中性粒細胞細胞外陷阱網(wǎng)與牙周炎的相關(guān)性研究進展

王曉宇 朱昭蓉 吳亞菲 趙蕾

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙周病科 成都 610041

中性粒細胞（neutrophil）又被稱為中性多形核白細胞（polymorphonuclear leukocyte），是人體內(nèi)重要的免疫細胞，在先天性免疫反應(yīng)中起到不可替代的作用，是抵御牙周致病菌入侵的重要因素。當(dāng)受到刺激時，中性粒細胞通過趨化活動，定向移動至感染部位并發(fā)揮吞噬作用，從而殺滅病原體。Brinkmann等[1]于2004年首次報道觀察到由中性粒細胞產(chǎn)生的中性粒細胞細胞外陷阱網(wǎng)（neutrophil extracellular trap，NET）。隨后，越來越多的學(xué)者關(guān)注NET在機體免疫防御中的作用。近年來發(fā)現(xiàn)NET在牙周炎相關(guān)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本文就NET與牙周炎相關(guān)性的研究進展進行闡述。

1 NET與NETosis

NET是由中性粒細胞受刺激后產(chǎn)生的一種細胞外纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由染色質(zhì)和細胞蛋白質(zhì)組成。通過電子顯微鏡可以觀察到，NET以直徑15～17 nm的DNA-組蛋白復(fù)合物為骨架，上面嵌有最大直徑約50 nm的球狀結(jié)構(gòu)，包括中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組織蛋白酶（cathepsin，CTS）G等多種顆粒源性蛋白質(zhì)，其中組蛋白通常包括H1、H2A、H2B、H3、H4等多種成分[1]。脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）可以通過水解NET的DNA成分，導(dǎo)致NET結(jié)構(gòu)分解，說明DNA成分是NET結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵組分。

中性粒細胞形成NET的過程被稱為NETosis，被認為是一種有別于凋亡和壞死的新型細胞死亡程序。NET通過識別、誘捕并限制細菌等病原體擴散，同時高表達抗菌肽等抗菌成分以最終殺滅病原體。NETosis的類型主要包括自殺式NETosis（suicidal NETosis）和存活式NETosis（vital NETosis）[2]。

自殺式NETosis是一種伴隨中性粒細胞死亡的NET形成方式，釋放過程約120 min。中性粒細胞主要表現(xiàn)為細胞核去濃縮，細胞膜崩解，細胞核細胞基質(zhì)混合，向細胞外排出自身DNA（self-DNA），表達纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3]。丙二醇甲醚乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）刺激中性粒細胞后，再通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的方式產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen specie，ROS）從而誘導(dǎo)NET形成[1-2,4]。ROS包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫、羥基自由基以及一氧化氮等。應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑二苯基氯化碘鹽能顯著降低甚至抑制NET的釋放，也印證了這一激活途徑[5]。該方式與Raf-有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路和蛋白激酶C密切相關(guān)[6]。此外，肽酰精氨酸脫亞氨酶（peptidylarginine dei-minase，PAD）4可以催化組蛋白瓜氨酸化，促進染色質(zhì)區(qū)去致密化，從而促進NETosis[7]。因此，ROS和PAD4均在自殺式NET形成過程中發(fā)揮著重要的作用。

存活式NETosis是一種不伴隨活化的中性粒細胞死亡且仍保持吞噬和趨化功能的NETosis，由細菌和細菌產(chǎn)物刺激產(chǎn)生，在30 min內(nèi)迅速發(fā)生。其形成過程不依賴于Raf-MEK-ERK通路和ROS，革蘭氏陰性菌大腸埃希菌通過Toll樣受體（Tolllike receptor，TLR）4激活血小板，通過中性粒細胞與血小板直接相互作用產(chǎn)生NET；革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌則通過激活補體受體3和TLR2誘導(dǎo)NET形成，其形成表現(xiàn)為細胞內(nèi)核膜保持完整，核DNA出芽并以囊泡形式釋放，中性粒細胞的功能不受影響[8-9]。此外，Yousefi等[10]采用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor）刺激后，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和補體成分5a （complement component 5a，C5a）再次刺激下產(chǎn)生NET。該NET的DNA不是來源于中性粒細胞的細胞核，而來源于其線粒體，其形成依賴于ROS，并且不伴隨中性粒細胞死亡。

