NAC轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控竹筍木質(zhì)化

單雪萌 高志民

(國際竹藤中心 北京 100102)

原 文 出 處

隨著生活水平的提高，人類對木材的需求迅速增長，然而木材供應(yīng)卻在逐漸減少，因此需要尋找替代資源。與多數(shù)木材相比，竹類植物生長速度快、產(chǎn)量高，具有良好的韌性和較高的強度，竹材的開發(fā)利用可以有效緩解木材供應(yīng)緊張和木材數(shù)量不足的問題。次生細(xì)胞壁的形成和加厚在植物生長發(fā)育、木質(zhì)化及木材形成過程中發(fā)揮著重要作用。木質(zhì)化的次生細(xì)胞壁是最環(huán)保、最具成本效益的可再生資源，可以提高木質(zhì)纖維素的生物量。目前，植物次生細(xì)胞壁倍受關(guān)注，轉(zhuǎn)錄調(diào)控在次生細(xì)胞壁生物合成中起關(guān)鍵作用，許多研究揭示了次生細(xì)胞壁生物合成在分子水平上的調(diào)控，表明植物具有調(diào)節(jié)次生細(xì)胞壁生物合成的特定轉(zhuǎn)錄開關(guān)，例如許多轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控次生細(xì)胞壁成分(例如纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)的合成來參與次生細(xì)胞壁的形成。

NAC(NAM，ATAF和CUC)家族是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其成員在多種生物過程中發(fā)揮重要作用，包括衰老、激素信號傳導(dǎo)以及次生細(xì)胞壁的生物合成。在次生細(xì)胞壁的形成過程中，3個NAC轉(zhuǎn)錄因子(NST1、NST2和NST3/SND1)作為主要調(diào)節(jié)開關(guān)在纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3個組分的合成中發(fā)揮著重要功能。擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)中的NST1和NST2控制了花藥內(nèi)皮的次生壁增厚，同時許多其他NAC基因在次生細(xì)胞壁生物合成中也具有重要作用，例如與維管相關(guān)的NAC-DOMAIN1-7(VND1-VND7)，VND基因的過表達(dá)使得次生細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，從而增加了細(xì)胞壁的厚度。棉花(Gossypiumhirsutum)NAC基因GhFSN1作為正向調(diào)控因子參與次生細(xì)胞壁生物合成，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)棉花中與纖維相關(guān)的NAC基因和次生細(xì)胞壁生物合成的基因之間存在著共表達(dá)關(guān)系。在控制次生細(xì)胞壁生物合成的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，除NAC轉(zhuǎn)錄因子外，還有MYB轉(zhuǎn)錄因子和許多其他轉(zhuǎn)錄因子等成員。與次生細(xì)胞壁生物合成相關(guān)的NAC基因的功能在整個植物界都是相對保守的，然而NAC在竹子中的功能仍不清楚。

竹子是最重要的非木材森林資源之一，被認(rèn)為是新興的重要木質(zhì)纖維素生物質(zhì)能源。毛竹(Phyllostachysedulis)屬于禾本科竹亞科，與世界上大多數(shù)生態(tài)和經(jīng)濟(jì)竹種一樣可用于生產(chǎn)竹材、藝術(shù)品、紙張，筍還可以食用。毛竹生長速度快，可在一個半月達(dá)到20 m左右，其木質(zhì)化程度隨著筍高度的增加而持續(xù)增加。在毛竹筍快速生長過程中次生細(xì)胞壁變厚和木質(zhì)化，這對提高竹子的材性性能和應(yīng)用起著重要作用。在擬南芥、水稻、谷子(Setariaitalica)和棉花中已經(jīng)鑒定出許多與次生細(xì)胞壁合成相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，并且同源基因在不同物種之間具有不同的基因結(jié)構(gòu)和功能。但是關(guān)于毛竹中與次生細(xì)胞壁相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子研究很少。毛竹基因組草圖和基因組數(shù)據(jù)庫(BambooGDB)的完成有助于探索毛竹NAC基因的特定結(jié)構(gòu)和功能特征。本研究的目的是對毛竹中NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行全面了解，揭示NAC轉(zhuǎn)錄因子參與次生細(xì)胞壁生物合成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 毛竹NAC基因的鑒定

