徐帥，郝琴，陳宏波，向陽*

（1.湖南省汨羅市食品藥品檢驗所，湖南岳陽 414400；2.湖南理工學(xué)院，湖南岳陽 414006）

隨著生物研究的深入，人類和各種動植物基因組序列被預(yù)測出來，致使更多的基因信息被釋放出來，基因功能的研究也就越來越重要[1]。現(xiàn)如今男子精子的數(shù)量和質(zhì)量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，導(dǎo)致不育的情況多樣且復(fù)雜，生殖相關(guān)基因的突變引起的男性生殖功能障礙是目前研究的熱點問題之一[2]。在睪丸中表達的基因眾多，依然有許多未知基因參與精子發(fā)生的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)和研究睪丸特異性基因是一項重要的研究工作[3]。研究表明含LRR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)主要在各種細胞的信號傳遞、RNA加工、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面起作用[4-5]，因此本研究通過生物信息學(xué)方法將克隆重疊群中的EST序列經(jīng)修正和拼接后得到一個新的睪丸表達基因LRRC34，通過基因克隆技術(shù)進一步對這個新基因進行研究分析，確認(rèn)該基因是否參與精子發(fā)生的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

多只成年KM小白鼠，總RNA抽提試劑盒購自于Omega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于Fermentas公司；PCR擴增試劑盒購自于Thermo Scientific公司；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒、Solution I連接試劑盒、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體和DNA鏈接試劑盒均購自TaKaRa公司；電泳試劑、Trizol、LB培養(yǎng)基試劑、DEPC等試劑和普通Taq DNA聚合酶均購自于上海生物工程公司；SUPERSCRIPTTMⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶購自于GIBCO BRL公司；50×Advantage 2高保真DNA聚合酶購自于Promega公司；dNTP mix、DNase I均購自于 MBI公司；氨芐青霉素Amp和卡那霉素Kan、CaCl2均購自于BIOSHARP公司進口分裝；瓊脂糖和染色劑EB均購自于BIOWEST 公司；DL3000 DNA Marker為北京天根生化科技公司產(chǎn)品；E.coli Top10為大腸桿菌細胞株系，為本實驗室分離純化后而保存的菌株。RT-PCR中陽性對照GAPDH引物與小鼠LRRC34克隆引物均委托上海生工生物工程股份有限公司合成[6-7]。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站找到多個EST序列片段，通過拼接技術(shù)獲得一個新基因，再利用Translate軟件把核酸序列翻譯成蛋白質(zhì)序列，再采用NCBI中的ORF finder進行閱讀框架的識別并用RT-PCR對該閱讀框架進行驗證；采用NCBI中的BLAST進行核酸和蛋白質(zhì)序列相似性比對；應(yīng)用NCBI中的Map View軟件進行染色體定位；采用Webcutter 2.0軟件進行酶切位點分析，并設(shè)計出構(gòu)建表達載體的引物；采用GENESCAN和FGENEH等基因預(yù)測軟件進行內(nèi)含子和外顯子分析；采用ExPASy服務(wù)器中的ProtParam tool和TMpred軟件分別進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、跨膜區(qū)和疏水性分析；利用ExPASy中的SignalP V1.1進行信號肽序列分析[7]。

2.2.2 小鼠多組織總RNA抽提

采用Trizol法提取總RNA：扯尾壓頸法快速處死成年雄性和雌性小白鼠各一只[8]；解剖小白鼠，分別取睪丸、附睪、腎臟、大腦、小腦、心臟、肺、肝、大腸、小腸、尾巴、耳朵等組織并用Trizol法提取各組織的總RNA。提出各組織總RNA后再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈接。

