趙 波， 魏海萍

((1. 甘肅省平?jīng)鍪械诙嗣襻t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 平?jīng)?744000; 2. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 蘭州 730030)

腦卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致殘疾的主要原因之一。治療缺血性腦卒中關(guān)鍵策略是快速恢復(fù)腦血流，但是在血液再灌注期間通常發(fā)生組織損傷加重，即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷。因此，有效預(yù)防和控制I/R損傷具有重要臨床意義。利格列汀是二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4, DPP-4)抑制劑，是一種治療2型糖尿病藥物。利格列汀可改善胰島素抵抗大鼠腦胰島素敏感性和認(rèn)知功能障礙[1]。除了降糖作用以外，利格列汀對葡萄糖誘導(dǎo)神經(jīng)退行性病變線蟲模型具有保護(hù)作用[2]。此外，利格列汀對動物心臟I/R損傷模型也具有保護(hù)作用[3]。根據(jù)上述研究推測，利格列汀也可能在動物腦I/R損傷模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，本研究目的是評估利格列汀在小鼠腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)誘導(dǎo)I/R損傷模型中的神經(jīng)保護(hù)作用，并對其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

雄性BALB/c小鼠(22～28 g)，購于甘肅醫(yī)學(xué)院動物中心。室溫下自由飲食和飲水。將BALB/c小鼠隨機(jī)分成：Sham組、I/R組、利格列汀(2.5 mg/kg)+I/R組、利格列汀(5 mg/kg)+I/R組和利格列汀(10 mg/kg)+I/R組，每組均為8只小鼠。不同劑量利格列汀組小鼠均在I/R前3周連續(xù)灌胃給藥，劑量分別為2.5、5和10 mg/kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；冰凍切片機(jī)(德國Leica公司)；利格列汀(日本朝日化學(xué)公司)；TTC染料(美國Sigma公司)；谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；PI3K、AKT和mTOR ELISA試劑盒(上海內(nèi)含子生物科技有限公司)。

1.3 MCAO誘導(dǎo)小鼠腦I/R模型

腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.06 g/kg)麻醉小鼠，剪毛后進(jìn)行頸部手術(shù)。在顯微鏡下分離頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，對頸總動脈近心端和頸外動脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，用針在頸外動脈遠(yuǎn)端動脈壁上扎一個(gè)小口，將線栓從頸外動脈小孔插入頸總動脈，通過頸內(nèi)動脈到達(dá)大腦中動脈，固定線栓，MCAO后1 h 拔出線栓，縫合皮膚，再灌注24 h評估神經(jīng)功能缺損(n=8)和及梗死體積(n=4)；再灌注48 h檢測腦組織中GSH、MDA、PI3K、p-Akt和mTOR含量(n=4)。模型成功的標(biāo)志是小鼠麻醉清醒后出現(xiàn)手術(shù)側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，小鼠可存活1周。I /R 手術(shù)成功率約為70%。Sham 組小鼠只進(jìn)行相關(guān)手術(shù)步驟，但不插入線栓。

1.4 小鼠神經(jīng)功能缺損評估

小鼠再灌注24 h，按照改良Beordson’s法[4]進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。0分為正常行走，無神經(jīng)功能缺損；1分為提尾懸空時(shí)，手術(shù)對側(cè)前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲、肩內(nèi)旋及肘外展；2分為將小鼠置于光滑平面上，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動時(shí)阻力降低；3分為小鼠置于光滑平面上，圍繞手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈者；4分為不能行走，意識喪失。評分越高，神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

1.5 小鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)性評估

各組小鼠評估前3 d進(jìn)行連續(xù)適應(yīng)，小鼠再灌注24 h后，通過旋轉(zhuǎn)桿試驗(yàn)測定各組小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力[5]。把小鼠被放置在直徑3 cm防滑桿上，桿以10 r/min速度旋轉(zhuǎn)，記錄小鼠從桿上跌下時(shí)間。

1.6 小鼠大腦梗死體積的檢測

小鼠再灌注24 h，大腦行冠狀切片，厚度為2 mm。然后將腦片放入1% TTC磷酸鹽緩沖液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。腦梗死區(qū)域不染色(灰白色)，而正常腦組織染為深紅色。依據(jù)相關(guān)研究[6]方法計(jì)算I/R后腦梗死體積。

1.7 小鼠腦組織MDA和GSH含量的檢測

小鼠再灌注48 h，將小鼠迅速斷頭取腦，放入 -80℃冰箱保存。腦組織在10%冰冷磷酸鹽緩沖液中勻漿，然后離心(4 000 r/min)取上清液。按照檢測試劑盒步驟檢測腦組織中MDA和GSH含量。

1.8 小鼠腦組織PI3K、P-Akt和TOR水平的ELISA檢測

腦組織在10%冰冷磷酸鹽緩沖液中勻漿，然后離心(4 000 r/min)取上清液，按照ELISA試劑盒規(guī)定的步驟檢測腦組織中磷酸化肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase, PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphoryated of protein kinase B, P-Akt)的活性和雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycinm,TOR)的含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 利格列汀對運(yùn)動協(xié)調(diào)影響

如表1所示，不同組小鼠基線下跌落時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與Sham組相比，I/R組小鼠跌落時(shí)間顯著降低(P<0.05)。與I/R組相比，不同劑量利格列汀均可顯著延長缺血后跌落時(shí)間 (P<0.05)。

Tab. 1 The effect of linagliptin on motor coordination of mice in each group (s, n=8)

