陳憶鈴，馮 芳,2

(1 中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 南京 210009；2 藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

基因毒性雜質(zhì)是指能直接或間接作用于DNA，從而引起基因突變、染色體斷裂或染色體重組的一類雜質(zhì)，即使暴露于低水平劑量也可能誘發(fā)癌癥?；蚨拘噪s質(zhì)可能作為藥物合成過程中的起始原料、反應(yīng)物、催化劑、試劑、溶劑、中間體、副產(chǎn)物或貯藏運(yùn)輸過程中的降解產(chǎn)物而被引入到終產(chǎn)物中，影響藥品的質(zhì)量，危害患者的身心健康。2006年，EMEA頒布了基因毒性雜質(zhì)限度指南，引入了毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)的概念，推薦TTC為1.5 μg/d，具體含義指一個(gè)人終生(70歲)每天攝入1.5 μg基因毒性雜質(zhì)，其患癌的風(fēng)險(xiǎn)低于十萬分之一，對(duì)絕大多數(shù)藥物來說是可接受的風(fēng)險(xiǎn)?；蚨拘噪s質(zhì)可接受限度(μg/g)=TTC限度(μg/d)/藥物最大日劑量(g/d)[1]?；蚨拘噪s質(zhì)反應(yīng)活性高、穩(wěn)定性差，這使得藥物中此類痕量雜質(zhì)的分析極具挑戰(zhàn)性，要求分析方法具有較高的靈敏度和特異性。氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了氣相色譜的高分離效能以及質(zhì)譜檢測(cè)器的高選擇性高靈敏度，目前已被廣泛應(yīng)用于基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)，本文主要介紹了氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在鹵代烷烴、磺酸酯、環(huán)氧化物、芳香胺以及肼類化合物等5類常見基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和樣本前處理方法的結(jié)合

當(dāng)樣品熱穩(wěn)定性較差，嚴(yán)重污染進(jìn)樣口，或在進(jìn)樣口與溶劑反應(yīng)生成待測(cè)物時(shí)，不適于直接進(jìn)樣。此時(shí)，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)需與樣本前處理方法結(jié)合，根據(jù)樣本和待測(cè)物的性質(zhì)選擇不同的前處理方法進(jìn)行樣本中基因毒性雜質(zhì)的分離檢測(cè)。可采用合適的萃取技術(shù)如液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、液液微萃取(LLE)等對(duì)待測(cè)物進(jìn)行提取、分離、富集和濃縮，減少基質(zhì)干擾的同時(shí)提高了檢測(cè)的靈敏度。此外，還可以通過選擇合適的衍生化試劑改善待測(cè)物的揮發(fā)性或熱穩(wěn)定性，進(jìn)而提高分離檢測(cè)效果。

2 氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 鹵代烷烴

鹵代烷烴常作為藥物合成中的試劑或由鹽酸與醇類試劑的副反應(yīng)產(chǎn)生。它能夠直接與遺傳物質(zhì)DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)，是最常見的一類基因毒性雜質(zhì)。鹵代烷烴種類繁多，理化性質(zhì)差異較大，需要根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)建立相應(yīng)的檢測(cè)方法進(jìn)行控制。

鄭等[2]以N,N-二甲基甲酰胺為溶劑，采用直接進(jìn)樣GC-MS法測(cè)定鹽酸右美托咪定中氯甲烷和氯乙烷，LOD可達(dá)50 ng/mL；Mamilla等[3]以甲醇為溶劑，采用直接進(jìn)樣GC-MS法測(cè)定阿替洛爾中氯丙烯，1,3-二氯-2-丙醇和2,3-二氯-1-丙醇，LOD可達(dá)50 ng/mL；Gooty等[4]采用二氯甲烷液液萃取GC-MS法在選擇離子監(jiān)測(cè)模式下(SIM)定量測(cè)定福多司汀中的3-氯-1-丙醇、1,3-二氯丙烷，一定程度上降低了基質(zhì)干擾，該方法靈敏準(zhǔn)確，3-氯-1-丙醇和1,3-二氯丙烷的LOD分別可達(dá)0.08 μg/mL和0.05 μg/mL；García等[5]采用強(qiáng)陰離子交換器固相萃取GC-MS法測(cè)定氯芐哌醚聯(lián)苯酰苯酸鹽原料藥中的2-氯乙烷，固相萃取技術(shù)有效地實(shí)現(xiàn)了樣本凈化，該方法專屬強(qiáng)，LOD可達(dá)100 μg/L；Reddy等[6]以水/N-甲基-2-吡咯烷酮(80:20)為溶劑，采用HS-GC-MS法測(cè)定雙丙戊酸鈉中的溴甲烷、溴乙烷、溴丙烷、2-溴丙烷及溴丁烷，LOD均可達(dá)2.5 ng/mL；葉等[7]以水為溶劑，采用HS-GC-MS法測(cè)定富馬酸替諾福韋二吡呋酯中的溴乙烷，同時(shí)采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)一步提高了檢測(cè)的選擇性和靈敏度，LOD可達(dá)14.74 ng/mL；Harigaya等[8]用N,O-雙(三甲基硅基)三乙酰胺(BSTFA)為衍生化試劑，3-氯-1-丙醇為內(nèi)標(biāo)，采用直接進(jìn)樣GC-MS法測(cè)定某原料藥中的4-氯-1-正丁醇，該方法靈敏度高，準(zhǔn)確度好，LOD可達(dá)0.125 ng/mL。

