米根霉利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)富馬酸的研究進(jìn)展

李 鑫, 勇 強(qiáng)

(南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037)

木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生生物質(zhì)資源，具有量大、價(jià)廉、環(huán)境友好等特點(diǎn)，是潛在規(guī)模化生物煉制的原料。我國是木質(zhì)纖維素資源高產(chǎn)國，農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)大約7億～8億噸，林業(yè)采伐及加工剩余物等廢棄木質(zhì)纖維素原料每年也有1億～2億噸左右[1]。如能實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素高效資源化利用，不僅解決農(nóng)林廢棄物資源浪費(fèi)問題，更可變廢為寶，減少環(huán)境污染，具有重要的社會效益和環(huán)境效益，以及較高的經(jīng)濟(jì)效益。米根霉(Rhizopusoryzae)作為根霉屬絲狀真菌的一種，是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證的安全菌株，具備多種生物基平臺化學(xué)品的生物制造能力，如富馬酸、乳酸、乙醇等[2-3]。米根霉是公認(rèn)的最佳富馬酸生產(chǎn)菌之一[4]。富馬酸，又名反丁烯二酸、延胡索酸、紫堇酸或地衣酸，是最簡單的不飽和二元羧酸。最早從延胡索植物(Fumariaofficinalis)中發(fā)現(xiàn)提取得到[5]。因富馬酸分子中含有一個不飽和的雙鍵，是一種重要的有機(jī)化工原料和精細(xì)化學(xué)品，廣泛應(yīng)用于材料、食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。目前全世界富馬酸的產(chǎn)量達(dá)到每年9萬噸以上，主要采用化學(xué)法生產(chǎn)富馬酸，以苯為原料，通過順酐異構(gòu)化生產(chǎn)富馬酸[5]。正是由于富馬酸的廣泛應(yīng)用，美國能源部把富馬酸列為12種優(yōu)先發(fā)展的平臺化合物之一[4]。當(dāng)前食品級富馬酸的售價(jià)已經(jīng)超過10 000元/噸，以廉價(jià)、易得、非糧食基的木質(zhì)纖維素資源為原料，利用米根霉發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸，一舉多得，有利支撐富馬酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與技術(shù)升級。筆者針對米根霉利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)富馬酸的技術(shù)現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，從米根霉積累富馬酸的代謝途徑、木質(zhì)纖維素原料利用、發(fā)酵生產(chǎn)方式以及多聯(lián)產(chǎn)技術(shù)等角度，闡述近年來的研究進(jìn)展。

1 木質(zhì)纖維素生物煉制技術(shù)路線

木質(zhì)纖維素資源豐富且廉價(jià)，但因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和抗降解性，必須經(jīng)過預(yù)處理，才能破壞其復(fù)雜而緊密的結(jié)構(gòu)[6]。木質(zhì)纖維素經(jīng)預(yù)處理和纖維素酶水解后，降解成可發(fā)酵碳源，繼而生物轉(zhuǎn)化為生物能源、生物基化學(xué)品，同時酶水解產(chǎn)生的木質(zhì)素固體渣進(jìn)一步被高值化利用，轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品。這一技術(shù)路線被公認(rèn)為最具應(yīng)用前景的木質(zhì)纖維素生物煉制途徑[7-9]，如下圖所示：

2 米根霉菌積累富馬酸的代謝機(jī)制

2.1 米根霉可利用的碳源及其產(chǎn)物

米根霉可以代謝多種碳源，底物選擇性寬泛，米根霉可利用的碳源包括：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、甘露醇、果糖、蔗糖、木聚糖、果膠、單寧酸、菊粉等[3]。特別需要指出的是米根霉對利用木質(zhì)纖維原料有其先天優(yōu)勢，可以利用六碳糖(葡萄糖)和五碳糖(木糖)[10]。米根霉的主要代謝產(chǎn)物是富馬酸、乳酸、蘋果酸、乙醇等。此外，米根霉可產(chǎn)多種生物催化劑，如纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等；同時，米根霉菌體生物質(zhì)即可作飼料，又可提取細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)/殼聚糖和制備葡萄糖胺[11-12]，如圖1所示。

