黃芩提取物對魚類水霉病病原菌的抑制機制

石 浩， 蔣飛勇， 何小娥， 王文龍

(湖南應用技術學院農林科技學院，湖南常德 415000)

水霉是水霉屬的真菌之一，可感染淡水魚及魚卵，這些感染通常被稱為“水霉病”，水霉病是水產養(yǎng)殖中最常出現(xiàn)的真菌性寄生疾病，別稱膚霉病、白毛病、覆棉病或水棉病等[1]。水霉孢子感染受傷魚體的皮膚或魚卵容易引起水霉病，因淡水魚易感染水霉病，給漁業(yè)生產造成了巨大的經濟損失[2]。而在漁業(yè)上用來防治水霉病的化學藥物具有廣譜抗菌、使用便捷、見效快等特點，但化學藥物又有其自身的缺點，包括致癌癥、致畸形、致突變、高毒副作用、高殘留及極易產生抗藥性等問題[3]。中草藥在防治水產養(yǎng)殖動物病害中的應用也早有研究，1990年童裳亮研究了5種野生的植物提取液對魚病毒效應及抗魚病菌的效果[4]；汪曉娟等研究了魚藤酮、蛇床子素、百部堿、苦楝素及煙堿5種植物提取物對水霉菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)這些植物提取物對水霉菌均有抑制作用，且抑制效果從強至弱表現(xiàn)為煙堿<蛇床子素<百部堿<魚藤酮<苦楝素[5]。目前，中藥資源常被利用為水霉病的防治藥劑，由于中草藥中的有些有效成分會以破壞真菌的細胞壁、阻礙真菌的正常合成、影響真菌正常代謝等方式來影響水霉菌的正常生長[6]，并且中草藥具有來源廣泛、不易產生耐藥性、低殘留、低成本等特點[7]。中藥黃芩的藥用價值很高[8]，不管是在醫(yī)學臨床方面還是在植物藥方面都有廣闊的應用前景。國內外有關的研究報道很多，例如，宋麗雅等通過對花椒的抑菌機制研究，發(fā)現(xiàn)花椒提取物通過改變細胞膜的通透性及影響細胞壁來達到抑菌的效果[9]。云寶儀等研究黃芩素對金黃色葡萄球菌的抑制作用及其抑菌機制發(fā)現(xiàn)，黃芩素使金黃色葡萄球菌的細胞膜滲透性增大[10]。但關于黃芩提取物對水霉菌的抑制機制還未見相關報道。本研究初步探討黃芩提取物對魚類水霉病病原菌的抑制機制，以期為防治魚類水霉病和水產養(yǎng)殖研發(fā)安全、高效、無污染、無殘留的綠色藥品提供試驗依據(jù)和理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 藥品與儀器

1.1.1 主要試驗藥品 中藥黃芩、孢子懸浮液、水霉菌、馬鈴薯液體培養(yǎng)基、黃芩提取物、無菌生理鹽水、葡萄糖、葡萄糖溶液、葡萄糖標準溶液、濃硫酸、草酸、醋酸、蒽酮、pH值為7.0的磷酸緩沖液、石英砂、茚三酮、蛋白質標準溶液、考馬斯亮藍G-250試劑、50 mmol/L磷酸緩沖液、130 mmol/L 甲硫氯酸(Met溶液)、氨基酸標準溶液、750 μmol/L NBT溶液、100 μmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、20 μmol/L 核黃素、10% H2SO4、0.1 mol/L H2O2、0.1 mol/L KMnO4。

1.1.2 主要試驗儀器 250H恒溫培養(yǎng)箱，購自金壇國旺實驗儀器廠；BA310Digital數(shù)碼顯微鏡，購自麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；UV5100B紫外分光光度計，購自上海元析儀器有限公司；L400離心機，購自金壇國旺實驗儀器廠；7230型分光光度計，購自上海儀田精密儀器有限公司；OK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋，購自上海市泰斯特儀器有限公司；YXQ-SL-100S11高壓滅菌鍋，購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；QLF-6020真空冷凍干燥機，購自北京樂普納科技有限公司；JA2003N電子天平，購自上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃芩提取物對水霉菌生長發(fā)育影響試驗

1.2.1.1 對孢子形成的試驗 制備孢子懸浮液105CFU/mL：于6孔板加入馬鈴薯液體培養(yǎng)基 500 μL 和孢子懸浮液100 μL；待10 h孢子全部萌發(fā)后，將黃芩提取物分別按質量濃度0、10、50、100、300、500 mg/L制成終體積為1 mL總液體；將6孔板放入18 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，采用血球計數(shù)板進行計數(shù)。

