陳梨 張麗琴 謝超

皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科,蕪湖241002

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,人類發(fā)現(xiàn)了越來越多的疑難病例,各種病原體的變異導(dǎo)致了復(fù)雜感染性疾病發(fā)生率逐漸增加,精準(zhǔn)快速的病原學(xué)診斷可以幫助臨床醫(yī)師及時(shí)優(yōu)化抗菌藥物的使用,從而減少住院時(shí)間、提高治愈率、改善預(yù)后。目前常用的微生物檢測方法有痰涂片、痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)、腦脊液、胸腹水化驗(yàn)、PCR 等,其中痰標(biāo)本獲取干擾因素較多,培養(yǎng)陽性率較低,檢測種類有限,缺乏病原體類型、致病性、耐藥信息以及罕見或未知的新發(fā)病原體相關(guān)信息,容易造成漏診、誤診。故上述方法已不能有效地滿足臨床需求。而隨著二代測序 (next-generation sequencing,NGS)技術(shù)的不斷成熟和普及,為臨床上感染性疾病的病原學(xué)診斷提供了一種新的有價(jià)值的診斷工具?，F(xiàn)將NGS在臨床上的部分應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 NGS

在20世紀(jì)70年代,Sanger等分別開發(fā)了通過鏈終止和片段化技術(shù)對(duì)DNA 進(jìn)行測序的方法,這些方法提供了破譯完整基因以及整個(gè)基因組的工具,從而改變了生物學(xué)。Sanger等開發(fā)的第一代測序技術(shù) (Sanger測序)測序準(zhǔn)確性高、讀長較長,在人類基因組計(jì)劃及其他領(lǐng)域取得重大成就,Sanger技術(shù)實(shí)現(xiàn)了2004年第一個(gè)人類基因組序列的完成[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,第一代測序技術(shù)已不能滿足目前全基因組測序的需求,因此出現(xiàn)了現(xiàn)在的新一代基因測序方法,即NGS技術(shù),又稱大規(guī)模平行測序或深度測序[2],包括第二代、第三代和第四代測序技術(shù)。目前,具有代表性的第二代測序平臺(tái)有基因組測序儀、HiSeq 2000和MiSeq、寡聚物連接檢測測序 (sequencing by oligo ligation detection,SOLID)5500XL、個(gè)人化操作基因組測序儀;第三代測序平臺(tái)有HeliScope遺傳分析系統(tǒng)和單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù);第四代測序技術(shù)有納米孔測序技術(shù)[3]。代表性的第二代測序平臺(tái)主要技術(shù)核心原理是橋式PCR 和熒光可逆終止子的邊合成邊測序,先構(gòu)建待測單鏈DNA文庫,形成寡核苷酸橋,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、變性,切掉d NTP 3'端延長終止基團(tuán),繼續(xù)添加堿基進(jìn)行測序;SOLID 測序技術(shù)是基于連接酶法,即利用DNA 連接酶在連接過程中測序,單鏈DNA 文庫構(gòu)建、微乳液PCR 擴(kuò)增以及連接酶測序;納米孔測序技術(shù)為單分子測序,有高通量的GridION 和U 盤大小MinION 測序儀[4]。因DNA 分子在電泳驅(qū)動(dòng)下通過納米微孔組成電路時(shí)可引起特征性電流變化,據(jù)此可確定DNA 分子的堿基類型和排列順序。其有生物納米孔和固態(tài)納米孔[5],后者較前者穩(wěn)定性更好?，F(xiàn)今NGS取得了令人矚目的進(jìn)展,正在發(fā)展成為分子顯微鏡,幾乎涉及生物醫(yī)學(xué)研究的每個(gè)領(lǐng)域[6]。