2.2 利格列汀對神經(jīng)功能缺損影響

各組小鼠再灌注24 h，進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。Sham組小鼠無神經(jīng)功能缺損；與Sham組相比，I/R組小鼠神經(jīng)功能評分顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與I/R組相比，不同劑量利格列汀均可顯著降低小鼠神經(jīng)功能評分 (P<0.05，表2)。

各組小鼠再灌注24 h，進(jìn)行TTC染色。如圖1所示，Sham組小鼠無腦梗死；與Sham組相比，I/R組小鼠腦梗死體積顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與I/R組相比，不同劑量利格列汀均可顯著降低小鼠腦梗死體積(P<0.05，表2，圖1見彩圖頁Ⅳ)。

Tab. 2 The effect of linagliptin on the neurobehavioral score and infarct volume of mice in each group n = 8)

2.3 利格列汀對腦組織生化指標(biāo)影響

如表3所示，Sham組相比，I/R組小鼠腦組織MDA含量顯著增加(P<0.05)；利格列汀(2.5、5和10 mg/kg)可顯著降低I/R小鼠腦組織MDA含量(P<0.05)。Sham組相比，I/R組小鼠腦組織GSH含量顯著降低(P<0.05)；利格列汀(2.5、5和10 mg/kg)可顯著提高I/R小鼠腦組織GSH含量(P<0.05)。如表4所示，Sham組相比，I/R組小鼠腦組織PI3K、P- Akt和mTOR含量顯著降低(P<0.05)。而利格列汀(2.5、5和10 mg/kg)可顯著提高I/R小鼠腦組織PI3K、P-Akt和mTOR含量，并呈劑量依賴性(P<0.05)。

Tab. 3 The effects of linagliptin on MDA and GSH content in brain of mice in each group n=4)

Tab. 4 The effects of linagliptin on the contents of PI3K, pAkt and mTOR in the brain of mice in each group n = 4)

3 討論

這項(xiàng)研究為口服利格列汀(2.5、5和10 mg/kg)在I/R小鼠中的神經(jīng)保護(hù)作用提供了新的證據(jù)。這是首次通過神經(jīng)功能缺損評分、行為改變、腦梗死體積變化、氧化應(yīng)激和PI3K/PAKT/mTOR通路證實(shí)利格列汀在小鼠I/R模型中神經(jīng)保護(hù)作用。在本研究中，各組小鼠在缺血前、后體重及血糖變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示小鼠生理功能相對穩(wěn)定。這一發(fā)現(xiàn)排除了其他因素對利格列汀在MCAO小鼠中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的影響。結(jié)果也提示利格列汀對血糖水平影響主要取決于糖尿病狀態(tài)。先前研究表明，維達(dá)列汀對非糖尿病大鼠體重與代謝指標(biāo)變化無影響[7]。這與本研究是一致的。MCAO誘導(dǎo)小鼠I/R模型導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損評分增高及運(yùn)動協(xié)調(diào)性降低。本研究與先前研究一并反映出I/R動物可出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)和運(yùn)動功能障礙[8]。利格列汀預(yù)處理21d可顯著減少I/R小鼠神經(jīng)功能缺損評分，并改善I/R小鼠動物協(xié)調(diào)性。以往研究表明，DPP-4抑制劑維格列汀對魚藤酮帕金森病大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，并可改善運(yùn)動協(xié)調(diào)性[9]。

眾所周知，缺血性腦卒中在缺血過程中產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致缺血性腦組織DNA受到損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，I/R小鼠腦組織中MDA(脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物)含量增高，而GSH(內(nèi)源性抗氧化酶)含量減少。這意味著氧化應(yīng)激參與I/R小鼠神經(jīng)功能障礙。利格列汀預(yù)處理后，I/R小鼠腦組織中MDA降低，GSH含量增加，表明利格列汀抗氧化活性參與了I/R小鼠神經(jīng)保護(hù)作用。PI3K/AKT通路是一種公認(rèn)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)代謝、增殖、炎癥、生長和存活的途徑。激活PI3K導(dǎo)致p-Akt上調(diào)，其是神經(jīng)元存活和生長關(guān)鍵因素[11]。同樣，mTOR是PI3K/AKT通路下游的重要成員，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、神經(jīng)元再生、生長、存活、血管生成和突觸可塑性[12]。在本研究中，I/R小鼠腦組織中PI3K、p-Akt和mTOR含量顯著減少。這一發(fā)現(xiàn)與以前研究是一致的。Li等人研究顯示，腦缺血導(dǎo)致PI3K/AKT/mTOR通路失活，隨后引起神經(jīng)元缺失及神經(jīng)功能障礙[13]。有研究報(bào)道，氧自由基升高可抑制Akt磷酸化和mTOR活化[14]。因此，在本研究表明，氧化應(yīng)激升高可能導(dǎo)致I/R小鼠PI3K/AKT/mTOR通路失活。利格列汀預(yù)處理I/R小鼠腦組織再PI3K、p-AKT和mTOR含量顯著增高。這表明利格列汀對I/R小鼠神經(jīng)保護(hù)作用通過激活PI3K/AKT/mTOR通路，可能是通過該通路的抗氧化活性。以往研究指出，利格列汀可通過激活p-AKT/PKB途徑減少肥胖糖尿病大鼠的腦梗死體積[15]。

本研究表明，利格列汀可能通過激活PI3K/AKT/mTOR通路，改善神經(jīng)功能缺損，減少梗死體積，對MCAO小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步研究需要明確利格列汀發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的確切分子機(jī)制。