圖1 米根霉利用多種不同碳源生產(chǎn)不同產(chǎn)物

2.2 米根霉利用葡萄糖積累富馬酸的代謝途徑

富馬酸作為一種重要的代謝中間產(chǎn)物，其在微生物體內(nèi)積累的機(jī)制一直備受關(guān)注。富馬酸胞內(nèi)積累機(jī)制主要包括乙醛酸支路途徑學(xué)說和胞液途徑學(xué)說。乙醛酸支路途徑學(xué)說，又稱“C2+C2”學(xué)說，由Foster等于1949年提出，認(rèn)為富馬酸是由兩個二碳化合物在根霉菌胞內(nèi)合成而來[13]；胞液途徑學(xué)說，又稱“C3+C1”學(xué)說，Romano等[14]于1967年研究發(fā)現(xiàn)根霉菌通過固定CO2來合成富馬酸，進(jìn)而Osmani等[15]在前人的基礎(chǔ)上，總結(jié)出根霉菌的胞液中存在一條三羧酸循環(huán)(TCA)還原途徑合成富馬酸，提出了胞液途徑學(xué)說。丙酮酸羧化酶是該途徑的關(guān)鍵酶之一，它起著固定CO2的作用，催化CO2與丙酮酸反應(yīng)生成草酰乙酸，通過蘋果酸脫氫酶轉(zhuǎn)化生成蘋果酸，最后經(jīng)過富馬酸酶生成富馬酸。Kenealy和Wright等的研究結(jié)果證實(shí)了TCA 還原途徑是米根霉內(nèi)積累富馬酸的主要途徑[16-17]。因此，在根霉菌中，通過胞液途徑合成富馬酸成為公認(rèn)的主流富馬酸積累途徑(圖2)。

圖2 米根霉利用葡萄糖和木糖積累富馬酸的代謝途徑

2.3 米根霉利用木糖積累富馬酸的代謝途徑

米根霉除了可以利用葡萄糖外，還可以利用木糖發(fā)酵產(chǎn)富馬酸，特別適合于利用木質(zhì)纖維基混合碳源(含有葡萄糖和木糖)生產(chǎn)富馬酸。有別于葡萄糖，米根霉菌利用木糖的過程中，木糖經(jīng)木糖還原酶作用轉(zhuǎn)化為木糖醇，此反應(yīng)需要消耗還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)；而后由依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的木糖脫氫酶作用，將木糖醇轉(zhuǎn)化為木酮糖，同時生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)；木酮糖由木酮糖激酶磷酸化為木酮糖-5-磷酸，木酮糖-5-磷酸進(jìn)入磷酸戊糖代謝途徑生成果糖- 6-磷酸和3-磷酸甘油醛，再經(jīng)糖酵解代謝途徑生成丙酮酸(圖2所示)。由于木糖利用過程需要NADPH，部分的葡萄糖- 6-磷酸須進(jìn)入磷酸戊糖代謝途徑再生NADPH，分散了碳流分布，使流向生成丙酮酸方向的碳流減少，降低了木糖轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的代謝流和轉(zhuǎn)化率。此外，生成的NADH參與菌體的氧化磷酸化過程，為菌體提供較多的能量，導(dǎo)致菌體生物量的增加[18]。正是由于二氧化碳的分流作用，與米根霉利用葡萄糖產(chǎn)酸對比，米根霉利用木糖的轉(zhuǎn)化率顯著低于利用葡萄糖的轉(zhuǎn)化率[19]。竇暢等[10]研究結(jié)果表明以木糖為碳源，米根霉的生物量積累較多，對木糖轉(zhuǎn)化率超過37%。另外，Xu等[20]研究表明米根霉為了應(yīng)對木糖發(fā)酵所帶來的氧化壓力和生存的需要，消耗較多的碳源，減少了富馬酸的生產(chǎn)。