1.2.1.2 對孢子萌發(fā)的試驗 制備馬鈴薯液體培養(yǎng)基；制備孢子懸浮液105CFU/mL；在6孔板中加入馬鈴薯液體培養(yǎng)基 500 μL 和孢子懸浮液 100 μL；將提取物分別按質量濃度0、10、50、100、300、500 mg/L制成終體積為1 mL的總液體；待 10 h 后觀察孢子萌發(fā)情況，進行計數(shù)處理，計算萌發(fā)率。

1.2.1.3 對菌絲生長抑制率的試驗 黃芩提取物分別按質量濃度為0、100、200、300、400、500 mg/L制成PDA平板，于超凈工作臺完成此操作，將直徑0.9 cm的供試病菌菌餅塊置于含藥劑的培養(yǎng)基平板中央，每皿1塊，每處理3次重復，放于18 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。測量菌落凈生長距離，計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=(對照菌落凈生長距離-處理菌落凈生長距離)/對照菌落凈生長距離×100%。

1.2.1.4 對菌絲生長量的測定 將活化好的水霉菌用無菌生理鹽水洗下，過濾掉菌絲，制得孢子懸浮液(105CFU/mL)。馬鈴薯液體培養(yǎng)基冷卻后于無菌條件下采用移液器加入孢子懸浮液1 mL，18 ℃振蕩培養(yǎng)，待菌絲球生長良好時加入提取物，對照組則為不添加組。繼續(xù)培養(yǎng)5 d后，過濾得菌絲體，采用蒸餾水反復沖洗菌絲，將培養(yǎng)基去除干凈，在真空冷凍干燥機中凍干至恒質量，精確稱取菌絲體的質量。每個處理重復3次，試驗重復3次。

1.2.2 黃芩提取物對水霉菌生理代謝影響試驗

1.2.2.1 菌絲總糖含量的測定 (1)總糖含量的測定采用苯酚試劑法[11]。葡萄糖的標準曲線制作：取6支潔凈試管并依次編號，分別依次加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的100 μg/mL葡糖糖標準溶液，在各試管中加入1 mL 6%苯酚溶液，并立刻在各試管中加入5.0 mL濃硫酸，充分搖勻，靜置10 min，各試管補水至7 mL，在波長495 nm下依次測量反應液吸光度，橫坐標為標準的葡萄糖質量m(μg)、縱坐標為吸光度并以繪制葡萄糖標準曲線。按下列數(shù)據(jù)依次加入各種溶液，得標準曲線：y=0.013 6x+0.071 8(r2=0.993 6)。

(2)樣品處理與測定。精確稱取0.5 g水霉菌絲，放于研缽，加入5 mL蒸餾水研磨，轉入三角瓶，再加水至50 mL左右，再用塑料薄膜封好瓶口，在沸水中提取15 min，水浴冷卻至室溫，定容至250 mL刻度線處，過濾得濾液。各取1 mL上清液于3支試管中，調零組加1 mL蒸餾水，按照標準曲線方法進行加樣和顯色測定，重復3次，取其平均值。

含糖量=(m×V)/(VS×m1×106)×100%。

式中：m表示查標準曲線所得的糖質量，μg；V表示總體積，mL；VS表示測定時所取體積，mL；m1表示樣品質量，g。

1.2.2.2 菌絲蛋白質含量的測定 (1)繪制蛋白標準曲線，采用了考馬斯亮藍法[12]。取6支玻璃試管，采用1 000 mL移液管分別量取100 μg/mL蛋白質標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于 10 mL 玻璃試管中，在各試管中加蒸餾水補齊至1.0 mL，然后在每支試管中加入4 mL考馬斯亮藍試劑，迅速振蕩搖勻，靜置5 min后在595 nm處測定溶液的吸光度D595 nm，以蒸餾水作為空白組。橫坐標為牛血清白蛋白含量m′(μg)、縱坐標為溶液的吸光度D，得出標準曲線：y=0.012 1x-0.005 2(r2=0.996 7)。

(2)樣品處理與測定。稱取菌絲0.5 g，加入pH值7.0磷酸緩沖液8 mL和少量石英砂，充分研磨成勻漿，加磷酸緩沖液定容至10 mL，然后于 4 ℃、10 000 r/m離心20 min，取出上清液并低溫保存?zhèn)溆?。分別取0.1 mL上清液于3支試管中，調零組加0.1 mL蒸餾水，按照標準曲線方法進行加樣和顯色測定，重復3次，取其平均值。