1.2.2 RT-PCR擴增LRRC34新基因全長

根據(jù)拼接后得到的小鼠LRRC34基因cDNA序列在閱讀框兩側(cè)設(shè)計引物對，其上游引物可設(shè)計為LRRC34-F：5'z-GGCGGCCTTCCTCTTTAGA-3'； 其 下游引物可設(shè)計為LRRC34-R：5'-TTCTGTGGCTTGTTTCAGGG-3'；擴 增 產(chǎn) 物 大 小 為 1 557 bp。 同 時 管家基因GAPDH設(shè)計的上游引物GAPDH-F：5'-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3'；設(shè)計的下游引物為GAPDH-R：5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'；擴增產(chǎn)物大小為499 bp，用來做RT-PCR陽性對照。

以Trizol法提取的大鼠多組織mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，分別用GAPDH和LRRC34的引物作為引物進行RT-PCR擴增。以睪丸cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，在10 μL的體系中加入以下物質(zhì)：ddH2O7.1 μL，10×buffer（無 Mg2+、KCl）1.0 μL，dNTP Mix（10 mmoL/L）0.5 μL，Primer LRRC34-F 0.2 μL，Primer LRRC34-R 0.2 μL，睪丸 cDNA 第一鏈（模板）0.8 μL，Mg2+0.7 μL，Taq DNA 聚 合 酶 0.2 μL。 在 2720型 PCR 儀（Applied Biosystems公司，美國）完成PCR擴增，經(jīng)過多次PCR摸索，反應(yīng)條件如下：先95 ℃預(yù)變性3 min；再95 ℃變性 30 s，62 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，完成 35 個循環(huán)；最后 72 ℃延伸 10 min，置于 4 ℃保溫。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA第一鏈效果并分析。其次再用高保真DNA聚合酶進行LRRC34基因的高保真PCR擴增。將高保真PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T Vector Kit載體上，轉(zhuǎn)化到E.coliTop10 大腸桿菌，將陽性克隆菌液發(fā)送到上海生工生物工程股份有限公司測序分析[6-7]。

1.2.4 多組織RT-PCR

以小鼠睪丸、腎臟、附睪、大腦、小腦、心臟、肺、肝、大腸、小腸、尾巴和耳朵等多組織mRNA為模板利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成多組織cDNA第一鏈，然后用多組織cDNA第一鏈為模板進行多組織RT-PCR，反應(yīng)體系和實驗方法與1.2.3相同，得到的克隆產(chǎn)物再用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因LRRC34在小鼠不同組織中的表達水平[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

經(jīng)生物信息學(xué)分析，LRRC34基因定位于小鼠3號染色體，并且含有11個外顯子，10個內(nèi)含子。該基因的cDNA全長序列為1 840 bp，其中開放閱讀框為1 248 bp，編碼了一個含有415個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。在161～163核苷酸位置有一個起始密碼子ATG，在1 406～1408核苷酸位置有一個終止密碼子TAA。ORF起始處序列為tcgATGg，符合Kozak規(guī)則，在序列的3'端則有一個加尾信號AATAAA，內(nèi)含子與外顯子界限的劃分符合典型的GT/AG規(guī)則。

2.2 小鼠多組織RT-PCR擴增

如圖1示，利用管家基因GAPDH的引物和多組織cDNA第一鏈接為模板進行PCR擴增來檢測cDNA第一鏈的效果。克隆產(chǎn)物片段長度約為500 bp，與管家基因GAPDH預(yù)期片段長度499 bp基本相符，說明用小鼠多組織mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈非常成功，其中睪丸組織cDNA可以直接作為擴增LRRC34基因的模板，而其他cDNA第一鏈也可以做不同組織的表達差異的PCR反應(yīng)模板。