目前，NET的檢測方式和體外標(biāo)志物尚無明確的金標(biāo)準(zhǔn)，可以通過透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡等觀察NET結(jié)構(gòu)，熒光顯微鏡共定位中性粒細胞來源的蛋白質(zhì)，例如MPO和蛋白酶（proteinase，PR）3、NE等和細胞外DNA，以確定NET形成。免疫染色檢測瓜氨酸化組蛋白的存在，通過PicoGreen?等熒光核酸染料檢測無細胞DNA[11]、酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay）測定MPO/NE-DNA復(fù)合體均可檢測NET。高速多光譜成像流式細胞術(shù)[12]、基于SYTOX綠色核酸染料的流式細胞術(shù)同樣可以定量NET[13]，而活細胞成像技術(shù)則可分析NET釋放過程[14]。

2 NET與牙周炎

2.1 NET在牙周組織中的抗菌作用

NETosis可能是中性粒細胞對牙周炎發(fā)揮作用的主要防御機制之一。

White等[15]觀察到在炎癥牙齦組織中NET表達較健康對照組增高。Vitkov等[16]也在牙周炎患者的牙齦活體組織檢查樣本及牙周袋內(nèi)化膿性滲出物中發(fā)現(xiàn)NET高表達，呈現(xiàn)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在NET中有大量細菌與其機械纏繞，且在上皮表面緊密排列。當(dāng)NET捕獲細菌時，多數(shù)中性粒細胞的特征為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)均質(zhì)化、細胞核腫脹及DNA擴散。

Vitkov等[17]還通過掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)牙周炎患者齦溝液中存在NET，齦溝液中的NET分布平坦，僅有少量白細胞；但在化膿性齦溝滲出物中，可觀察到三維纏結(jié)的NET和大量白細胞。而激光共聚焦顯微鏡顯示齦溝液和化膿性齦溝滲出物中中性粒細胞均表現(xiàn)為細胞核腫脹、常染色質(zhì)與異染色質(zhì)無差異且citH3向細胞核內(nèi)遷移。

1項病例對照研究[18]應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察到，牙齦炎及牙周炎樣本中的中性粒細胞存在典型的NETosis現(xiàn)象，表現(xiàn)為空核、核膜破裂、染色質(zhì)排出到細胞外介質(zhì)等。

共聚焦顯微鏡分析牙周炎樣本發(fā)現(xiàn)，在牙齦中，NET相關(guān)成分細胞外瓜氨酸組蛋白H3（citrullinated histone H3，citH3）與大量CD177中性粒細胞陽性染色，而在健康樣本中僅有少量citH3陽性，無CD177陽性中性粒細胞。citH3在牙齦炎樣本的口腔上皮和齦溝上皮中的表達均較牙周炎樣本高，表明NETosis在牙齦炎階段達到最大活性，更可能發(fā)揮出其殺菌性。

NET較少與上皮直接接觸，而是與黏附在牙齦上皮的細菌相結(jié)合，從而附著于上皮表面，保護牙齦免受游離細菌侵害，同時減少蛋白質(zhì)水解酶對牙齦上皮的損傷[16]。NET在牙周組織中的定位表明，NET不僅在齦溝液中捕獲大量細菌，阻礙細菌黏附和對牙齦上皮的侵入，還通過齦溝液的持續(xù)滲出消除齦溝中的游離細菌。