3 米根霉產(chǎn)富馬酸的木質(zhì)纖維原料

木質(zhì)纖維素是植物的細(xì)胞壁的主要成分，其中包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等。木質(zhì)纖維素和蛋白質(zhì)緊密結(jié)合或化學(xué)鍵連接，形成復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有顯著的抗降解能力[21]，可保護(hù)植物細(xì)胞。木質(zhì)纖維素資源包括農(nóng)業(yè)廢棄物、造紙工業(yè)廢棄物、林業(yè)加工廢棄物等，我國擁有豐富的可再生木質(zhì)纖維素資源。由于木質(zhì)纖維素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和抗降解性，木質(zhì)纖維素資源必須經(jīng)過處理后，轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖源，可被米根霉生物轉(zhuǎn)化為富馬酸。近10年來，國內(nèi)外米根霉利用木質(zhì)纖維素資源生產(chǎn)富馬酸的研究，如表1所示。目前文獻(xiàn)報(bào)道用于米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的木質(zhì)纖維素資源主要有玉米芯、玉米秸稈、造紙廢棄物、牛糞、甘蔗渣、板栗栗苞、麥麩等。 Xu等[22]以酸預(yù)處理玉米秸稈為原料，利用米根霉ME-F12發(fā)酵產(chǎn)富馬酸，產(chǎn)量達(dá)到27.79 g/L。筆者課題組以堿預(yù)處理玉米芯為原料，利用米根霉CICC40351發(fā)酵產(chǎn)富馬酸，采用組合發(fā)酵方式生產(chǎn)富馬酸，富馬酸產(chǎn)量最大達(dá)到41.32 g/L[23]。Wu等[24]以酸預(yù)處理玉米芯為原料，利用能夠耐受糠醛的米根霉WHT5生產(chǎn)富馬酸，富馬酸質(zhì)量濃度可達(dá)49.05 g/L。Deng等[25]以氨預(yù)處理甘蔗渣為原料，利用米根霉ATCC20344發(fā)酵富馬酸，產(chǎn)量達(dá)到34.20 g/L。

表1 近10年來米根霉利用木質(zhì)纖維素資源生產(chǎn)富馬酸的研究

4 米根霉產(chǎn)富馬酸的發(fā)酵方式及聯(lián)產(chǎn)技術(shù)

4.1 分步水解與發(fā)酵法

米根霉利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)富馬酸，根據(jù)木質(zhì)纖維素糖化和發(fā)酵工藝的差異，其發(fā)酵方式分為分步水解與發(fā)酵法(SHF)、同步糖化發(fā)酵法(SSF)以及組合發(fā)酵法。分步水解與發(fā)酵法(SHF)是指經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料，首先使其水解(化學(xué)法或酶法)成可發(fā)酵碳源，然后由微生物再進(jìn)行發(fā)酵。該方法的優(yōu)點(diǎn)是水解和發(fā)酵各自在其最佳的條件下進(jìn)行，水解得率和產(chǎn)量較高；其缺點(diǎn)是木質(zhì)纖維素的水解與發(fā)酵分步進(jìn)行，易受到水解產(chǎn)物抑制或發(fā)酵底物濃度過高產(chǎn)生的限制作用[18]。近年來，較多研究中應(yīng)用SHF技術(shù)于米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸。Xu等[22]采用酶水解方式水解酸預(yù)處理的玉米秸稈，纖維素酶用量為60 FPIU/g葡聚糖水解72 h，葡萄糖和木糖質(zhì)量濃度分別為31.2和1.8 g/L，水解液經(jīng)濃縮后，用于米根霉發(fā)酵，富馬酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為27.79 g/L和0.33 g/(L·h)。本課題組以自水解預(yù)處理的板栗栗苞為原料，采用酶水解，纖維素酶用量為50 FPIU/g，酶解得率超過95%，米根霉發(fā)酵96 h后，富馬酸質(zhì)量濃度達(dá)到15.78 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.34 g/g[29]。