以模式植物擬南芥和水稻中NAC基因作為種子序列，利用植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫Plant TFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php)獲取NAC基因的同源序列，利用在線保守結(jié)構(gòu)域分析軟件逐一分析每條序列的保守結(jié)構(gòu)域，剔除保守結(jié)構(gòu)域不完整的序列，保留具有完整NAM結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并進(jìn)行下一步研究分析。

1.2 基因結(jié)構(gòu)、蛋白鑒定和序列分析

利用在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對獲得的蛋白的分子量和等電點等基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，使用Plant-mPLoc在線網(wǎng)站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，同時利用在線網(wǎng)站psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis)對毛竹中NAC基因的中miRNA的靶點進(jìn)行預(yù)測。使用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析NAC家族成員的基因結(jié)構(gòu)，運用在線軟件MEME(http://meme.nbcr.-net/meme/intro.html)對毛竹NAC的保守蛋白基序進(jìn)行分析。

1.3 進(jìn)化分析和功能預(yù)測

從網(wǎng)站TAIR(http://www.arabidopsis.org/)下載AtNACs序列，用于和PeNACs進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析。使用MEGA 6.0程序(http://www.megasoftware.net/mega.php)中的Clustal W進(jìn)行多序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)系統(tǒng)樹中PeNACs和已知功能的AtNACs的進(jìn)化關(guān)系預(yù)測毛竹中NAC的功能。

1.4 毛竹NAC基因的組織特異性表達(dá)分析

為了研究毛竹NAC基因的組織表達(dá)特異性，從NCBI Short Read Archive(SRA)下載毛竹葉、鞭、根、20 cm筍、50 cm筍、早花期花序和晚花期花序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲取其中NAC基因的RPKM值，用以表示基因的表達(dá)豐度。為方便統(tǒng)計，對每個表達(dá)數(shù)值取以2為底數(shù)的對數(shù)(Log2)，使用Matrix2png(http://www.chibi.ubc.ca/matrix2png/)繪制基因表達(dá)熱圖。

1.5 毛竹NAC基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和GO分析

使用BambooNET數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.cau.edu.cn/bamboo/)對參與次生細(xì)胞壁生物合成的PeNACs進(jìn)行共表達(dá)分析。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包括在不同發(fā)育階段的鞭、根、筍、葉鞘和芽。對于共表達(dá)列表中的候選基因，利用GO分析來揭示PeNACs在次生細(xì)胞壁生物合成中的作用，并通過TBtools進(jìn)行可視化。隨后的GO分析在同一平臺上進(jìn)行，p值和FDR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)分別低于0.01和0.05。另外，與PeNACs共表達(dá)的PeMYBs序列從PLAZA(https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)和BambooNET網(wǎng)站下載。

1.6 植物材料和cDNA合成

實驗用毛竹源自江西南昌(28°45′58″N、115°45′39″E，海拔約400.0 m)野外，選擇生長良好植株，分別采集不同生長階段竹筍(筍高1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 m)基部為樣品，每個樣品至少3次重復(fù)。樣品經(jīng)液氮處理后，存儲于-80 ℃冰箱中，用于提取RNA。另外，取相同樣品固定在FAA中保存于4 ℃冰箱，用于樹脂切片。

使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)對毛竹筍進(jìn)行總RNA提取。所有樣品至少進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)。重組DNA酶I(Takara，日本)用于去除每個樣品中殘留的DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA的完整性，并通過分光光度法測定總RNA的純度和濃度(Nanodrop 2000)。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國)合成第一鏈cDNA。使用前將cDNA產(chǎn)物稀釋5倍。