2.2 NET水平與牙周炎癥程度的相關(guān)性

NET在牙周組織中發(fā)揮積極的抗菌作用，但過多的NET可能增加炎癥負擔(dān)，從而產(chǎn)生有害影響，而牙周治療可以降低NET水平。1項病例對照研究[19]發(fā)現(xiàn)，在40名伴類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的牙周炎患者中，NET與平均探診深度和臨床附著喪失呈正相關(guān)（P<0.05）；多因素Logistic回歸分析顯示，外周血NET水平與中重度牙周炎顯著正相關(guān)， 但不伴風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的牙周炎組的NET僅略高于正常對照組，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義。牙周治療可以顯著降低伴類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的牙周炎患者血清NET水平。該研究表明，NET水平與牙周炎的嚴重程度相關(guān)。但在另一項研究[20]中，NET水平與實驗性牙齦炎探診出血、菌斑指數(shù)、齦溝液量不存在相關(guān)性，提示牙周臨床指標(biāo)與NET的相關(guān)性可能與機體所處的炎癥狀態(tài)有關(guān)，但仍需要更多臨床研究加以驗證。

White等[21]發(fā)現(xiàn)，雖然牙周炎患者組與正常對照組外周血中性粒細胞產(chǎn)生NET水平相當(dāng)，但是牙周炎患者降解NET的能力減弱，NET在牙周組織中存在時間加長。經(jīng)牙周治療后，牙周炎患者降解NET能力與正常對照組相當(dāng)，中性粒細胞釋放NET也明顯減少?；颊呓到釴ET的能力降低可能與血漿DNaseⅠ濃度較低及血漿免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G和抗NET免疫球蛋白的游離輕鏈（free light chain，F(xiàn)LC）水平升高相關(guān)。DNaseⅠ的減少可能阻礙NET的DNA組分降解，而IgG和FLC可能與NET結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而提供物理屏障，進一步妨礙NET降解。

NET在牙周組織滯留雖然可能延長NET抗菌能力，但是NET衍生的瓜氨酸肽可能促進自身抗體的產(chǎn)生和宿主牙周組織的損傷。因此，NET的產(chǎn)生/降解失調(diào)可能是牙周慢性炎癥導(dǎo)致組織持續(xù)破壞的原因之一。雖然目前尚不明確NET水平與牙周炎臨床指標(biāo)、牙周預(yù)后的相關(guān)性，以及NET在牙周炎癥中發(fā)揮作用的機制等，但是牙周治療可能通過恢復(fù)牙周炎患者降解NET的能力以降低NET水平，從而避免牙周組織的損傷。

3 NET與牙周致病菌

3.1 牙周致病菌對NET形成的誘導(dǎo)作用

多數(shù)牙周致病菌均可以誘導(dǎo)NETosis。White等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與未受刺激的中性粒細胞相比，格氏鏈球菌、具核梭桿菌、小韋榮氏球菌和粘放線菌的刺激可導(dǎo)致中性粒細胞釋放更多ROS。而格氏鏈球菌和小韋榮氏球菌同時刺激產(chǎn)生更多超氧化物。具核梭桿菌和格氏鏈球菌較其他細菌刺激生成更多NET。Jayaprakash等[23]證實，牙周重要致病菌牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）也可誘導(dǎo)大量ROS快速產(chǎn)生。Hirschfeld等[20]在齦上菌斑生物膜中檢測到NET、中性粒細胞殘留膜（CD177陽性），并在唾液及生物膜中發(fā)現(xiàn)NET相關(guān)蛋白質(zhì)MPO、CTSG、抗菌肽LL-37、NE，證實了從菌斑生物膜中分離的口腔細菌可刺激NET形成。