4.2 同步糖化發(fā)酵法及組合發(fā)酵法

同步糖化發(fā)酵法(SSF)是指酶水解糖化與發(fā)酵在同一反應(yīng)器中同步進(jìn)行，具有發(fā)酵周期短、成本低、避免底物抑制等優(yōu)點(diǎn)[31]。Li等[27]以生產(chǎn)低聚木糖的玉米芯廢渣為原料，進(jìn)行米根霉SSF產(chǎn)富馬酸，質(zhì)量濃度達(dá)到12.54 g/L，富馬酸產(chǎn)量較之SHF過程高1.8倍，顯示了利用木質(zhì)纖維原料SSF產(chǎn)富馬酸的優(yōu)勢。SSF過程也存在著一定的局限性，酶水解條件和發(fā)酵條件難于統(tǒng)一，不能在各自的最佳條件下進(jìn)行，使酶水解和發(fā)酵均受到一定程度的限制，特別是溫度，纖維素酶水解溫度一般在45～50 ℃，而米根霉發(fā)酵溫度一般在28～35 ℃，水解與發(fā)酵的溫度難于協(xié)調(diào)一致。有研究從影響SSF的主要因素入手，優(yōu)化溫度和發(fā)酵培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)在38 ℃的較高溫度下SSF產(chǎn)富馬酸，獲得了較高的富馬酸產(chǎn)量，說明米根霉能夠耐受較高的發(fā)酵溫度，也避免纖維素酶水解性能的大幅度下降[31]。

現(xiàn)有的米根霉SSF產(chǎn)富馬酸的研究中，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要在5%～10%(以絕干固形物計(jì))之間，特別是利用木質(zhì)纖維原料的SSF，富馬酸的產(chǎn)量顯著低于淀粉基原料。Deng等[32]報(bào)道以玉米淀粉為原料，米根霉DG-3進(jìn)行SSF產(chǎn)富馬酸，玉米淀粉為10%時，富馬酸質(zhì)量濃度達(dá)到44.10 g/L。這說明現(xiàn)階段米根霉SSF研究屬于液態(tài)浸沒式發(fā)酵，體系中90%為游離水，是在液態(tài)狀態(tài)下完成糖化與發(fā)酵過程。但對于利用木質(zhì)纖維原料來說，原料的高濃度對于過程經(jīng)濟(jì)性和技術(shù)要求至關(guān)重要，增加底物濃度，可增加產(chǎn)物濃度，有利于降低設(shè)備尺寸和能耗，減輕下游分離純化負(fù)擔(dān)。理想的木質(zhì)纖維原料起始質(zhì)量分?jǐn)?shù)的臨界值為15%～20% (以絕干固形物計(jì))。高木質(zhì)纖維原料起始濃度意味著體系內(nèi)黏度增加，游離水有限，使傳質(zhì)受限，直接影響纖維素酶的水解行為和SSF過程[33]。因此，提高木質(zhì)纖維原料的底物濃度，對米根霉利用木質(zhì)纖維素資源產(chǎn)富馬酸非常重要。筆者所在課題組開展了高底物濃度的米根霉SSF產(chǎn)富馬酸，但研究結(jié)果表明一味增加木質(zhì)纖維原料的底物濃度，富馬酸的產(chǎn)量不僅降低，且伴隨著副產(chǎn)物乙醇濃度的增加，以及葡萄糖利用率和底物轉(zhuǎn)化率的下降[23]。

米根霉高木質(zhì)纖維原料濃度SSF過程，不同于無游離水的固態(tài)發(fā)酵過程，又不同于低底物濃度的液態(tài)浸沒式發(fā)酵過程，是介于兩者之間的臨界狀態(tài)。針對高底物濃度SSF過程存在的問題，筆者課題組開展了組合發(fā)酵法利用木質(zhì)纖維原料產(chǎn)富馬酸的研究。以堿預(yù)處理玉米芯為原料，將SHF和分批補(bǔ)料式SSF有機(jī)結(jié)合起來，建立了高底物濃度發(fā)酵產(chǎn)富馬酸工藝技術(shù)，底物濃度達(dá)到20%，富馬酸質(zhì)量濃度達(dá)到41.32 g/L[23]。該組合發(fā)酵法，與SHF和SSF發(fā)酵法對比，有效克服了SHF和SSF發(fā)酵方式存在的問題，顯著提高了底物濃度，促進(jìn)了米根霉利用木質(zhì)纖維素產(chǎn)富馬酸。