1.7 實時定量PCR分析

根據(jù)PeNACs與AtNACs之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，篩選出與次生細(xì)胞壁生物合成相關(guān)的PeNACs?；赑eNACs和正向共表達(dá)的PeMYBs的多重序列比對，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物。使用Roche LightCycler?480 SYBR Green 1 Master試劑盒(Roche，美國)在qTOWER2.2系統(tǒng)(Analytik Jena，德國)上進(jìn)行qRT-PCR實驗。反應(yīng)體系(10.0 μL)∶5.0 μL2× SYBR Green 1 Master，0.8 μL cDNA，0.2 μL正反向引物(10 μM)和4.0 μL ddH2O。使用2-ΔΔCT方法，以PeNTB作為內(nèi)參基因統(tǒng)計基因表達(dá)，qRT-PCR實驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 組織化學(xué)分析方法

將FAA固定液中的毛竹筍樣品進(jìn)行包埋處理，經(jīng)過不同濃度配比的聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)逐級脫水后，包埋于PEG 4000中，用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica RM2165)進(jìn)行切片，厚度為10 μm，用0.05%的甲苯胺藍(lán)(Toluidine Blue O, TBO)對展片的切片于80 ℃染色3 min，并拍照觀察。

1.9 毛竹NAC基因轉(zhuǎn)錄自激活活性分析

1.10 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析使用IBM SPSS軟件(版本21.0)，用3次生物學(xué)重復(fù)結(jié)果進(jìn)行均值和標(biāo)準(zhǔn)差分析。顯著性差異用*(P<0.05)和**(P<0.01)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PeNACs基因的鑒定與蛋白理化性質(zhì)分析

利用擬南芥和水稻同源基因序列，從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中經(jīng)BLAST分析，共鑒定獲得94個均具有完整保守結(jié)構(gòu)域的NAC家族成員，依次命名為PeNAC1～PeNAC94。通過ProtParam工具，對PeNACs編碼蛋白質(zhì)的長度、分子量及等電點等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，PeNACs的氨基酸長度為217～694 aa，對應(yīng)分子量為25201.17～76916.46 Da，理論等電點為4.55～10.85，亞細(xì)胞定位預(yù)測94個PeNACs均被定位在細(xì)胞核上。

2.2 PeNACs基因結(jié)構(gòu)及其編碼氨基酸的保守基序分析

基因結(jié)構(gòu)分析表明，94個PeNACs聚類在11個分支(S1-S11)，每個分支的成員數(shù)量為6～11個，內(nèi)含子數(shù)量為0～8個，其中含有2個內(nèi)含子的PeNACs數(shù)量最多有54個，含有3個內(nèi)含子的有14個，含有4個內(nèi)含子的有10個。在一個分支上的PeNACs具有相似的外顯子—內(nèi)含子基因結(jié)構(gòu)，每個分支內(nèi)含子的數(shù)量與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和分支的分類是一致的，例如S9分支中8個PeNACs均含有8個內(nèi)含子。然而也有些PeNACs例外，如聚類在S5分支的PeNAC79不含有內(nèi)含子。PeNACs的基因結(jié)構(gòu)差異明顯，具有多樣性，具體表現(xiàn)在內(nèi)含子的大小和位置存在較大差異。

利用MEME軟件對PeNACs基序進(jìn)行分析，共鑒定了8個保守基序，命名為Motif 1～Motif 8，大部分保守基序都位于NAC蛋白的N末端，表明了這些保守基序?qū)eNACs的功能是非常重要的。聚集在一個分支的PeNACs具有相似的基序組成，例如S10家族的成員主要包含6個基序(motif1、motif2、motif3、motif5、motif6、motif7)，S1家族的成員包含8個基序(motif1-motif8)，表明了相同家族的PeNACs可能有相似的功能。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了確定PeNACs與擬南芥的NAC蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，對毛竹和擬南芥的NAC氨基酸序列進(jìn)行了多重比對，并利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，NAC成員被分成16分支，毛竹PeNACs聚類在11個分支(C1-C10和C15)，每個分支包含1～18個成員，進(jìn)化樹結(jié)果表明了一些NAC在毛竹與擬南芥中進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系，例如AtNAC97和PeNAC55；AtNAC36、PeNAC51和PeNAC63。聚類在C1和C10家族的AtNACs與木質(zhì)素的沉積和次生細(xì)胞壁的合成相關(guān)，推測與之聚類的PeNACs可能具有相似的功能。