2.2 磺酸酯

磺酸常作為反離子試劑用于堿性藥物的成鹽反應(yīng)以提高藥物的穩(wěn)定性、溶解度和生物利用度?；撬猁}類藥物合成過程中任何殘留醇的存在均可能導(dǎo)致磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的形成，需要采用合適的分析方法對(duì)原料藥或藥品中可能存在、或未在早期合成過程中清除的磺酸酯進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

Ramakrishna等[9]以正己烷為溶劑，采用直接進(jìn)樣GC-MS法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，LOQ和LOD分別為1.0 μg/mL和0.3 μg/mL。Zhang等[10]以水飽和正己烷為溶劑，采用全掃描模式對(duì)甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯進(jìn)行定性分析確定峰位，隨后采用提取離子模式(EIC)定量測(cè)定甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，LOQ和LOD分別為5 ng/mL和1 ng/mL，該方法使用水飽和正己烷，水分的引入，可導(dǎo)致色譜柱固定液流失，柱效下降，這可能是待測(cè)物峰形拖尾的原因。樣本未經(jīng)前處理直接進(jìn)樣會(huì)導(dǎo)致樣本基質(zhì)在進(jìn)樣口大量沉積，污染進(jìn)樣口，重現(xiàn)性較差。采用萃取技術(shù)可在一定程度上降低共存物質(zhì)的干擾。Wollein等[11]以正己烷為萃取劑提取固體制劑粉末中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯、甲磺酸正丁酯、苯磺酸乙酯和對(duì)甲苯磺酸甲酯，該方法靈敏度高，各待測(cè)物L(fēng)OD均可達(dá)5 ng/mL，但在運(yùn)用該方法時(shí)需注意可能產(chǎn)生的殘留效應(yīng)。Liu等[12]采用乙酸乙酯液液萃取-GC-MS/MS法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼中的九種磺酸烷基酯類基因毒性雜質(zhì)，采用MRM模式降低了基質(zhì)干擾同時(shí)提高了檢測(cè)的靈敏度、專屬性，各待測(cè)物L(fēng)OQ均小于0.95 ng/mL；Colon等[13]分別采用固相萃取法(SPE)、固相微萃取法(SPME)、液相微萃取法(LPME)結(jié)合GC-MS對(duì)不同原料藥中限度為50 mg/kg的7種磺酸烷基酯進(jìn)行檢測(cè)，相比于液液萃取，微萃取所使用的有機(jī)溶劑較少且不易發(fā)生乳化，降低樣本基質(zhì)干擾的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的富集，有利于提高檢測(cè)的靈敏度。為防止直接進(jìn)樣導(dǎo)致磺酸烷基酯在進(jìn)樣口發(fā)生熱降解，或原料藥中殘留的甲磺酸和磺酸鹽原料藥本身在進(jìn)樣口與醇類溶劑發(fā)生酯化反應(yīng)從而造成假陽性結(jié)果的可能，可采用衍生化技術(shù)提高磺酸烷基酯的穩(wěn)定性，同時(shí)降低基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)專屬性。Lee等[14]以硫氰酸鹽為衍生化試劑，采用HS-GC-MS同時(shí)測(cè)定樣本中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯和硫酸二甲酯，各待測(cè)物的LOD均可達(dá)50 ng/mL，與HS-GC-FID相比靈敏度有很大的提高。Alzaga等[15]以五氟苯硫酚為衍生化試劑，采用HS-GC-MS法測(cè)定原料藥或中間體中的磺酸烷基酯及烷基硫酸酯，該方法的準(zhǔn)確度受到不同基質(zhì)的干擾，回收率變化較大，因此需采用氘代內(nèi)標(biāo)彌補(bǔ)這一不足。EP 9.0通則2.5.38、2.5.40、2.5.41中，均以碘化鈉為衍生化試劑，采用HS-GC-MS 法測(cè)定原料藥中的甲磺酸烷基酯、苯磺酸烷基酯及對(duì)甲苯磺酸烷基酯，是一種高專屬性、高靈敏的通用檢測(cè)方法。王等[16]借鑒該方法測(cè)定了SIPI5357 甲磺酸鹽中3種甲磺酸酯，LOD均小于0.375 ng/mL。