圖1 RT-PCR檢測小鼠多組織cDNA第一鏈

2.3 克隆LRRC34基因

通過改變退火溫度進行最佳條件的探索，得到該基因的最佳退火溫度為62 ℃，在最佳PCR克隆條件下對LRRC34基因進行PCR擴增（如圖2示）。從圖2中可看到，小鼠睪丸組織擴增出特異性產(chǎn)物，且基因片段長度在 1 000～2 000 bp 之間，這與 LRRC34基因預(yù)期片段長度1 557 bp大體相符，說明該基因確實在小鼠睪丸組織中有表達，LRRC34基因被成功地擴增。將克隆產(chǎn)物連接到pMD18-T Vector Kit載體上，經(jīng)測序，結(jié)果與序列完全一致，說明拼接序列是正確的。然后將含有LRRC34基因T載體的E.coli Top10菌液培養(yǎng)，抽質(zhì)粒保存在超低溫冰箱用于做后續(xù)實驗。

圖2 小鼠睪丸組織克隆LRRC34基因

2.4 基因LRRC34在小鼠不同組織中的表達水平

以逆轉(zhuǎn)錄合成的小鼠多組織cDNA第一鏈為模板，用LRRC34的設(shè)計的引物作為引物，使用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增LRRC34基因（如圖3示）。從圖3可看到，LRRC34基因僅在小鼠睪丸組織中有表達，而在小鼠其他組織中均不表達，從這一點說明LRRC34基因具有組織特異性，故而可以推斷LRRC34基因是睪丸特異表達基因。

圖3 基因LRRC34在小鼠不同組織中的表達水平

3 討論

近年來，男性生殖域基因功能的研究是男性科學(xué)研究的熱門領(lǐng)域之一[2]。而研究精子發(fā)生機制與發(fā)現(xiàn)特異性睪丸表達新基因也是研究的重點。由于人類基因圖譜已經(jīng)出來，而人類基因大約在3萬～4萬個，且并不是每個基因都在人體表達[9]，如果要研究生殖域基因功能，可以通過生物信息學(xué)方法將該克隆重疊群中的EST序列經(jīng)BLAST修正后進行拼接獲得一個新的未知序列，尋找新的組織特異性EST，從而可以找到生殖域表達的特異新基因，為科研工作提供一種簡單便利的新方法[10-11]。

本研究根據(jù)獲得的序列設(shè)計引物對，以大鼠睪丸組織cDNA文庫為模板進行擴增，克隆出了一個新基因LRRC34，基因產(chǎn)物為睪丸生精細胞凋亡相關(guān)蛋白。綜合運用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST和Expasy中的TMpred、Protparam tool等軟件較全面地分析了該基因的生物信息：LRRC34基因的cDNA全長序列為1 840 bp，其中開放閱讀框為 1 248 bp，編碼了一個含有415個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)；將LRRC34基因cDNA序列與小鼠基因組序列比較，發(fā)現(xiàn)該基因定位于大鼠3號染色體，并且含有11個外顯子，10個內(nèi)含子。LRRC34基因在大鼠多組織中的RT-PCR結(jié)果顯示：該基因僅在正常成年雄鼠睪丸組織中特異性高表達，而在小鼠其他組織中均無明顯表達。說明LRRC34基因具有組織特異性，故而可以推斷LRRC34基因是睪丸特異表達基因，該基因與生殖及精子發(fā)生有關(guān)，其可能在睪丸發(fā)育和精子形成的過程中起重要作用。生物信息分析表明LRRC34基因與人類同源基因相似性達78%，因此可以通過對小鼠LRRC34基因的研究來初步預(yù)測人的部分性狀，為人類雄性精子發(fā)生的分子機制和生精細胞凋亡的生理機制的研究提供理論依據(jù)，同時對相關(guān)疾病的診斷、治療也具有十分重要的現(xiàn)實意義。

本研究中所克隆的基因LRRC34只在小鼠睪丸組織特異性表達，其極可能與小鼠生精細胞凋亡密切相關(guān)，雖然要弄清LRRC34基因與生精細胞凋亡的關(guān)系還有待于進一步的實驗研究，但這些結(jié)果為后續(xù)研究生殖領(lǐng)域新基因生精細胞凋亡的分子機制提供了新思路，展示了新途徑。