2 NGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的應(yīng)用

單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種革蘭陽性、兼性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌,可以污染食物,攝入后可導(dǎo)致多種動(dòng)物感染,包括牲畜和人類。單核細(xì)胞增生李斯特菌感染的嚴(yán)重程度取決于細(xì)菌菌株的毒力和宿主的免疫狀態(tài)[7]。由單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的腦炎雖很罕見,但有時(shí)是致命的。使用常規(guī)腦脊液測試很難早期診斷,而NGS越來越多地用于檢測病原體。Yao等[8]收集了2014年1月至2014年10月期間入住北京協(xié)和醫(yī)院的3例臨床疑似李斯特菌腦膜腦炎的患者,征得同意后將3例患者納入研究。在給予抗生素治療之前,按照標(biāo)準(zhǔn)程序收集腦脊液,快速冷凍并在-20 ℃下儲(chǔ)存。此3例急性/亞急性腦膜腦炎患者磁共振成像和血培養(yǎng)提示疑似單核細(xì)胞增生李斯特菌的診斷,而腦脊液培養(yǎng)是陰性的。在以上3種情況下,對(duì)收集的腦脊液進(jìn)行NGS鑒定并測序,顯示符合單核細(xì)胞增生李斯特菌的讀數(shù),并且獲得了后期PCR 檢測結(jié)果的驗(yàn)證。首次報(bào)道了NGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)李斯特菌感染中的應(yīng)用。李斯特菌腦炎通常呈現(xiàn)雙相病程。前驅(qū)癥狀包括發(fā)燒、頭痛、惡心、嘔吐,然后發(fā)展為進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,甚至發(fā)展到呼吸衰竭[9]。此報(bào)道中有2例患者發(fā)生呼吸衰竭。因此,早期明確診斷和適當(dāng)?shù)脑缙诳股刂委煂?duì)預(yù)后至關(guān)重要。

王小娟等[10]為明確5例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的致病微生物,采用血液與腦脊液常規(guī)、生化、細(xì)胞學(xué)、培養(yǎng)、革蘭染色等檢測方法,應(yīng)用BGISEQ-100 測序平臺(tái)進(jìn)行腦脊液病原體測序。利用Premier設(shè)計(jì)了2對(duì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,擴(kuò)增后采用ABI Prisma3730XL 型基因分析儀對(duì)其進(jìn)行測序分析。腦脊液NGS共檢測到李斯特菌的核酸序列數(shù)57～2 611條,平均730.8條。樣本檢出李斯特菌序列數(shù)與檢出微生物核酸總序列比值為15.08%～90.84%,平均60.21%,檢測深度為1,基因覆蓋度為0.23%～14.00%,平均3.80%。NGS在李斯特菌檢測方面具有優(yōu)勢,在較低基因組覆蓋下也可有效識(shí)別出細(xì)菌病原體[11]。病毒性腦炎是遺傳性原發(fā)性免疫缺陷患者發(fā)病和死亡的主要原因,如X連鎖性丙種球蛋白血癥[12]。Fremond等[13]報(bào)道了星狀病毒感染的腦膜炎病例。患有X 連鎖性丙種球蛋白血癥的14歲男孩,維持每3周高效價(jià)丙種球蛋白注射治療,表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、復(fù)發(fā)性癲癇發(fā)作,腦脊液、血液、痰和糞便等未發(fā)現(xiàn)病毒。腦脊液分析白細(xì)胞計(jì)數(shù)、葡萄糖水平和蛋白質(zhì)水平是正常的,PCR 和RT-PCR 是陰性的,右側(cè)額葉腦組織活檢、組織學(xué)結(jié)果無特異性。采用NGS進(jìn)行深度測序并進(jìn)行分析,鑒定了星狀病毒基因組大片段,顯示出與VA1/HMO-C進(jìn)化枝高水平同源性,獲得了完整的基因組,并將該新菌株命名為HAst V-VA1/HMO-CPA。更改治療方案聯(lián)合靜脈注射利巴韋林治療,患者運(yùn)動(dòng)行為、認(rèn)知得到改善。NGS其中一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)就是不僅限于細(xì)菌病原體,還可以檢測鑒定真菌和病毒[14-15]。NGS在疾病診斷中的可用性越來越高。

