羅應(yīng)坤 綜述 張霓霓 黃桂林 審校

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院,貴州 遵義 563006)

1 簡 介

脫細(xì)胞組織被廣泛應(yīng)用于臨床組織修復(fù)和再生。一些組織如皮膚、小腸黏膜下層、膀胱，以及來源于人、豬和牛的心包膜，已經(jīng)可進(jìn)行脫細(xì)胞化并制成商用支架[1]。同時(shí)，在基礎(chǔ)研究和臨床前研究中表明，還有大量的其他組織和器官已經(jīng)經(jīng)過脫細(xì)胞化，并應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的各個(gè)方面[2]。脫細(xì)胞化后遺留下的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，作為組織的結(jié)構(gòu)支撐以及細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)和生物物理信號(hào)的來源發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ECM通過這兩個(gè)角色指導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、分化和行為[3]。每種組織的ECM為駐留細(xì)胞提供獨(dú)特的組織特異性微環(huán)境。這種干細(xì)胞龕已適應(yīng)自然，為細(xì)胞提供了其發(fā)揮功能所需的結(jié)構(gòu)和生化信號(hào)[4]。因此推測脫細(xì)胞組織材料對該組織來源的細(xì)胞分化應(yīng)有明顯的影響。利用天然的干細(xì)胞龕引導(dǎo)細(xì)胞向特定的細(xì)胞譜系分化已經(jīng)成為研究組織工程的熱門途徑。通過更加深入地了解脫細(xì)胞組織對細(xì)胞分化的影響，可以為細(xì)胞命運(yùn)的控制和再生治療的發(fā)展提供一個(gè)更有用的平臺(tái)。本文將回顧制備脫細(xì)胞組織材料的不同方法和這些材料對細(xì)胞行為影響的研究，重點(diǎn)回顧細(xì)胞分化。這些材料可以是整個(gè)器官支架，ECM的切片或塊，水凝膠及涂層，且現(xiàn)已從以下組織中成功制備：肺，肝，腎及涎腺。

2 制備去細(xì)胞化組織材料的方法

2.1脫細(xì)胞方法 組織脫細(xì)胞化的目標(biāo)是保留ECM中所有的結(jié)構(gòu)和生化信號(hào)，并去除在宿主中引起不良炎癥反應(yīng)和阻礙組織再生的細(xì)胞成分[2]。現(xiàn)有的組織脫細(xì)胞方案有機(jī)械、化學(xué)、酶解或去垢劑等不同方法[2,3]，在對上述方案進(jìn)行了全面的比較后，還未找到對于每種組織均適用的最佳方案[2,5,6]。在選擇脫細(xì)胞化方案時(shí)，重要的是要認(rèn)識(shí)到一種方法并不適用于所有的組織，因?yàn)椴煌慕M織在ECM密度、細(xì)胞密度和基本形態(tài)都上是不同的[2]。簡單地說，凍融會(huì)影響ECM的超微結(jié)構(gòu)，壓力技術(shù)可能會(huì)影響ECM纖維的機(jī)械性能，堿性和酸性的溶液會(huì)降解ECM成分，離子去垢劑則會(huì)破壞蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)鍵，且后期難以從基質(zhì)中清除，酒精也被證明在ECM交聯(lián)膠原蛋白增加其剛度[1、2、6-8]。所有這些因素也會(huì)影響細(xì)胞與材料的相互作用，因?yàn)樗鼈兏淖兞思?xì)胞直接接觸的環(huán)境。因此，必須謹(jǐn)慎地為每種組織選擇理想的脫細(xì)胞方法，因?yàn)樗鼤?huì)影響細(xì)胞向特定譜系分化的成功[9]。簡而言之，必須在設(shè)計(jì)和選擇最佳的脫細(xì)胞方案時(shí)仔細(xì)考慮，才可最終將組織材料進(jìn)行加工。

2.2材料準(zhǔn)備 雖然脫細(xì)胞的組織材料可以作為完整的器官保留下來，但也可以對它們進(jìn)行進(jìn)一步加工，比如：切割成小片或小塊，或溶解成液體制成水凝膠或基質(zhì)涂層。每種組織都可以被加工成為不同類型的材料，并有不同的好處。當(dāng)目標(biāo)是設(shè)計(jì)一個(gè)可移植器官時(shí)，在去細(xì)胞化過程中保持整個(gè)器官的完整是很重要的。去細(xì)胞化器官維持著器官的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)以及自然的ECM組成，從而為器官的再細(xì)胞化和再生提供了平臺(tái)[1]。