2.3 環(huán)氧化物

環(huán)氧化物是重要的有機(jī)中間體，被廣泛應(yīng)用于藥物合成領(lǐng)域。環(huán)氧化物的親電子碳原子能與DNA親核中心反應(yīng)，形成烷基化物，藥物合成過程中的環(huán)氧化物類基因毒性雜質(zhì)已成為重要關(guān)注和控制內(nèi)容，但環(huán)氧化合物在高溫下易分解的性質(zhì)給分析方法的建立帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

Loda等[17]以甲醇為溶劑，采用直接進(jìn)樣GC-MS法測(cè)定某一原料藥中的環(huán)氧氯丙烷，相比于GC-ECD，該法專屬性更強(qiáng)，靈敏度更高，可以實(shí)現(xiàn)原料藥中限度為8 mg/kg的環(huán)氧氯丙烷的檢測(cè)；Chen等[18]采用直接進(jìn)樣GC-MS法檢測(cè)藥物中微量的高沸點(diǎn)環(huán)氧化物，通過優(yōu)化進(jìn)樣口溫度降低了基質(zhì)干擾，提高了SIM的信號(hào)響應(yīng)。劉等[19]采用二氯甲烷液液萃取GC-MS法檢測(cè)不同水源中的環(huán)氧氯丙烷，該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度和準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好；Sadao等[20]采用固相微萃取技術(shù)提取水中的環(huán)氧氯丙烷，運(yùn)用GC-MS進(jìn)行分析，LOQ可達(dá)40 ng/L；劉等[21]以正己烷為萃取溶劑，采用液相微萃取技術(shù)富集茶葉紙袋中殘留的環(huán)氧氯丙烷，并以GC-MS進(jìn)行檢測(cè)，方法的定量檢出限為0.18 μg/mL。以上三種萃取技術(shù)均可為藥品中環(huán)氧化物雜質(zhì)檢測(cè)提供參考。Karthikeyan等[22]采用HS-GC-FID測(cè)定鹽酸司維拉姆中的環(huán)氧氯丙烷，同時(shí)采用HS-GC-MS法進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的專屬性和特異性；Sung等[23]以環(huán)戊酮和硼三氟二乙醚為衍生劑，采用GC/MS-SIM模式對(duì)衍生化產(chǎn)物進(jìn)行了分析，為準(zhǔn)確測(cè)定環(huán)氧乙烷的含量，采用1,2-環(huán)氧乙烷為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果表明，該方法比現(xiàn)行的CEN法測(cè)定食品接觸材料中環(huán)氧乙烷的殘留量更為簡(jiǎn)便有效。

2.4 芳香胺

芳香胺類化合物是藥物合成過程中常用的原料，其本身無毒，但其經(jīng)體內(nèi)代謝生成的氮正離子能與DNA發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致基因突變。根據(jù)芳香胺類雜質(zhì)極性和弱堿性的差異，建立相應(yīng)的方法對(duì)其進(jìn)行控制。