3 NGS在肺部感染中病原體檢測作用

肺部感染病發(fā)率較高,是臨床很常見的呼吸系統(tǒng)感染性疾病,治療不及時(shí)會(huì)發(fā)展為重癥肺炎、呼吸衰竭等,預(yù)后很差,病死率高,嚴(yán)重威脅人類健康。He等[16]報(bào)告了3例侵襲性肺曲霉菌病 (invasive pulmonary aspergillosis,IPA),其傳染性強(qiáng),病死率高。但I(xiàn)PA 的臨床診斷卻很困難,很難獲得微生物學(xué)證據(jù)?；颊咝谐Ｒ?guī)的抗感染治療癥狀未見好轉(zhuǎn)。對(duì)以上3例患者進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,使用NGS對(duì)支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)進(jìn)行測試。在收到樣品后48 h內(nèi),NGS即檢測到3例患者BALF中煙曲霉的序列讀數(shù)。其中2例患者BALF中的曲霉半乳甘露聚糖檢測為陽性,1例患者使用傳統(tǒng)方法檢測為陰性,包括血清半乳甘露聚糖檢測和BALF 半乳甘露聚糖檢測均為陰性,痰培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)真菌。即使接受治療,患者仍有反復(fù)發(fā)熱、咳痰、胸悶等癥狀,最后BALF通過NGS檢測到煙曲霉,證實(shí)為IPA。3例患者均給予伏立康唑抗真菌治療,上述癥狀逐漸好轉(zhuǎn),復(fù)查胸部CT 病灶明顯吸收。IPA 是一種致命的機(jī)會(huì)性真菌感染,常發(fā)生于血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者。然而在非傳統(tǒng)宿主中也報(bào)道了許多IPA 病例,尤其是COPD 患者[17]。在這些非中性粒細(xì)胞減少患者中,更容易發(fā)生誤診事件[18]。因此,早期明確肺曲霉菌病診斷具有重要意義。Parize等[19]報(bào)道了一項(xiàng)多中心前瞻性研究,采用NGS技術(shù)對(duì)101例免疫缺陷患者進(jìn)行病原體檢測,同時(shí)送檢血清、咽拭子、穿刺液體等標(biāo)本。該前瞻性研究結(jié)果表明NGS較傳統(tǒng)檢測方法有較高的檢出率以及更高的陰性預(yù)測值 (64/65,95%CI：0.95～1)。NGS可檢測出更多臨床相關(guān)的病毒和細(xì)菌。因此,NGS是免疫功能受損或免疫缺陷患者病原體診斷的前景方法。Pendleton等[20]使用宏基因組學(xué)檢測呼吸道病原體,報(bào)道了患有結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺炎的41歲女性患者和59歲敗血癥男性患者,使用宏基因組測序分別快速檢測出銅綠假單胞菌菌株和金黃色葡萄球菌菌株。NGS在加速和改善臨床常見致命疾病的診斷和治療方面具有很大潛力。