如果不需要一個(gè)完整的器官進(jìn)行研究，那么可以使用脫細(xì)胞的器官薄片作為一種更方便的方法來測試ECM對細(xì)胞的影響，因?yàn)槠淙匀槐３纸M織的結(jié)構(gòu)和生化組成。制作這種切片主要有兩種方法，一是先將整個(gè)器官去細(xì)胞，然后將其切成薄片；二是將未加工的器官切成薄片，然后再將切片脫細(xì)胞。片切脫細(xì)胞后的器官，必須先將其埋入瓊脂糖、OCT冷凍介質(zhì)或石蠟中使其變硬[9-12]。然而，制作脫細(xì)胞化切片最常見的方法還是先將組織切成所需的厚度，然后再將切片脫細(xì)胞化。該方法已用于肌腱、腦、腎、肺、肝、角膜基質(zhì)和真皮[21-26]。脫細(xì)胞材料也可以制成介于完整器官和器官薄片之間大小，例如骨組織的4×4×3 mm立方體[30]或筋膜組織的4×2×0.5 cm切片[31]。

脫細(xì)胞組織也可以進(jìn)一步加工成水凝膠。水凝膠通常用于向損傷部位注射以促進(jìn)組織再生，但它同時(shí)也是細(xì)胞培養(yǎng)的有利平臺(tái)，因?yàn)樗鼈兛梢员淮罅恐圃?，并且比ECM切片更容易存留細(xì)胞。制備方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮托枰薷牡奶匦杂泻艽蟮牟煌＿@些方法包括使用脫細(xì)胞基質(zhì)作為水凝膠的唯一成分、使用交聯(lián)劑，或者加用其他材料合成復(fù)合材料以進(jìn)一步調(diào)節(jié)其性能。用胃蛋白酶對ECM進(jìn)行凍干、碾磨和消化是一種將ECM作為水凝膠中唯一成分的常見方法。隨后將ECM置于常溫環(huán)境中形成水凝膠[26,32-36]。這些材料可單獨(dú)用于體內(nèi)[32-35]或在體外創(chuàng)建2D及3D培養(yǎng)環(huán)境[36]。

ECM材料的最后一類是基質(zhì)涂層。首先通過類似于制造水凝膠的消化過程，制作一種以ECM作為原料的液體，然后將ECM蛋白吸附到組織培養(yǎng)器材表面。細(xì)胞隨后被播種到涂層板或孔中，并與特定的生化信號(hào)相互作用。涂層類似于薄的脫細(xì)胞組織切片，其創(chuàng)建了一個(gè)2D平面來進(jìn)行研究，但是卻不再維持組織的固有結(jié)構(gòu)。

3 ECM對細(xì)胞分化的影響

每種組織都有其獨(dú)特的ECM組合物，并且以各種方式影響細(xì)胞分化。除了組織的結(jié)構(gòu)，生化信號(hào)也在細(xì)胞命運(yùn)決定中起著重要作用?，F(xiàn)已經(jīng)完成了多種實(shí)驗(yàn)來研究這種與不同組織、細(xì)胞類型和條件的相互作用。

3.1肺 許多研究表明，脫細(xì)胞肺基質(zhì)能夠促進(jìn)更成熟的細(xì)胞類型(如祖細(xì)胞)向肺特異性細(xì)胞分化，而其他更原始的細(xì)胞類型則需要額外的信號(hào)才能開始向肺特異性細(xì)胞分化。Cortiella等人將小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)接種到小塊的脫細(xì)胞大鼠肺基質(zhì)上，并使用肺細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。然而，與對照組相比，肺ECM的孔隙度和剛度的差異，不足以得出差異是由于ECM本身，而不是材料的機(jī)械和傳輸性能的變化所引起的結(jié)論。在灌注生物反應(yīng)器中觀察到，使用小氣道上皮生長培養(yǎng)基在全脫細(xì)胞大鼠肺中培養(yǎng)人源間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)，肺上皮細(xì)胞標(biāo)記物增加[13]。之前的研究中使用了補(bǔ)充劑來達(dá)到最后的結(jié)果。進(jìn)一步的研究也表明，肺ECM需要添加培養(yǎng)基補(bǔ)充劑來誘導(dǎo)MSCs的向肺特異性細(xì)胞分化，而不能只使用常規(guī)生長培養(yǎng)基[10]。

3.2肝臟 多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)已證明，肝ECM能夠引導(dǎo)細(xì)胞向肝細(xì)胞分化或維持肝細(xì)胞表型。初步研究確定，在兩層脫細(xì)胞豬肝水凝膠間播種的人原代肝細(xì)胞，在觀察白蛋白分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)能力和氨代謝等功能特性時(shí)，其肝細(xì)胞表型與在基質(zhì)凝膠上培養(yǎng)時(shí)一樣成功[18]。隨后的一項(xiàng)研究將人胎兒肝細(xì)胞和人胎兒衛(wèi)星細(xì)胞在完全脫細(xì)胞的豬肝臟中灌注了13 d，并根據(jù)表型和基因分析顯示細(xì)胞有完全成熟為上皮細(xì)胞的趨勢[19]。