李等[24]以甲醇為溶劑，采用直接進(jìn)樣GC-MS/MS法在MRM模式下定量測(cè)定吉非替尼中3,4-二氯苯胺，LOD可達(dá)4 ng/mL；范等[25]采用二氯甲烷液液萃取GC-MS法測(cè)定托拉塞米原料中的鄰硝基甲苯、鄰甲苯胺、對(duì)甲苯胺、間甲苯胺，LOD均可達(dá)10.25 ng/mL；Muller等[26]采用SPME-GC-MS法測(cè)定水中的6種苯胺衍生物，該方法簡(jiǎn)便快速，靈敏度高，精密度好；Zimmermann等[27]通過重氮化和碘化反應(yīng)降低極性芳香胺的極性，以固相微萃取技術(shù)提取碘代苯衍生化產(chǎn)物，運(yùn)用GC-MS法分析，該方法靈敏度高，除2-氨基-4,6-二硝基甲苯、4-氨基-2,6-二硝基甲苯和2,4-二氨基-6-硝基甲苯外其余15中芳香胺的LOD均小于13 ng/L；Diao等[28]以乙醇為分散劑，環(huán)己烷為萃取劑，采用分散液液微萃取技術(shù)提取水中的14種芳香胺，該方法簡(jiǎn)單、快速靈敏，各待測(cè)物L(fēng)OD均在0.07～0.29 μg/L；Schmidt等[29]采用SPE技術(shù)富集水中的芳香胺，以碘或溴為衍生化試劑，生成碘代或溴代產(chǎn)物，采用GC-MS法進(jìn)行分析，該方法靈敏度高，選擇性好；馬等[30]通過鹽析作用降低氯代苯胺類化合物在水中的溶解度，采用HS-GC-MS法測(cè)定水中的11種氯代苯胺，檢出限均低于0.3 μg/mL。以上關(guān)于水中芳香胺的檢測(cè)方法均可作為藥物中該類雜質(zhì)檢測(cè)的借鑒。

2.5 肼類化合物

肼類化合物常作為藥物合成過程中的綠色還原劑，反應(yīng)生成的副產(chǎn)物只有氮?dú)夂退粡V泛應(yīng)用于藥物合成。肼類化合物經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化形成的碳正離子和碳自由基可與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)。肼類化合物堿性較強(qiáng)，易與固定液上的硅氧基發(fā)生相互作用引起固定液流失影響柱效，這給此類雜質(zhì)分析方法的建立帶來了很大的難度，目前一般采用衍生化方法測(cè)定肼類化合物。

牛等[31]以甲醇為溶劑，采用直接進(jìn)樣GC-MS法測(cè)定富馬酸盧帕他定中痕量雜質(zhì)偶氮二異丁腈，該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，LOD可達(dá)0.045 μg/mL；Cathum等[32]分別以4-硝基苯甲醛，4-氯苯甲醛和4-氰基苯甲醛等芳香醛為衍生化試劑，以二氯甲烷提取衍生化產(chǎn)物，采用GC-MS法測(cè)定水中的偏二甲肼；Gionfriddo等[33]以氯甲酸丙酯和吡啶為衍生化試劑，采用SPME技術(shù)富集衍生化產(chǎn)物，再采用SRM模式進(jìn)行檢測(cè)，專屬性和靈敏度得到了很大的提升，LOQ和LOD分別可達(dá)8.3 ng/mL和4.4 ng/mL；Oh等[34]以1,1,1-三氟-2,4-戊二酮為衍生化試劑，與肼反應(yīng)生成3-甲基-5-(三氟甲基)吡唑，結(jié)合HS-SPME-GC-MS/MS測(cè)定水中的痕量肼，LOD可達(dá)2 ng/mL。以上水中肼檢測(cè)方法可為藥物中肼檢測(cè)方法的建立提供參考。Sun等[35]采用丙酮或氘代丙酮為衍生化試劑，將肼衍生化為丙酮嗪，采用HS-GC-MS法進(jìn)行測(cè)定，該方法可用于原料藥中痕量肼的檢測(cè)，降低基質(zhì)干擾的同時(shí)提高了檢測(cè)的靈敏度，LOD可達(dá)10 ng/mL。

3 結(jié) 語

藥物中痕量基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)要求分析方法具有較高的靈敏度、選擇性，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可實(shí)現(xiàn)樣本中待測(cè)物準(zhǔn)確快速的分析。基因毒性雜質(zhì)結(jié)構(gòu)種類繁多，理化性質(zhì)各不相同，需要根據(jù)藥物基質(zhì)和待物成分的性質(zhì)選擇合適的樣本前處理方法，例如采用LLE、SPE、SPME和LPME等萃取技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行分離純化和富集后進(jìn)樣分析，該方法能較大程度上減少樣本中其他成分的干擾，實(shí)現(xiàn)凈化樣本的目的；或采用衍生化的方法降低待測(cè)成分的反應(yīng)活性，提高其檢測(cè)特性和穩(wěn)定性。本文介紹了氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合不同的樣本前處理方法在5種基因毒性雜質(zhì)--鹵代烷烴、磺酸酯、環(huán)氧化物、芳香胺和肼類化合物檢測(cè)中的應(yīng)用，降低基質(zhì)干擾的同時(shí)提高檢測(cè)的靈敏度，可為基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)方法的建立提供重要參考。