不同基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)對鏈球菌鑒定性能的比較*

胡 靚，張 旻，劉冬梅，吳文娟△

(1.同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院南院檢驗科，上海 200123；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬南川人民醫(yī)院檢驗科，重慶 408400)

鏈球菌屬是臨床常見的重要致病菌，根據(jù)在哥倫比亞血瓊脂平板上生長時的溶血情況，可分為α溶血鏈球菌、β溶血鏈球菌和γ溶血鏈球菌。肺炎鏈球菌屬于草綠色鏈球菌群中的α溶血鏈球菌，由于與緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌等同屬于緩癥鏈球菌群，這些菌在進化關(guān)系上緊密，許多表型和分子特征相似，導(dǎo)致臨床難以鑒定。目前，國內(nèi)絕大多數(shù)臨床微生物實驗室鏈球菌屬菌種的鑒定仍然基于微生物生物化學(xué)反應(yīng)原理及VITEK 2 Compact的進行鑒定，常出現(xiàn)誤判[1]。

20世紀(jì)80年代末，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOP MS)技術(shù)的出現(xiàn)，給臨床微生物檢驗領(lǐng)域的發(fā)展打開了新的局面，通常只需要幾分鐘，可實現(xiàn)微生物的快速鑒定[2-5]，大大縮短了檢測時間。質(zhì)譜鑒定方法與傳統(tǒng)生化鑒定方法相比具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，大大提高了臨床實驗室工作對感染性疾病的診斷效率，為疾病診斷和及時治療提供了更準(zhǔn)確的實驗室依據(jù)。為了評估MALDI-TOF MS對鏈球菌屬臨床菌株的鑒定能力，本研究對VITEK MS系統(tǒng)、Bruker Biotyper系統(tǒng)及Autof MS1000型質(zhì)譜儀臨床分離鏈球菌屬細菌的鑒定能力進行比對分析。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 菌株來源：研究菌株為2015年1月至2019年8月同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院臨床分離的134株鏈球菌，覆蓋13個種。另外，本研究納入了Autof MS1000型質(zhì)譜儀校準(zhǔn)菌株ATCC 25922大腸埃希菌；VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)校準(zhǔn)菌株ATCC 8379大腸埃希菌；Bruker Biotyper系統(tǒng)校準(zhǔn)菌株ATCC 25922大腸埃希菌，并使用臨床常用菌株ATCC 49619肺炎鏈球菌作為質(zhì)控菌株，質(zhì)控菌株均購自上海市臨檢中心。

1.2試劑與儀器 哥倫比亞血平板購自中國上?？片敿喂?；基因組提取試劑盒購自中國天根生化科技有限公司；PCR儀器購自美國Bio-Rad公司；MALDI-TOF MS使用基質(zhì)分別購自法國生物梅里埃公司、德國布魯克道爾頓公司及河南鄭州安圖公司，按照各自試劑配制要求進行配制；Autof MS1000型質(zhì)譜儀購自中國安圖生物公司；VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)購自法國梅里埃公司；Bruker Biotyper系統(tǒng)購自德國布魯克公司。

1.3方法

1.3.1復(fù)蘇培養(yǎng) 所有入組菌株轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板35 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，進行復(fù)蘇后，挑取單菌落再次轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血平板進行純培養(yǎng)35 ℃，5%CO2孵育24 h。

1.3.2研究設(shè)計 采用直接涂抹法平行使用3套質(zhì)譜系統(tǒng)對研究菌株進行菌種鑒定。即取少量純培養(yǎng)菌直接涂抹于靶板，滴加1 μL甲酸待干后，再滴加1 μL基質(zhì)液，干燥后上機采集圖譜并鑒定分析。使用16S rRNA基因片段測序比對的方法鑒定各菌種。取生長良好鏈球菌菌株按照基因組提取試劑盒操作步驟提取基因組。PCR擴增各菌種的16S rRNA基因，50 μL反應(yīng)體系為：脫氧核苷酸 5 μL，引物Primer F 1 μL，引物Primer 1 μL DNA模板提取液 5 μL，2×PCR MIX 25 μL。16S rRNA-F：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG，16S rRNA-R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T，擴增片段1 500 bp。擴增參數(shù)：94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min循環(huán)30次，最后72 ℃延伸5 min，凝膠電泳后，在1 500 bp出現(xiàn)條帶的送至中國上海賽音生物有限公司進行測序，測序結(jié)果上傳數(shù)據(jù)庫(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對，確定菌種類型[6-7]。以PCR擴增產(chǎn)物對16S rRNA基因測序作為鑒定結(jié)果“金標(biāo)準(zhǔn)”，評價3套質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3.3結(jié)果判定 根據(jù)產(chǎn)品使用說明，Autof MS 1000型質(zhì)譜儀分值9.5～10.0為種水平置信，可能的亞種；分值9.0～<9.5為種水平置信；分值6.0～<9.0為屬水平置信；<6.0為不可置信。VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)使用百分比(可信值)作為標(biāo)本圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，一致性60.0%～99.9%表示可信的鑒定結(jié)果；若一致性<60.0%，即無法給出可靠的鑒定結(jié)果；Bruker Biotyper系統(tǒng)分值2.3～3.0為高置信的種水平鑒定； 2.0～<2.3為確定的屬水平鑒定，可能的種水平鑒定；分值1.7～<2.0為可能的屬水平鑒定；分值0.0～<1.7為不可靠的鑒定。