3.3腎臟 目前已應(yīng)用脫細(xì)胞腎組織完成了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，用細(xì)胞灌注全脫細(xì)胞腎臟顯示了其在組織工程中應(yīng)用的良好前景。當(dāng)使用mESCs接種于一個(gè)完整的脫細(xì)胞大鼠腎臟時(shí)，在基質(zhì)中內(nèi)層血管細(xì)胞上可見上皮分化[20]。其表明腎基質(zhì)對細(xì)胞分化有區(qū)域特異性作用。J.P.O′Neil等[35]人通過從豬腎臟的髓質(zhì)、乳頭和皮質(zhì)中直接制取ECM切片、水凝膠和培養(yǎng)基補(bǔ)充劑來檢測腎臟不同區(qū)域的區(qū)別，他們發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟干細(xì)胞在每個(gè)腎臟區(qū)域具有不同的代謝活性、增殖和形態(tài)學(xué)差異。雖然分化不是直接測量的，但差異顯示，不同的機(jī)械或生化信號(hào)也可能對干細(xì)胞分化產(chǎn)生區(qū)域特異性影響。值得注意的是，這些研究中沒有一項(xiàng)直接得出結(jié)論說腎臟引起了腎特異性細(xì)胞的分化。另一項(xiàng)比較恒河猴腎臟和肺基質(zhì)切片對hESCs的影響的研究表明，這兩種物質(zhì)都引起了肺和腎標(biāo)志物的增加，且兩者之間沒有顯著差異[22]。有學(xué)者[21]做了一項(xiàng)獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)，證明了脫細(xì)胞腎基質(zhì)可以用于骨工程，因?yàn)楸Ａ敉暾拿}管系統(tǒng)為成骨細(xì)胞提供營養(yǎng)。在這項(xiàng)研究中，他們使用成骨介質(zhì)將一個(gè)完整的脫細(xì)胞大鼠腎臟灌注入人類原代成骨細(xì)胞，并觀察到成骨細(xì)胞保持其表型并重建了腎基質(zhì)。這些結(jié)果表明，人們對腎ECM干細(xì)胞龕及其如何影響分化仍知之甚少。

3.4涎腺 學(xué)者[27]通過去垢劑對大鼠頜下腺進(jìn)行脫細(xì)胞，隨后將大鼠原代MSG細(xì)胞接種于其中，組織學(xué)染色及電鏡觀察顯示脫細(xì)胞頜下腺基質(zhì)有助于細(xì)胞粘附，免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了人工合成的頜下腺在體外顯示出了細(xì)胞分化的標(biāo)記物。在另一項(xiàng)研究中，學(xué)者[28]將人涎腺上皮細(xì)胞(SGECs)在豬脫細(xì)胞腸基質(zhì)上分別以2D和3D兩種形式進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)及同微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，免疫熒光及掃描電鏡的結(jié)果證實(shí)了在3D培養(yǎng)下，SGECs生長良好并形成了導(dǎo)管狀結(jié)構(gòu)，并且表達(dá)α-amylase，CL-1以及AQP-5，而2D培養(yǎng)下的SGECs僅有α-amylase陽性表達(dá)，且3D培養(yǎng)中的α-amylase相關(guān)基因表達(dá)也明顯高于2D培養(yǎng)。最新的成果顯示，接種于大鼠涎腺脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠上的大鼠涎腺干/祖細(xì)胞，經(jīng)過水凝膠3D培養(yǎng)后，相較于平面培養(yǎng)，其α-amylase在蛋白水平的酶活性提升了高達(dá)14倍，然而對成熟導(dǎo)管干/祖細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)有所下降，包括c-Kit，c-Met以及CD44。此外，細(xì)胞的基本上皮緊密連接標(biāo)記物，例如CL-1，CL-3，Keratin 5，Keratin 18及E-cad在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)經(jīng)過在水凝膠內(nèi)培養(yǎng)后恢復(fù)到了未經(jīng)處理的涎腺水平[29]。這些研究都表明涎腺脫細(xì)胞基質(zhì)能促進(jìn)涎腺干/祖細(xì)胞向功能性涎腺細(xì)胞的分化。

4 目前存在的問題

以上研究針對每種組織類型都研究了一些同樣的問題，這些問題為每種組織自身提出了一系列繼續(xù)向前發(fā)展的挑戰(zhàn)。常見的實(shí)驗(yàn)方法是探索脫細(xì)胞ECM的生化和機(jī)械信號(hào)在干細(xì)胞分化中的作用。這些研究為這些信號(hào)的效果提供了極為重要的洞見，但其成果往往局限于我們所能夠研究的機(jī)械和生化信號(hào)組合數(shù)量。ECM本身是極為復(fù)雜的機(jī)械生化信號(hào)組合，因此很難確定究竟是哪些特定的成分或組合導(dǎo)致某些細(xì)胞行為。此外，大多數(shù)在包含材料剛度的研究都局限于2D培養(yǎng)基，而非可能與生理學(xué)聯(lián)系更加緊密的3D培養(yǎng)基。