2.4 PeNACs基因編碼蛋白的功能預(yù)測

擬南芥中NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能已經(jīng)被證實，通過與AtNACs的比較可以預(yù)測PeNACs的功能。結(jié)果顯示，擬南芥與毛竹NAC成員共聚類在16個亞家族(C1—C16)，其中11個為毛竹與擬南芥所共有，5個為擬南芥所特有。有65個PeNACs聚類在6個具有功能注釋的亞家族，29個PeNACs聚類在5個功能未知的亞家族，這65個PeNACs聚類在5類功能中，第1類包含2個亞家族(C1和C10)，其主要通過木質(zhì)素的生物合成和沉積來調(diào)控次生細(xì)胞壁的合成；第2類、第3類和第4類都包含1個亞家族，第2類(C2)與序列特異性DNA結(jié)合有關(guān)；第3類(C4)在根尖分生組織的形成和器官邊界的建立中起著重要作用；第4類(C10)參與了植物調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)；第5類包含2個亞家族(C7和C8)，主要參與植物衰老和非生物脅迫，例如高鹽和干旱脅迫。這些結(jié)果表明了PeNACs功能的多樣性，并且可能在毛竹生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

2.5 PeNACs組織特異性分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對PeNACs在毛竹不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：94個PeNACs在毛竹不同組織和不同發(fā)育時期均有著不同程度的表達(dá)，然而表達(dá)豐度存在著明顯的差異。94個PeNACs均至少在2個組織中檢測到表達(dá)，63個PeNACs在所有的組織中均檢測到表達(dá)，表達(dá)豐度為0.028～961.932。一些PeNACs基因在一些特異的組織中具有高的表達(dá)量，例如S7、S8和S9家族的基因在葉片和花序中具有較高的表達(dá)量，但在其他4個組織中表達(dá)量較低，尤其在根中表達(dá)量最低。同時，12個PeNACs(S1家族的PeNAC20、PeNAC40和PeNAC84；S3家族的PeNAC41和PeNAC60；S5家族的PeNAC71；S7家族的PeNAC6、PeNAC24和PeNAC34；S8家族的PeNAC70和PeNAC78以及S11家族的PeNAC2)幾乎在所有檢測到的組織中均有較高的表達(dá)量，S3家族的基因具有較高的表達(dá)量，但是S6家族的基因在7個組織中的表達(dá)量較低。

2.6 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

通過毛竹共表達(dá)網(wǎng)站，基于78個組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對C1和C9亞家族中15個與次生細(xì)胞壁合成相關(guān)的PeNACs構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，分別鑒定出與之共表達(dá)基因236個和160個。根據(jù)GO分析顯示，共表達(dá)基因的功能和相關(guān)的生物途徑主要富集在木質(zhì)素分解代謝和纖維素合成這2個與次生細(xì)胞壁合成相關(guān)的生物過程，同時C1亞家族的共表達(dá)基因與次生細(xì)胞壁合成關(guān)系更加密切，說明這些基因可能參與次生細(xì)胞壁的合成途徑。通過對共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，能夠預(yù)測NAC轉(zhuǎn)錄因子可能與其它基因共同協(xié)調(diào)來參與毛竹次生細(xì)胞壁的合成。此外，7個PeMYBs基因與7個PeNACs基因呈現(xiàn)正向共表達(dá)關(guān)系，這些PeMYBs的上游2.0 kb啟動子均含有NAC的結(jié)合元件(SNBE)，SNBE由(T/A)NN(C/T)(T/C/G)TNNNNNNNA(A/C)GN(A/C/T)(A/T)組成，為19 bp的不完全回文序列，由此表明，這些PeNACs能夠通過結(jié)合PeMYBs啟動子中的SNBE元件來調(diào)控PeMYBs的表達(dá)。