結(jié)核分枝桿菌在肺部感染的病原體中也占據(jù)了重要部分。Nomura等[21]進(jìn)行了一項(xiàng)回顧性研究,在心臟手術(shù)期間暴露于受污染的加熱器-冷卻器裝置的患者容易感染分枝桿菌嵌合體 (M.chimaera)。抗酸桿菌培養(yǎng)的診斷金標(biāo)準(zhǔn)通常需要侵入性取樣。研究人員采用NGS方法對(duì)10例曾做過心臟手術(shù)的患者的血漿進(jìn)行檢測,同時(shí)對(duì)獲取的標(biāo)本進(jìn)行抗酸桿菌培養(yǎng)。血漿NGS檢測到10例患者中有9例患有侵襲性疾病,其檢測所需的中位時(shí)間為4 d。其中7例患者血漿NGS 是第一個(gè)提供M.chimaera感染病原學(xué)確認(rèn)的試驗(yàn)。相反,抗酸桿菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)為陽性所需的中位時(shí)間為20 d,確認(rèn)M.chimaera的中位時(shí)間為41 d。該隊(duì)列中獲得的24個(gè)抗酸桿菌血培養(yǎng)物中,僅4個(gè) (17%)為陽性。其中90%的患者進(jìn)行了侵入性手術(shù),并且僅在5 例患者(50%)的標(biāo)本培養(yǎng)中提示了分枝桿菌生長。M.chimaera感染的患者因潛伏期較長以及其非特異性癥狀而不易被識(shí)別[22]。因此血漿NGS可以比抗酸桿菌培養(yǎng)物更快更準(zhǔn)確地檢測M.chimaera,使其成為一種很有價(jià)值的新型診斷工具。另一方面,結(jié)核分枝桿菌耐藥也是全世界主要的健康問題之一。Ko等[23]應(yīng)用NGS對(duì)易感結(jié)核分枝桿菌菌株和耐藥菌株進(jìn)行遺傳分析,并通過估算NGS的陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值來檢測菌株的耐藥性。研究人員在Hallym 大學(xué)醫(yī)學(xué)中心收集了36株從臨床標(biāo)本中分離的結(jié)核菌株,通過培養(yǎng)基制作、核酸提取、PCR 和基因測序、生物學(xué)信息分析、估計(jì)預(yù)測值及統(tǒng)計(jì)分析綜合程序得出結(jié)果,共有24種變體與耐藥性相關(guān),基因型和表型都一致對(duì)異煙肼、利福平、乙胺丁醇敏感,對(duì)鏈霉素、阿米卡星反應(yīng)較差,所有藥物類別陰性預(yù)測值均大于97%,而陽性預(yù)測值為44%～100%。該研究成功地應(yīng)用NGS進(jìn)行了結(jié)核分枝桿菌耐藥性、敏感菌株的遺傳分析,獲得了多態(tài)性和可能多態(tài)性列表,有可能成為在分枝桿菌試驗(yàn)中應(yīng)用NGS的測試指導(dǎo)。

肺部感染的病原體很多,其中病毒感染也占據(jù)了重要的位置,而且病毒結(jié)構(gòu)非常簡單,且更易突變,臨床上不易檢測到。Yang等[24]使用大量寡核苷酸探針來富集34種呼吸DNA 和RNA 病毒的序列,減少NGS數(shù)據(jù)中的非病毒讀數(shù)并實(shí)現(xiàn)了基于NGS測序病原體鑒定的高性能。NGS在靶向檢測呼吸道病毒方面使用llumina MiSeq系統(tǒng)擴(kuò)增和測序富集文庫,實(shí)現(xiàn)了與分子測定相當(dāng)?shù)牟《緳z測靈敏度,并獲得了每種病毒的部分甚至完整的基因組序列以獲得精準(zhǔn)的基因分型和變體分型。Wollants等[25]報(bào)道了1例中老年男性感染西尼羅河病毒,它是一種廣泛存在的全球再生病原體,感染初始可能僅有流感樣癥狀,隨著病情發(fā)展可導(dǎo)致多臟器功能衰竭等危重情況。入院血象、尿沉渣、胸片、超聲等均正常,對(duì)BALF進(jìn)行多重PCR 檢測,結(jié)果顯示22種不同的呼吸道病原體呈陰性。結(jié)核分枝桿菌的單重PCR 結(jié)果也為陰性。免疫熒光和PCR 檢測卡式肺囊蟲的結(jié)果仍是陰性。腦脊液分子診斷結(jié)果顯示13 種病原體呈陰性,血清學(xué)檢測顯示12 種病原體呈陰性。采取NGS 對(duì)BALF樣本和病毒培養(yǎng)物進(jìn)行檢測,對(duì)NGS結(jié)果分析,確定了完整的西尼羅河病毒基因組 (11 060 nt)。并且在BALF標(biāo)本和細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行新的RNA 提取和新開發(fā)引物逆轉(zhuǎn)錄PCR,并進(jìn)行Sanger測序,該陽性標(biāo)本序列與來自NGS獲得的完整基因組的序列相同。分子檢測是用于診斷呼吸道病毒性病原體的金標(biāo)準(zhǔn)方法,NGS較RT-PCR 相比可提供更多的病毒序列和分型信息。所以,在傳統(tǒng)方法檢測病原體陰性時(shí),NGS可成為識(shí)別臨床標(biāo)本中未知病原體的有力工具。

