCC法和HPCCC法。HSCCC法是一種全液相色譜技術(shù)，非常適合分離純化合物。Du Qizhen等[18]采用制備的三柱逆流色譜對葡萄葉提取物中的(+)-DMY進行了純化，在254 nm處的(+)-DMY進行含量測定，純度可達99%以上。張友勝等[19]采用高速逆流色譜聯(lián)用系統(tǒng)對藤茶提取物中的DMY進行純化，純度能達到99%以上。高效逆流色譜法(HPCCC)是建立在無支撐液-液離心分離層析的基礎(chǔ)上，可用于植物提取物中黃酮類化合物的快速分離和回收。Vieira等[20]采用HPCCC方法成功地從鳳仙花粗提物中分離出包括DMY在內(nèi)的主要黃酮類化合物。

近年來，色譜技術(shù)與光譜技術(shù)聯(lián)用在天然產(chǎn)物中復(fù)雜類黃酮化合物的結(jié)構(gòu)鑒定中發(fā)揮著越來越重要的作用。Gao等[21]采用傳統(tǒng)溶劑萃取和再結(jié)晶法從羅漢果葉中提取的兩種黃酮類化合物通過紫外光譜法、紅外光譜法、電噴霧質(zhì)譜法(Electrospray Ionization Mass Spectrometry，ESI-MS)、核磁共振光譜法和高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC/ESI-MS)，確認兩種產(chǎn)品中主要黃酮類化合物為(+)DMY。Li等[22]利用超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)成功地分析了軟棗獼猴桃品種代謝產(chǎn)物有DMY。Zhang等[23]采用超高效液相色譜-四極質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-quadrupole Mass Spectrometry，UHPLC-MS)成功地同時測定了山梨花中DMY質(zhì)量分數(shù)含量為6.76～7.89 mg/g。

2 DMY的藥效作用

2.1 抗氧化作用

DMY為活性黃酮類物質(zhì)，具有良好的抗氧化活性。郭清泉等[24]采用量子化學(xué)計算法研究了DMY的抗氧化機制，認為DMY的抗氧化活性中心在其分子結(jié)構(gòu)的B環(huán)3'、4'、5'位連酚羥基上，抗氧化活性主要與其供氫后生成自由基的穩(wěn)定性有關(guān)。鄭秋闿等[25]利用核磁共振氫譜研究DMY的抗氧化機制，也得出了DMY的抗氧化活性中心在其分子中B環(huán)的3個相鄰的羥基上。

通過DMY對羥自由基·OH、超氧陰離子自由基O2-·和脂過氧自由基ROO·清除效果進行對比分析和研究發(fā)現(xiàn)，在一定質(zhì)量濃度的范圍內(nèi)，DMY濃度越高，那么整體清除能力也會隨之提升[26]。En-Hua W等[27]以過氧化值(Peroxide Value，POV)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)為氧化指標研究發(fā)現(xiàn)DMY能夠明顯抑制貴州傳統(tǒng)香腸的氧化，其抗氧化效果隨著DMY添加量的增加繼而增強。Li Y Y等[28]以大豆油和熟牛肉為模型體系，發(fā)現(xiàn)大豆油提取物及其主要成分DMY有抗氧化活性，采用硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)法可以測定熟牛肉的氧化程度。

DMY的抗氧化作用不僅應(yīng)用在食品中，還可以通過抑制自由基對體內(nèi)組織器官的損壞而發(fā)揮抗氧化作用。王丹等[29]灌胃大鼠不同劑量的DMY，測定其對大鼠細胞內(nèi)MDA含量的影響，結(jié)果顯示DMY在體內(nèi)起到了清除自由基、抗氧化的作用，并且抗氧化活性優(yōu)良。DMY還可以通過加速自由基的清除，增強小鼠的抗氧化能力[30]。

2.2 抗菌抗病毒作用

DMY抗菌主要是通過破壞細菌的細胞壁及細胞膜的完整性，從而讓蛋白質(zhì)、多糖等細胞內(nèi)容物釋放，引起膜功能障礙，影響細胞的新陳代謝，導(dǎo)致菌體死亡從而起到抗菌作用[31]。

Wu Y等[32]研究發(fā)現(xiàn)DMY對金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌活性，最低抑菌質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL，DMY不僅破壞了金黃色葡萄球菌的膜完整性，通過與膜脂、膜蛋白相互作用，導(dǎo)致膜流動性顯著降低，從而膜蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。此外，DMY還通過溝槽結(jié)合模式與金黃色葡萄球菌中DNA相互結(jié)合。DMY通過細胞膜損傷和與DNA結(jié)合的雙重作用達到殺菌作用。譚瀟嘯[33]在掃描電鏡下觀察DMY作用金黃色葡萄球菌后，與正常形態(tài)的菌體相比，其形態(tài)會隨著作用時間的增加繼而發(fā)生嚴重皺縮、干癟、扭曲變形等現(xiàn)象，說明了DMY對金黃色葡萄球菌有抗菌作用。