Hirschfeld等[24]還對19種牙周致病菌進行了檢測，發(fā)現(xiàn)NET的細菌捕獲作用與Socransky復(fù)合體類型無關(guān)。紅色復(fù)合體牙齦卟啉單胞菌，橙色復(fù)合體直腸彎曲菌、昭和彎曲菌、具核梭桿菌多形亞種，黃色復(fù)合體咽峽炎鏈球菌和格氏鏈球菌，紫色復(fù)合體小韋榮氏球菌及非復(fù)合體反芻月形單胞菌在捕獲細菌的NET中顯著增加；其他細菌特別是綠色復(fù)合體的差異則無統(tǒng)計學(xué)意義。與磷酸鹽緩沖液對照組相比，痤瘡丙酸桿菌、小韋榮氏球菌、格氏鏈球菌刺激的中性粒細胞產(chǎn)生更多的NET。痤瘡丙酸桿菌、咽峽炎鏈球菌、直腸彎曲桿菌均刺激總ROS的產(chǎn)生，咽峽炎鏈球菌、生痰二氧化碳嗜纖維菌和具核梭桿菌多形亞種刺激產(chǎn)生的細胞外超氧化物水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而NET殺菌測試顯示，被檢測的6種牙周細菌的活力均不受NET誘捕影響，說明NET不會阻礙牙周細菌生長或存活。

新近研究[25]發(fā)現(xiàn)，口腔鏈球菌和血鏈球菌誘導(dǎo)NET標(biāo)志物citH3水平升高，而只有血鏈球菌上調(diào)MPO水平，口腔鏈球菌則誘導(dǎo)更多的ROS產(chǎn)生。伴放線放線桿菌白細胞高致毒性的JP2基因型也被證實可誘發(fā)NET產(chǎn)生[26]。

以上研究表明，部分牙周致病菌可以不同程度地刺激中性粒細胞產(chǎn)生ROS，并釋放NET。其中NET主要通過捕獲細菌發(fā)揮作用，而不是直接殺滅細菌。但牙周致病菌是否通過NADPH氧化酶的方式產(chǎn)生ROS并刺激NET形成仍有待進一步探索。

3.2 牙周致病菌對NET形成的抑制作用

大部分牙周致病菌刺激NET釋放，而齦溝產(chǎn)線菌則被證實抑制NET形成[27]。齦溝產(chǎn)線菌或腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor）-α合并齦溝產(chǎn)線菌刺激的人中性粒細胞均不能形成NET，并且不誘導(dǎo)細胞外NE的釋放。雖然齦溝產(chǎn)線菌未能減少格氏鏈球菌或咽巴斯德氏菌誘導(dǎo)形成的NET，但其可抑制PMA誘導(dǎo)的NET生成。通過深入探究齦溝產(chǎn)線菌抑制NET生成的機制，有助于進一步揭示牙周致病菌與NET生成和降解的關(guān)系。

不同牙周致病菌刺激ROS和NET產(chǎn)生的能力不同，部分細菌（如齦溝產(chǎn)線菌）甚至可以抑制NET的產(chǎn)生，表明牙周致病菌激活NETosis具有異質(zhì)性。因此，需要更多的細菌相關(guān)研究以明確不同牙周致病菌與NET的關(guān)聯(lián)。

3.3 牙周細菌與NETosis調(diào)控的關(guān)系

許多牙周細菌已被證明可以釋放DNase水解NET結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)NET逃逸。27種牙周致病菌包括紅色和橙色復(fù)合體牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、具核梭桿菌、微小微單胞菌、中間普雷沃氏菌、星座鏈球菌、直腸彎曲菌和產(chǎn)黑素普雷沃氏菌等均表達DNase活性[28]。細菌分泌的DNase在體外刺激NET，發(fā)現(xiàn)NET被完全降解，證實了水解NET幫助細菌逃離的能力。

另有研究[24]應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑、過氧化氫和次氯酸消除劑刺激細菌，以抑制ROS依賴的NADPH氧化酶途徑，雖然金黃色葡萄球菌、格氏鏈球菌、直腸彎曲菌、具核梭桿菌多形亞種、反芻月形單胞菌總ROS的釋放均減少，但細菌刺激的NET生成不受影響；且抑制TLR不影響牙周細菌刺激的ROS量及NET形成，提示部分細菌通過非NADPH氧化酶依賴性途徑刺激NET形成。