4 NGS在膿毒血癥中進(jìn)行病原體檢測

膿毒癥是由血流感染所引起的臨床綜合征,并且膿毒性休克是患者對(duì)治療措施反映出治療不佳的一種臨床表現(xiàn)[26]。膿毒血癥患者病死率在全球范圍內(nèi)很高,尤其是在不能及時(shí)明確病原體和抗生素非合理使用的情況下病死率會(huì)進(jìn)一步增加[27]。Abril等[28]報(bào)道了1例牧羊犬咬傷的60歲男性患者,1周后出現(xiàn)體溫升高、心率加快、血壓下降,經(jīng)驗(yàn)使用廣譜抗生素治療。入院血培養(yǎng)陰性,腦脊液革蘭染色和單純皰疹病毒PCR 均為陰性。收集患者血漿標(biāo)本進(jìn)行NGS,24 h內(nèi)NGS分析檢測到高水平微生物DNA,其讀數(shù)沿整個(gè)犬咬二氧化碳嗜纖維菌 (C canimorsus)基因組排列,檢測出C canimorsus,之后并對(duì)血培養(yǎng)物分離進(jìn)行16S r RNA 測序確認(rèn)。該病例首次報(bào)告了其在膿毒癥重癥患者中的應(yīng)用,突出了NGS在臨床有限時(shí)間范圍內(nèi)提供相關(guān)診斷性數(shù)據(jù)的巨大希望,并對(duì)改善抗生素治療具有重要意義。

Grumaz等[29]報(bào)道了1篇關(guān)于NGS技術(shù)應(yīng)用于膿毒癥患者病原體檢測的觀察性研究,納入了25例患者,其中包括7例膿毒癥患者、12名健康志愿者、6例接受過腹部手術(shù)的患者 (在該研究中分析了不同時(shí)間點(diǎn)的血漿),總計(jì)62份血漿樣本,同時(shí)進(jìn)行厭氧血培養(yǎng)、需氧血培養(yǎng)、PCR檢測、傷口拭子、導(dǎo)管和糞便標(biāo)本培養(yǎng),以及NGS對(duì)血漿標(biāo)本進(jìn)行檢測。膿毒性休克患者的cfDNA 濃度水平增加(平均197.23 μg/L),尤其在膿毒癥發(fā)病期間 (平均377.30μg/L);并且與對(duì)照組相比發(fā)病期間膿毒癥患者的平均分類讀數(shù)較高 (9.82%),明顯高于健康組 (3.50%)和腹部手術(shù)前組 (2.64%),這表明膿毒癥患者細(xì)菌負(fù)荷較高。而且在血漿樣本中發(fā)現(xiàn)了來自致病細(xì)菌顯著水平的DNA 片段,檢測出病原體有陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單純皰疹病毒、肺炎克雷伯菌、脆弱擬桿菌,并在28 d試驗(yàn)期內(nèi)完善通過傳統(tǒng)方法檢測到的病原體數(shù)據(jù),其與NGS檢測結(jié)果匹配,從而得到證實(shí)。所以,該方法有望成為膿毒血癥患者比較有前景的診斷方式。

5 結(jié)語與展望

現(xiàn)今感染性疾病發(fā)病率越來越高,隨之而來的疑難病原體感染發(fā)生率也逐漸增加,從而加大了臨床醫(yī)師診治的難度。若診斷不明確、治療不及時(shí),病情會(huì)迅速進(jìn)展,乃至發(fā)生重癥炎癥、多臟器功能衰竭等危重疾病,甚至死亡。NGS技術(shù)不斷發(fā)展,改變了基因組分析,為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用開辟了很多新機(jī)會(huì),其快速無偏的特性補(bǔ)充了傳統(tǒng)方法檢測病原體的不足,有很好的臨床使用價(jià)值。但NGS目前仍缺乏相關(guān)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn),又因價(jià)格較昂貴,臨床上仍以傳統(tǒng)方法檢測為主,目前NGS總體使用率仍不高。但隨著社會(huì)的快速發(fā)展,有理由相信NGS在未來臨床感染性疾病中的使用會(huì)更加廣泛,利用其快速精準(zhǔn)明確病原體的優(yōu)勢,成為臨床上一項(xiàng)重要的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突