Liu D等[34]通過對細胞形態(tài)、細胞損傷、細胞通透性、細胞表面疏水性和抗菌率的分析，發(fā)現(xiàn)DMY對副溶血性弧菌具有抗菌活性，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.625 mg/mL。在較高濃度條件下，細菌細胞完全滅活。此外，Ding L等[35]等利用分子對接研究了DMY與脯氨酸脫氫酶(Proline Dehydrogenases，PDH)活性疏水囊內(nèi)的初級氨基酸殘基相互作用，導(dǎo)致PDH活性下降。DMY通過干擾了脯氨酸的正常代謝，導(dǎo)致副溶血性弧菌細胞的分子損傷甚至死亡。

DMY不僅對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均表現(xiàn)出較強的抗菌活性，還對病毒具有一定的抑制作用。Liu D Y等[36]通過體外抗病毒實驗發(fā)現(xiàn)DMY在HIV-1(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的吸收、培養(yǎng)和急性感染過程中具有較強的抑制作用，對HIV-1感染敏感細胞有保護作用，能顯著降低HIV-1抗原的表達，在1 mg/mL的質(zhì)量濃度下，DMY對HIV-1共受體CXCR 4的降解率約為70%。劉淼淼[37]研究發(fā)現(xiàn)DMY在體外能明顯地抑制甲型流感病毒的早期復(fù)制，主要是通過作用于流感病毒的PB2cap影響病毒vRNP的活性。DMY也能通過TLR3信號通路調(diào)控流感病毒感染導(dǎo)致的過度炎癥免疫反應(yīng)。

2.3 抗腫瘤及其他藥效作用

DMY具有良好的抗腫瘤作用，目前研究發(fā)現(xiàn)該化合物通過抑制卵巢癌細胞[38]、骨肉瘤細胞[39]、肝癌細胞[40]、黑色素瘤細胞[41]等癌細胞的生長增值、調(diào)節(jié)增強細胞免疫功能作用達到促進腫瘤細胞的凋亡和抑制腫瘤細胞侵襲遷移的效果。DMY可通過介導(dǎo)活性氧自由基的生成選擇性地來調(diào)節(jié)細胞死亡。具體抗腫瘤效果和機制在此不做詳細闡述，可參閱文獻[42-43]。

此外，DMY還具有改善動脈粥樣硬化、降血糖、改善肝脂肪變性、解酒護肝等作用。Liu T T等[44]等利用低密度脂蛋白受體缺陷小鼠研究發(fā)現(xiàn)DMY能改善高脂飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化。逯鳳肖[45]發(fā)現(xiàn)高劑量DMY能使糖尿病小鼠血糖極顯著降低，胰島素升高，增強糖尿病小鼠的糖耐量，改善糖尿病小鼠的高血糖癥狀。Xie C等[46]以正常肝細胞L02和肝癌細胞HepG2為模型，DMY能通過抑制脂質(zhì)積累和氧化應(yīng)激來改善oa誘導(dǎo)的肝脂肪變性。相關(guān)實驗證明DMY可以保護肝臟，加速乙醇代謝產(chǎn)物乙醛迅速分解，變成無毒物質(zhì)，降低對肝細胞的損害。潘人琦等[47]將小鼠給酒前和給酒后分別灌胃DMY，觀察到醉酒小鼠給予DMY后，藥效發(fā)揮迅速，能顯著縮短醒酒時間，并且作用持久，是保肝護肝，解酒醒酒的良品。最近，在美國已經(jīng)有出售含有DMY成分的解酒產(chǎn)品。

3 DMY的藥代動力學(xué)

DMY雖然具有很多藥效作用，但藥效的發(fā)揮需要了解藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等過程動態(tài)變化規(guī)律，一般經(jīng)過口服給藥后經(jīng)過消化道、腸道菌群作用后，部分被吸收進入血液，通過血液運輸?shù)狡鞴?，發(fā)揮功效。中藥血清藥理學(xué)，可模擬藥物的體內(nèi)代謝過程實現(xiàn)體外實驗的有效性[48]。了解DMY的藥代動力學(xué)機制能為藥效的發(fā)揮提供依據(jù)，是評價其生物利用度有效性和藥物攝入水平的關(guān)鍵。然而，關(guān)于DMY在動物模型和人體中吸收、分布、代謝以及排泄等的相關(guān)研究目前還較少。