以上研究表明，牙周致病菌可以表達DNase避免NET的捕獲，而非NADPH氧化酶依賴性NET的形成，即存活式NETosis可能在宿主防御牙周細菌中發(fā)揮重要作用。

牙周致病菌毒性因子同樣也可能參與調(diào)控NETosis，與此同時它們幫助細菌免疫逃逸NET。牙齦卟啉單胞菌相關(guān)毒性因子LPS濃度依賴性地啟動NADPH氧化酶依賴性的自殺性NETosis[29]。同時，LPS活化中性粒細胞這一過程可能使體內(nèi)NET過量，從而損害牙周組織。另一毒性因子牙齦卟啉單胞菌肽酰精氨酸脫亞氨酶（P. gingivalispeptidylarginine deiminase，PPAD）可以幫助細菌逃逸NET[30]。用高毒力菌株牙齦卟啉單胞菌W83與PPAD缺乏的W83菌株刺激中性粒細胞，可觀察到接受W83菌株刺激的中性粒細胞有更多完整的細胞核，表明W83菌株刺激更多的NET形成，而PAAD阻礙細菌誘導(dǎo)的NETosis。PPAD缺乏的W83菌株在NET內(nèi)細菌存活數(shù)量低于野生型W83菌株，表明PPAD缺乏菌株被NET捕獲并殺滅，證實PPAD能夠幫助細菌免疫逃逸NET。

共聚焦熒光顯微鏡觀察顯示，接受牙齦卟啉單胞菌野生型菌株ATCC33277和W50刺激的中性粒細胞具有完整的細胞核和肌動蛋白細胞骨架結(jié)構(gòu)，牙齦卟啉單胞菌毒性因子牙齦素同源突變株包括賴氨酸-牙齦素缺陷株K1A和精氨酸牙齦素缺陷株E8則誘導(dǎo)典型的NET結(jié)構(gòu)形成，提示牙齦素可能抑制NET生成[23]。伴放線放線桿菌的特異性毒性因子白細胞毒素（leukotokin，Ltx）是一種NET誘導(dǎo)劑[31]。Ltx誘導(dǎo)中性粒細胞腫脹，在誘導(dǎo)3 h后可見NET結(jié)構(gòu)，表明中性粒細胞發(fā)生NETosis是一個持續(xù)的緩慢的過程。10 ng·mL-1Ltx和伴放線放線桿菌低毒性菌株誘導(dǎo)NET的形成與PMA相似，而高濃度（100 ng·mL-1）Ltx和伴放線放線桿菌高毒性菌株則強烈誘導(dǎo)NET形成[32]，提示Ltx雖然具有強細胞毒性，但中性粒細胞仍能產(chǎn)生NET對其產(chǎn)生抗菌免疫反應(yīng)。

當(dāng)血清中存在補體時，接受伴放線放線桿菌刺激的中性粒細胞產(chǎn)生更多的NET，而通過熱滅活去除血清中的補體可抵消NET生成；此外，阻斷補體受體1（CD35）能顯著降低放線桿菌誘導(dǎo)的NET釋放[33]，說明血清補體及補體調(diào)理作用均參與NET的形成，提示部分細菌的補體滅活能力可能保護其他細菌免受NETosis侵害。

目前研究表明，牙周致病菌的毒性因子對NET的產(chǎn)生具有不同作用，部分毒性因子（例如LPS）可刺激NET產(chǎn)生，使中性粒細胞發(fā)揮抗菌作用；部分毒性因子（例如PPAD）則幫助細菌免疫逃逸NET。牙周致病菌不同毒性因子調(diào)控NETosis的具體機制還有待進一步深入研究。