4.3 基于發(fā)酵法產(chǎn)富馬酸的多聯(lián)產(chǎn)技術(shù)

木質(zhì)纖維原料水解后，水解液中主要單糖組分為葡萄糖和木糖。雖然米根霉兼具利用葡萄糖和木糖的能力，但從利用葡萄糖和木糖產(chǎn)富馬酸的效率來看，顯然葡萄糖好于木糖[10]。為了克服米根霉利用木質(zhì)纖維素產(chǎn)富馬酸過程中木糖利用率低的問題，Xu等[22]以含木糖的水解液增殖米根霉，提高菌體生物量；再由增殖的米根霉將富含葡萄糖的水解液轉(zhuǎn)化為富馬酸。這一研究雖然實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素中碳源組分的全利用，但并沒有把半纖維素組分轉(zhuǎn)化為有價(jià)值產(chǎn)品。既然米根霉發(fā)酵過程中產(chǎn)生較多的菌體生物量，學(xué)者將實(shí)現(xiàn)菌體資源的再利用作為新的研究方向。米根霉菌體中富含殼聚糖，占菌體干質(zhì)量的13%以上，是較為理想的生物材料[34]。Liao等[26]以牛糞為原料，以米根霉ATCC20344為菌種，聯(lián)產(chǎn)富馬酸和幾丁質(zhì)，富馬酸質(zhì)量濃度為31 g/L，菌體生物量為11.5 g/L，每克菌體含0.21 g幾丁質(zhì)。筆者課題組也開展了聯(lián)產(chǎn)富馬酸和殼聚糖的研究，以10%玉米芯渣為原料，SSF產(chǎn)富馬酸，富馬酸質(zhì)量濃度為28.65 g/L；SSF后，采用堿法從米根霉廢棄菌體中提取殼聚糖，米根霉殼聚糖的脫乙酰度為90%[35]。與此同時，筆者課題組另辟蹊徑，提出了一種新的解決木糖利用率低的思路，即將木質(zhì)纖維素中的半纖維素組分轉(zhuǎn)化為低聚木糖，而將纖維素組分轉(zhuǎn)化為富馬酸。采用堿法預(yù)處理玉米芯，分別得到富含半纖維素和纖維素的組分；由米根霉將富含纖維素組分轉(zhuǎn)化為富馬酸，富馬酸質(zhì)量濃度達(dá)到35.22 g/L；再由內(nèi)切木聚糖酶將富含半纖維素組分水解制備低聚木糖，低聚木糖得率達(dá)到62.35%[36]。低聚木糖與富馬酸的聯(lián)產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了木質(zhì)纖維素碳源組分的高效利用，增加了產(chǎn)品的附加值，有效降低了富馬酸生產(chǎn)成本，為木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化富馬酸提供了一種新的途徑。

5 展 望

隨著市場對富馬酸的需求量增加，以及石化資源面臨的資源受限和生態(tài)環(huán)保問題，發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸前景廣闊。木質(zhì)纖維素是自然界中最為豐富的可再生生物質(zhì)資源，米根霉利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)富馬酸是富馬酸生產(chǎn)的未來發(fā)展方向之一，將有助于降低富馬酸生產(chǎn)成本，提高木質(zhì)纖維素的利用價(jià)值。因此，基于木質(zhì)纖維素的發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸的工程技術(shù)研究與開發(fā)，包括米根霉發(fā)酵性能的提高、木質(zhì)纖維素的綜合利用、發(fā)酵方式的改進(jìn)與提高、多聯(lián)產(chǎn)技術(shù)的應(yīng)用等，將顯著降低發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸的成本?？萍妓降牟粩噙M(jìn)步，必然推動發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸技術(shù)的發(fā)展，未來基于木質(zhì)纖維素的米根霉生產(chǎn)富馬酸技術(shù)一定可以與基于石化資源的富馬酸生產(chǎn)技術(shù)相競爭。