人體吸收黃酮類化合物主要是發(fā)生在胃以及腸道里。Liu等[48]的藥代動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)DMY在腸道環(huán)境中不穩(wěn)定，這表明DMY可能在腸道中被吸收。Xiang等[49]使用人腸道Caco-2細胞模型對DMY體外腸道穩(wěn)定性進行了研究，當pH值由8.0降至6.0時，對DMY吸收明顯增強，表明胃腸道pH是影響DMY穩(wěn)定性、吸收和生物利用度的一個重要因素。在人體腸道中存在的外排轉(zhuǎn)運蛋白被認為是影響藥物吸收的另一個因素。黃酮類化合物因其特有的結(jié)構(gòu)經(jīng)胃腸道代謝后很容易成為外排轉(zhuǎn)運蛋白的底物，從而影響其吸收,但也可以利用這一特點，增加藥物的吸收，提高生物利用度。Xiang等[49]發(fā)現(xiàn)了多藥耐藥蛋白2 (Multi-drug Resistance associated Protein 2，MRP2)和乳腺癌耐藥蛋白(Breast Cancer Resistance Protein，BCRP)參與了DMY的攝取和轉(zhuǎn)運，阻礙了DMY在腸道中的吸收。

藥物的分布在一定程度上說明藥物對機體的靶向性，研究藥物的體內(nèi)分布情況可為闡明藥物的作用機制及其有效性做出合理解釋[50]。王志琪[51]研究發(fā)現(xiàn)大鼠口服一定量的DMY后0.33 h即可在肝和腎中檢測到DMY，在設(shè)定的時間內(nèi)組織藥物濃度隨時間沒有明顯的變，腎組織藥物濃度高于肝組織藥物濃度，腦組織在設(shè)定的時間點未檢測到DMY。樊靜靜等[52]給藥大鼠有效劑量DMY后，各組織的藥物濃度變化趨勢與血漿代謝較吻合，20 min時各組織的濃度具有心＞肝＞肺＞胃＞腎＞脾的特點，濃度較高的心肝肺胃腎可能是DMY發(fā)揮藥效的靶向器官；140 min時各組織中藥物濃度消除接近最高濃度的90%，表明DMY在體內(nèi)消除快，不易蓄積，能較快發(fā)揮藥效。

最近，F(xiàn)an等[53]研究了對大鼠口服DMY后組織分布、代謝和排泄情況，提出了5種代謝途徑，包括還原、去羥基化、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸鹽化。實驗結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)化的DMY可迅速分布于各種組織，尤其是胃腸道，并能跨越血腦屏障，到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)。DMY的排泄也很迅速，幾乎可以在12 h內(nèi)完成。大部分未轉(zhuǎn)化的DMY是在糞便中發(fā)現(xiàn)的，而不是在尿液中。在尿液和糞便中檢測DMY代謝物，但是血漿中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)任何代謝物，這可能是由于經(jīng)過了不同的排泄途徑。黃酮類化合物的代謝產(chǎn)物通常有兩種排泄途徑[54]：通過膽汁或尿。大的代謝物更容易在膽汁中被轉(zhuǎn)化，而小的代謝物更容易在尿液中排泄。在通過膽汁排出時，黃酮類化合物還可以被腸道細菌進一步代謝并被大腸吸收，繼而進行下一輪肝臟代謝。

4 研究與展望

DMY是一種藥用價值極高的植物黃酮類化合物，作為一種新型毒副作用低的產(chǎn)品，其應(yīng)用范圍極其廣泛，主要是體現(xiàn)在抗氧化、抗菌、抗腫瘤、解酒護肝、降血糖等藥效方面，但是有關(guān)藥代動力學(xué)研究還不夠系統(tǒng)和深入。目前，關(guān)于DMY含量測定、結(jié)構(gòu)鑒定和藥效作用已有比較廣泛的研究，通過藥效作用的分析，可以預(yù)測其作用靶點，為DMY在臨床的應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。但是由于DMY自身溶解性差、生物利用度低以及藥代動力學(xué)等問題，使其應(yīng)用將受到影響。因此，DMY的生物利用度的改善和將藥代動力學(xué)研究運用到不同動物試驗中推測其在生物體內(nèi)的藥代動力學(xué)，是今后研究的熱點方向。要以現(xiàn)有資料為基礎(chǔ)，更加全面系統(tǒng)地開發(fā)DMY的應(yīng)用價值，更好地為醫(yī)藥領(lǐng)域做出貢獻。