2.7 PeNACs中miRNA靶點預(yù)測

據(jù)報道，許多miRNA能夠參與次生細(xì)胞壁的生物合成，miRNA能夠通過與相應(yīng)的miRNA配對來切割靶基因，起到負(fù)調(diào)控的作用。用在線網(wǎng)站psRNATarget預(yù)測PeNACs中miRNA的靶點，由于水稻與毛竹親緣關(guān)系較近，使用水稻miRNA文庫作為參考對調(diào)控PeNACs的miRNA進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在94個PeNACs中共預(yù)測出315種miRNA，具有563個miRNA靶點，其中miRNA類型最多的是PeNAC5(91個)，類型最少的是PeNAC25(3個)。另外，每個基因可能受到多種miRNA的調(diào)控，而一些PeNACs含有相同的miRNA靶點，例如16個PeNACs具有miR164靶點，11個PeNACs具有miR397靶點。15個與次生細(xì)胞壁合成相關(guān)的PeNACs中有3個(PeNAC36、PeNAC42和PeNAC45)是miR164的靶基因。由此表明，并不是所有具有相似功能的基因都由相同的miRNA調(diào)控，而相同的miRNA也可以調(diào)控具有不同功能的多個基因。

2.8 不同高度筍中PeNACs的表達(dá)模式分析

為了解15個與次生細(xì)胞壁相關(guān)的PeNACs的功能，以NTB基因作為內(nèi)參基因，對PeNACs在不同高度筍中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示15個PeNACs在不同毛竹筍生長高度中均呈現(xiàn)差異表達(dá)，且隨著筍高度的增加，除了PeNAC37的表達(dá)持續(xù)上調(diào)外，其它基因均不同程度地先上升再下降。相比于1.0 m高筍中的表達(dá)量，PeNAC37在8.0 m高筍中的表達(dá)量上升了1 000倍。同時PeNACs具有不同的表達(dá)模式，PeNAC3、PeNAC32、PeNAC45、PeNAC56和PeNAC85等5個基因在4.0 m高的筍中表達(dá)量達(dá)到最高值；PeNAC1、PeNAC8、PeNAC36、PeNAC42、PeNAC73、PeNAC76、PeNAC81和PeNAC94等8個基因在6.0 m高的筍中達(dá)到最大的表達(dá)量；而PeNAC11在2.0 m高的筍中達(dá)到了表達(dá)量最大。除PeNAC11外，其它PeNACs達(dá)到最高基因表達(dá)量均超過1.0 m高筍中表達(dá)量的2倍，而PeNAC94最高表達(dá)為1.0 m高筍中的12 565倍。同時，這些基因達(dá)到最大值后下降程度有著一定的差異，9個PeNACs(PeNAC1、PeNAC3、PeNAC8、PeNAC32、PeNAC73、PeNAC76、PeNAC81、PeNAC85和PeNAC94)的表達(dá)有一個明顯的下降(超過最大值的70%)，5個PeNACs(PeNAC11、PeNAC36、PeNAC42、PeNAC45和PeNAC56)僅下降了約20%，而且3個PeNACs(PeNAC36、PeNAC42和PeNAC45)上調(diào)的表達(dá)模式與miR164的表達(dá)模式恰好相反，表明miR164可能在毛竹筍生長發(fā)育過程中參與PeNACs的表達(dá)調(diào)控。此外，qRT-PCR結(jié)果顯示PeMYBs與其共表達(dá)的PeNACs具有相似的表達(dá)趨勢。另外，毛竹筍木質(zhì)化程度隨著筍高度的增加而逐漸上升，組織化學(xué)分析進(jìn)一步證實了這一點。隨著毛竹筍高度的增加，維管束的染色加深區(qū)域明顯逐漸擴(kuò)大，說明其木質(zhì)化逐漸增強。