2 結(jié) 果

2.116S rRNA及質(zhì)譜鑒定結(jié)果 通過PCR擴增16S rRNA基因，測序比對臨床分離的鏈球菌株。3套質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、解沒食子酸鏈球菌、戈登鏈球菌及變異鏈球菌的準(zhǔn)確鑒定率均為100%。見表1。

2.2VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果 檢出率為94.03%(126/134)，準(zhǔn)確率為89.55%(120/134)，其中14株星座鏈球菌未能鑒定到亞種，7株緩癥鏈球菌鑒定為緩癥鏈球菌/口腔鏈球菌，1株肺炎鏈球菌鑒定為解沒食子酸鏈球菌，1株咽峽炎鏈球菌鑒定為血鏈球菌，1株馬腸鏈球菌鑒定為嬰兒鏈球菌，2株咽峽炎鏈球菌分別鑒定為星座鏈球菌和肺炎鏈球菌，1株唾液鏈球菌鑒定為前庭鏈球菌。見表1。

表1 16S rRNA基因測序和3種質(zhì)譜方法對鏈球菌鑒定結(jié)果

2.3Autof MS1000型質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果 檢出率為100.00%(134/134)，準(zhǔn)確率為94.78%(127/134)，其中21株停乳鏈球菌及14株星座鏈球菌未能鑒定到亞種，5株緩癥鏈球菌鑒定為口腔鏈球菌，1株肺炎鏈球菌鑒定為解沒食子酸鏈球菌，1株咽峽炎鏈球菌鑒定為血鏈球菌。見表1。

2.4Bruker Biotyper系統(tǒng)鑒定結(jié)果 檢出率為100.00%(134/134)，準(zhǔn)確率為94.78%(127/134)，其中21株停乳鏈球菌和14株星座鏈球菌未能鑒定到亞種，5株緩癥鏈球菌鑒定為口腔鏈球菌，1株肺炎鏈球菌鑒定為解沒食子酸鏈球菌，1株咽峽炎鏈球菌鑒定為血鏈球菌。見表1。

2.5檢測系統(tǒng)間比較 由于Autof MS1000型質(zhì)譜儀和Bruker Biotyper系統(tǒng)的檢出率和準(zhǔn)確率相近，故對2套系統(tǒng)的鑒定得分進一步研究，結(jié)果顯示Autof MS1000型質(zhì)譜儀可鑒定至種水平置信及可能的亞種占94.03%，鑒定至種水平置信占0.75%，誤鑒定占5.22%；Bruker Biotyper系統(tǒng)可鑒定至高置信的種水平占38.06%，鑒定至確定的屬水平鑒定及可能的種水平鑒定占55.22%，鑒定至可能的屬水平鑒定占1.50%，誤鑒定占5.22%。Autof MS1000型質(zhì)譜儀準(zhǔn)確鑒定鏈球菌種水平能力明顯高于Bruker Biotyper系統(tǒng)，而這2種檢測系統(tǒng)均不能鑒定停乳鏈球菌亞種，VITEK MS質(zhì)譜可鑒別停乳鏈球菌停乳亞種和似馬亞種。見表2。

表2 Autof MS1000及Bruker Biotyper檢測分值比較

注：-表示此項無數(shù)據(jù)。

3 討 論

MALDI-TOF MS 技術(shù)能夠檢測蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，自該技術(shù)出現(xiàn)至今，其在醫(yī)學(xué)、生物領(lǐng)域的應(yīng)用愈加廣泛[8-9]。在醫(yī)學(xué)上，MALDI-TOF MS因其操作簡便、快速等優(yōu)點，可協(xié)助臨床醫(yī)生進行快速診斷與治療，優(yōu)化患者預(yù)后[10-11]。