另一個(gè)常見問題是，分化是否存在組織或區(qū)域特異性影響。這些結(jié)果根據(jù)所比較的組織類型而不同。區(qū)域特異性在復(fù)雜器官內(nèi)對分化的特殊影響，為所有脫細(xì)胞組織研究提供了一個(gè)有趣的假想，例如腎臟。即使不考慮區(qū)域特異性的研究，在創(chuàng)建樣本時(shí)也必須保持謹(jǐn)慎，因?yàn)榭赡艽嬖跐撛诘膮^(qū)域成分差異，因此對分化的影響也不同。

根據(jù)所回顧的幾項(xiàng)研究，其他加工方法對ECM的影響也很重要。這為研究ECM效應(yīng)提出了額外的挑戰(zhàn)，因?yàn)椴牧媳旧砜梢愿淖儗?shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，繼續(xù)致力于改進(jìn)其處理方法是很重要的，但是在比較結(jié)果時(shí)也要保持處理方法的一致性。此外，還需要對ECM進(jìn)行更多的定量分析，如基于質(zhì)譜分析的QconCat技術(shù)，以更嚴(yán)格地評(píng)估ECM的差異和處理后脫細(xì)胞的效率。

最后一個(gè)在許多組織類型中反復(fù)出現(xiàn)的主題是病變脫細(xì)胞ECM對材料誘導(dǎo)分化能力的影響。這不僅對理解疾病機(jī)制很重要，而且對提升脫細(xì)胞ECM材料的生產(chǎn)力也很重要。許多可用作脫細(xì)胞材料的人體樣本要么已經(jīng)老化，要么已經(jīng)患病。為了確保制作的ECM材料的一致性，必須徹底了解可能影響材料質(zhì)量的因素(包括捐贈(zèng)者的健康狀況和年齡)。

5 結(jié) 論

脫細(xì)胞組織材料在許多不同的應(yīng)用中都取得了成功。目前這些材料的設(shè)計(jì)包括完整的器官基質(zhì)、切片、塊、水凝膠和涂層。為了保持原有的結(jié)構(gòu)，并結(jié)合所有有利于細(xì)胞分化的線索，還需進(jìn)一步擴(kuò)展用于創(chuàng)建脫細(xì)胞ECM的材料和方法[1-3]。每種組織在進(jìn)行脫細(xì)胞和處理材料時(shí)都有自身的障礙，隨著新的組織用于脫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將會(huì)有新的挑戰(zhàn)需要克服。每種不同的材料類別對于特定的應(yīng)用也有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，完整器官基質(zhì)可用于移植和器官替換；水凝膠最適合創(chuàng)建三維環(huán)境，可用于注射治療；切片和涂層有助于直接發(fā)現(xiàn)基質(zhì)成分對細(xì)胞分化的影響。

總的來說，脫細(xì)胞材料對細(xì)胞分化有明顯的影響。迄今為止，肺、肝、腎、涎腺、及其他脫細(xì)胞組織在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中顯示出對細(xì)胞分化有積極影響的跡象。然而，每種組織能引導(dǎo)細(xì)胞譜系分化的能力不同。肝臟組織表現(xiàn)出單獨(dú)使用ECM直接引導(dǎo)細(xì)胞分化的能力，且無需添加其他補(bǔ)充劑。其他組織對干細(xì)胞行為有影響，但需要額外的信號(hào)來控制干細(xì)胞朝組織特定譜系分化。這可能是由于獨(dú)特的組織微結(jié)構(gòu)、脫細(xì)胞過程中改變的ECM結(jié)構(gòu)及成分，或其他未知因素。因此必須進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以便更充分地了解這些細(xì)節(jié)。

在設(shè)計(jì)脫細(xì)胞組織材料時(shí)，了解組織和材料類型之間的差異是極其重要的。盡管人們普遍認(rèn)為ECM包含指導(dǎo)組織特異性基因表達(dá)的必要線索，但引導(dǎo)細(xì)胞分化需要許多因素，僅靠ECM可能不足以滿足所有組織工程目的。然而，現(xiàn)有的研究文章表明，脫細(xì)胞組織材料可以利用自然界自身的天然組分，成為一種強(qiáng)大的工具。隨著未來的研究和發(fā)展，該領(lǐng)域具有良好的潛力，為基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化組織工程研究提供強(qiáng)大的支持。