2.9 轉(zhuǎn)錄自激活活性分析

對與次生細(xì)胞壁合成相關(guān)的PeNAC8、PeNAC36和PeNAC73基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄自激活活性分析，結(jié)果顯示，所有含有目的基因質(zhì)粒的酵母細(xì)胞均能在SD/-Trp單缺平板上生長并出現(xiàn)可見的白色菌落，在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal選擇培養(yǎng)基上只有陽性對照和含有目的基因質(zhì)粒酵母細(xì)胞能夠生長，并且變藍(lán)色；相反陰性對照不能夠生長。由此表明，PeNAC8、PeNAC36和PeNAC73均具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。

3 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子在許多生物過程中發(fā)揮著重要的作用，例如莖頂端分生組織的形成和維持、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化以及次生細(xì)胞壁的合成，然而毛竹中NAC家族基因并沒有詳細(xì)的研究，尤其是其成員在次生細(xì)胞壁形成和沉積過程中的作用尚未見報道。本研究通過對毛竹中NAC家族的基因結(jié)構(gòu)、保守基序、進(jìn)化關(guān)系、組織學(xué)分析、組織特異性表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄活性等方面的研究，探討其中NAC轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。

3.1 PeNACs保守性和多樣性

根據(jù)BLAST和Clustal W，所有的NAC都包含NAM結(jié)構(gòu)域。NAC家族成員的數(shù)量在不同的物種中存在一定的差異，毛竹中共鑒定出94個PeNACs，比擬南芥、水稻和煙草中的數(shù)量都少。在NAC基因家族中，基因長度、預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量和蛋白質(zhì)等電點之間差異很大，但基因結(jié)構(gòu)是相對保守的。同一家族中的NAC成員可能具有相似的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和位置，表明這些成員親緣關(guān)系較近并且可能具有相似的功能，這與先前的研究是一致的。然而，同一家族中的成員之間存在一些差異，例如外顯子的大小、相對位置和數(shù)量，例如S11家族中的PeNAC81具有5個外顯子，而其他家族成員具有3～4個外顯子，而且其長度明顯長于其他成員，這一結(jié)果可以通過進(jìn)化過程中基因片段的剪接或插入從而產(chǎn)生新的基因功能來解釋。另外，基序檢測證實了同一家族中的大多數(shù)NAC蛋白具有相同的基序，這證明這些蛋白具有保守的功能，這與次生細(xì)胞壁相關(guān)NAC的功能可能在整個植物界中是保守的觀點是一致的。

3.2 同源基因具有相似的功能

先前的研究表明，毛竹和水稻具有較近的進(jìn)化關(guān)系，但是水稻中的大多數(shù)NAC基因尚未得到功能驗證，擬南芥中的NAC基因功能已經(jīng)得到了很好的研究，因此根據(jù)擬南芥的功能可以預(yù)測PeNACs的功能。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，毛竹和擬南芥共聚集成16個分支，根據(jù)與擬南芥NAC的同源性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示在一個分支中的PeNACs的功能具有多樣性，例如C4分支的AtNAC31、AtNAC92和AtNAC98不僅與植物衰老和頂端分生組織形成有關(guān)，而且與器官邊界的建立有關(guān)。另外，具有相似功能的PeNACs不一定聚類在一個分支，例如與次生細(xì)胞壁形成和木質(zhì)化合成相關(guān)的PeNACs分別聚類在C1和C10，也有一些分支由于擬南芥中相關(guān)功能沒有研究而沒有功能注釋，這些分支功能需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。