臨床中肺炎鏈球菌和無乳鏈球菌是常見的致病菌，肺炎鏈球菌能引起包括肺炎在內(nèi)的菌血癥、腦膜炎和急性中耳炎等疾病，無乳鏈球菌是能引起孕婦產(chǎn)褥期膿毒血癥和新生兒腦膜炎的一個重要原因，可引起產(chǎn)后感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染及骨髓炎。因此，能準(zhǔn)確鑒定對診斷具有重要意義[12-13]。傳統(tǒng)鏈球菌鑒定方法為根據(jù)菌落形態(tài)和溶血情況進行初篩，再進行生化反應(yīng)、桿菌肽試驗、CAMP試驗、API 20 Strep或VITEK 2等細菌鑒定儀器確定菌種種類，但這些方法有時難以將菌種準(zhǔn)確區(qū)分，且耗時長[14-15]。通過將上述這些方法及測序方法與MALDI-TOF MS進行比較，不少研究證明后者在鏈球菌鑒定方面具有較高的一致性和應(yīng)用價值[16-22]。

隨著不同質(zhì)譜系統(tǒng)的出現(xiàn)，對其進行系統(tǒng)間的鏈球菌屬鑒定能力評估也顯得愈加重要。國內(nèi)外分別有研究報道，VITEK MS對鏈球菌的鑒定能力稍強于Bruker Biotyper[23-24]。在前人研究基礎(chǔ)上，本研究使用16S rRNA測序鑒定134株鏈球菌結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，評估VITEK MS、Bruker Biotyper和Autof MS1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對鏈球菌屬的鑒定能力。與前人研究相似，3套質(zhì)譜系統(tǒng)均能很好地鑒定化膿鏈球菌和無乳鏈球菌等大部分鏈球菌菌種(準(zhǔn)確率100.00%)。其次，已有報道說明VITEK MS和Bruker Biotyper系統(tǒng)易將緩癥鏈球菌鑒定為緩癥鏈球菌/口腔鏈球菌，且對肺炎鏈球菌鑒定準(zhǔn)確率有待提高，本研究也得出相似結(jié)果，并顯示Autof MS1000也存在相似的問題(本研究中3套質(zhì)譜系統(tǒng)對肺炎鏈球菌準(zhǔn)確率分別94.73%、78.94%、94.73%)。這提示有待尋找這些鏈球菌種中更多的質(zhì)譜特異峰，來進一步提高鑒定的準(zhǔn)確率[20]。

同時，本研究顯示，3套質(zhì)譜系統(tǒng)仍然存在無法鑒定或不能準(zhǔn)確區(qū)分亞種的情況，如VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)有5.97%菌株無法鑒定，3套系統(tǒng)均無法鑒定星座鏈球菌星座亞種，Autof MS1000型質(zhì)譜儀及Bruker Biotyper系統(tǒng)無法鑒定停乳鏈球菌似馬亞種、VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)將21株停乳鏈球菌似馬亞種中9株鑒定為停乳鏈球菌停乳亞種且有3株無鑒定結(jié)果。MALDI-TOF MS鑒定的覆蓋率和準(zhǔn)確率依賴于較完善的質(zhì)譜菌種鑒定數(shù)據(jù)庫的建立，數(shù)據(jù)庫中圖譜的質(zhì)量、數(shù)量都將直接影響鑒定的成功率與準(zhǔn)確率[25-26]。筆者建議3套質(zhì)譜系統(tǒng)在數(shù)據(jù)庫更新建庫時，入組更多的星座鏈球菌及停乳鏈球菌不同亞種，以優(yōu)化數(shù)據(jù)庫，提高鑒定成功率與準(zhǔn)確率，更好地服務(wù)于臨床。

當(dāng)然，本研究亦存在不足之處，即菌種數(shù)量分布不均勻，后續(xù)可進行多中心實驗，擴大標(biāo)本量，進行進一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，鏈球菌是臨床重要的病原菌，本研究結(jié)果顯示VITEK MS、Bruker Biotyper和Autof MS1000對無乳鏈球菌、化膿鏈球菌可準(zhǔn)確鑒定、直接報告；但是對一些種類菌株鑒定結(jié)果有誤或不能鑒別亞種，需要DNA序列分析或結(jié)合血清學(xué)或其他補充實驗來準(zhǔn)確鑒定。同時，有待對某些鏈球菌菌種亞種的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行優(yōu)化補充，探索更多的菌種特異性質(zhì)譜峰，以進一步提高鑒定成功率和準(zhǔn)確率。