對NET在牙周炎中的作用仍然存在爭議。NET捕獲和殺死微生物，對宿主發(fā)揮有益作用。同時，NET能排出自身DNA，可能引發(fā)自身免疫反應(yīng)。因此，調(diào)節(jié)NET形成以確保其生產(chǎn)和清除過程平衡在牙周免疫防御中至關(guān)重要。

4 NET與掌跖角化-牙周破壞綜合征

掌跖角化-牙周破壞綜合征又被稱為Papillon-Lefèvre綜合征（Papillon-Lefèvre syndrome，PLS），是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病，以彌漫性的手掌和腳掌過度角化、青春期嚴重而破壞迅速的牙周炎為特征，其患病率為1×10-6～4×10-6[34]。致病機制為編碼CTSC的基因突變，導(dǎo)致無功能的中性粒細胞絲氨酸蛋白酶（neutrophil serine protease，NSP），又被稱為二肽肽酶（dipeptidyl peptidase，DPP）Ⅰ的產(chǎn)生。NSP包括NE、CTSG、PR3以及NSP4。

PLS患者繼發(fā)于CTSC缺乏的中性粒細胞缺陷，導(dǎo)致NSP不能被激活，其累計效應(yīng)可能共同破壞牙周組織。與健康對照組相比，PLS患者NET及NET相關(guān)結(jié)合蛋白酶（NE、MPO、CTSG）顯著降低或者缺失；患者血漿中不存在LL-37[35]。S?rensen等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，PLS患者缺乏NE、CTSG、PR3，并且不能形成NET。PLS患者中性粒細胞中離子毒素刺激的由人源性陽離子抗菌肽（human cathelicidin antimicrobial peptide，hCAP）-18形成的LL-37顯著減少，其可能機制是由于缺乏PR3介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解，PLS患者不能將心源性陽離子抗菌肽加工成抗菌肽LL-37。NE是NET形成所必需的[37]，提示PLS患者可能因為缺乏NE所以不能有效形成NET。PLS患者中NET相關(guān)組分NE、CTSG、LL-37等的缺乏可能影響中性粒細胞的抗菌功能，導(dǎo)致PLS患者組織中致病微生物持續(xù)存在。

中性粒細胞活化后釋放的炎癥介質(zhì)在細胞密度為2×107～4×107cm-3時達到最高值，超過該密度后，聚集性NET會水解多余介質(zhì)。當(dāng)高密度的PLS患者中性粒細胞與NET誘導(dǎo)劑共培養(yǎng)時，不會降解白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和單核細胞趨化蛋白-1，反而產(chǎn)生更高濃度的炎癥介質(zhì)[38]，提示PLS患者不能有效形成聚集型NET以降解細胞因子和趨化因子，最終導(dǎo)致局部免疫炎癥狀態(tài)旺盛，造成持續(xù)性的牙周組織破壞。

綜上所述，多數(shù)PLS患者無全身性感染，可能與中性粒細胞特異性定位和機體遭受細菌攻擊部位有關(guān)。PLS患者缺乏NET抗菌活性，可能導(dǎo)致中性粒細胞對刺激物過度反應(yīng)，產(chǎn)生過多促炎細胞因子；同時，中性粒細胞無法形成聚集型NET，從而降解炎癥介質(zhì)的蛋白質(zhì)水解能力失效，缺乏對細胞因子和趨化因子的反饋機制，這可能是PLS患者持續(xù)的牙周炎癥破壞的重要原因之一。

5 總結(jié)

NET是中性粒細胞的一種新免疫途徑，其不僅對機體產(chǎn)生有利影響，還可能對組織造成損傷。NET與牙周炎的相關(guān)性免疫學(xué)研究目前還處于起步階段，其在牙周炎中的具體機制還有待研究完善。明確NET的作用途徑以及相應(yīng)的信號通路，并針對其可能機制對臨床作出指導(dǎo)，將為牙周炎的防治提供新思路。