3.3 PeNACs基因表達(dá)模式的多樣性

基因的表達(dá)是生物學(xué)功能的重要表現(xiàn)形式之一。為了進(jìn)一步驗證PeNACs的組織特異性表達(dá)，利用毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，S3家族的成員在7個組織中均具有較高的表達(dá)量，表明它們在毛竹生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用；相反，S6家族的成員在7個組織中表達(dá)量均較低，可能因為它們在其他未檢測到的組織中發(fā)揮著功能；一些PeNACs在葉片和花序中檢測到較高的表達(dá)量，但在20 cm和50 cm高早期的毛竹筍中的表達(dá)量較低，說明它們可能主要參與細(xì)胞的分化和伸長而不是木質(zhì)化的過程。與次生細(xì)胞壁合成相關(guān)的15個PeNACs在不同高度筍中的表達(dá)表明，與1.0 m高筍中相比，它們具有相似的表達(dá)變化，進(jìn)一步證明它們在調(diào)控次生細(xì)胞壁合成過程中的保守性，這與前人的研究是一致的，同時組織化學(xué)結(jié)果也支持了隨著筍高度增加，木質(zhì)化程度加深，基因表達(dá)上調(diào)的結(jié)論。

3.4 次生細(xì)胞壁生物合成的復(fù)雜性

研究表明，植物具有調(diào)節(jié)次生細(xì)胞壁生物合成的特定轉(zhuǎn)錄開關(guān)，這些開關(guān)主要是NAC和MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，NAC轉(zhuǎn)錄因子是第一層次的主要開關(guān)。本研究中，綜合表達(dá)分析表明15個與次生細(xì)胞壁合成相關(guān)的PeNACs都隨著筍高的增加而上調(diào)，其中PeNAC37是唯一具有持續(xù)增加的表達(dá)趨勢的基因，其他14個PeNACs的表達(dá)量在達(dá)到峰值之后開始下降，而且不同PeNACs達(dá)到峰值時毛竹筍的高度是不同的，表明它們在時間和空間上的功能可能是不同的。miR164的表達(dá)趨勢與和次生細(xì)胞壁合成和木質(zhì)素合成相關(guān)的3個PeNACs的表達(dá)趨勢相反，這與miRNA及其靶基因之間具有負(fù)向共表達(dá)是一致的，表明在毛竹次生細(xì)胞壁合成過程中可能存在一個miRNA-NAC調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

另有一些研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子作為次生細(xì)胞壁合成過程中的第2層調(diào)控開關(guān)，基于NAC-MYB調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)對參與次生細(xì)胞壁合成的下游結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控。本研究中，在7個PeMYBs啟動子中含有NAC結(jié)合元件，這些PeMYBs與7個PeNACs呈現(xiàn)正向共表達(dá)，并且它們在不同高度的毛竹筍中具有與共表達(dá)的PeNACs相似的表達(dá)模式，這表明PeNACs可能正向調(diào)控PeMYBs的表達(dá)，這與先前的研究是一致的。而且PeMYB3與AtMYB46和AtMYB83同源，這表明在次生細(xì)胞壁合成過程中，PeMYB3作為第二層調(diào)控開關(guān)，與AtMYB46和AtMYB83功能是相似的。這些結(jié)果表明，在次生細(xì)胞壁的合成中NAC-MYB的調(diào)控是一個漸進(jìn)的調(diào)控過程。此外，在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中共預(yù)測出396個與15個PeNACs共表達(dá)的基因，這表明毛竹次生細(xì)胞壁生物合成過程中可能涉及轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)構(gòu)基因和miRNA等復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。但要揭示該網(wǎng)絡(luò)對竹材材性的調(diào)控機(jī)制仍需大量的研究工作。

4 結(jié)論

竹子是很好的木材替代品。NAC轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)次生細(xì)胞壁的生物合成和木質(zhì)化沉積，從而影響竹材材性，因此研究竹子NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能對揭示竹材形成機(jī)制具有重要意義。在毛竹中有94個PeNACs，其表達(dá)模式具有多樣性，其中15個PeNACs的表達(dá)量隨著筍高度的增加均明顯上調(diào)，這與竹筍木質(zhì)化程度加深相一致。本研究對深入研究PeNACs參與次生細(xì)胞壁生物合成調(diào)控，解析其在竹材形成中的生物學(xué)功能具有重要價值。