樣品蛋白質含量(mg/g)=(m′×V)/(VS×m2)。

式中：m′表示查得的蛋白質質量，×10-3mg；V表示提取液總體積，mL；m2表示樣品質量，g；VS表示測定時取用提取液體積，mL。

1.2.2.3 氨基酸含量的測定 (1)標準曲線的確定。準確吸取200 μg/mL氨基酸標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL(相當于0、100、200、300、400、500、600 μg氨基酸)放置在7支試管中，將pH值為 6的緩沖溶液稀釋至5.00 mL，再在其中加入茚三酮水溶液1 mL，充分搖勻，在沸水浴中加熱10 min；冷卻直至室溫，在波長569 nm下測定吸光度。采用氨基酸質量m″(μg)和吸光度制作標準曲線：y=0.001 2x+0.005 7(r2=0.994 0)。

(2)樣品處理與測定，采用茚三酮法[13]。稱取菌絲 0.5 g，加10%醋酸5 mL，后于研缽中研碎，采用蒸餾水洗移入100 mL容量瓶中，加水定容，然后再過濾至三角瓶中，最后取濾液測定。吸取1 mL樣品溶液，調零組加1 mL蒸餾水，按照標準曲線制作的步驟，在相同的條件下測定吸光度D值，測得的D值可以在標準曲線上查到對應的氨基酸質量(μg)。

氨基酸含量(mg/g)=m″×100/M3。

式中：m″表示查得的蛋白質質量，×10-3mg；M3表示菌絲質量g；

1.2.3 黃芩提取物對水霉菌酶活性影響試驗

1.2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定 (1)酶液提取。取新鮮水霉菌菌絲0.2 g于預冷研缽中，加2 mL預冷的0.05 mol/L、pH值7.8磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為 10 mL。于4 000 r/min下離心15 min，上清液即為酶粗提液。

(2)顯色反應。取3支試管編號，1號試管為測定管，另外2、3號試管為對照管，3支試管分別加入50 mmol/L磷酸緩沖液5.0 mL、130 mmol/L Met溶液0.3 mL、750 μmol/L NBT溶液0.3 mL、100 μmol/L EDTA-Na21.0 mL、去離子水 2.0 mL、20 μmol/L核黃素0.3 mL，其中1號樣品試管加入 0.3 mL 酶液、另外2支對照管加入0.3 mL緩沖溶液?；旌暇鶆蚝髮?支對照組試管放在暗處，其他試管放于4 000 lx的日光下反應20 min，后立刻遮光，以遮光管為對照調零，在560 nm下測定光的密度。待反應結束后，以沒有照光的對照管作空白，分別測定其他試管的吸光度。

SOD總活性=(Di-Do)×V/(Di×0.5×m×Vt)=(Di-Do)/(Di×0.015×m)；

式中：Di表示光照對照管的吸光度；Do表示樣品管的吸光度；V表示樣品液總體積，mL；m表示水霉菌菌絲質量，g；Vt表示測定時樣品用量(0.3 mL)。

1.2.3.2 過氧化氫酶(CAT)活性的測定 取 50 mL 三角瓶4個(2個為測定組，另2個為對照組)，測定瓶加入“1.2.3.1”節(jié)酶液1 mL，對照加煮死酶液1 mL，再加入2.5 mL 0.1 mol/L H2O2，同時計時于18 ℃恒溫水浴中保溫10 min，立即加入10% H2SO42.5 mL。采用0.1 mol/L KMnO4標準溶液作滴定，直到出現(xiàn)粉紅色(且在30 s內粉紅色不消失)為終點。酶活性用1 g鮮質量菌絲中過氧化氫酶在1 min內分解H2O2的質量(mg)表示：

過氧化氫酶活性=(A-B)×n/(m×1.7×t)。

式中：A表示對照KMnO4滴定的質量，mg；B表示酶反應后 KMnO4滴定的質量，mg；m表示水霉菌菌絲質量，g；t表示反應時間；“1.7”表示1 mol/L KMnO4相當于1.7 mg H2O2；n表示酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用WPS 2018軟件進行圖形的制作。采用statistix 8軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。取α=0.05顯著性水平，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 黃芩提取物對水霉菌生長發(fā)育的影響

2.1.1 不同質量濃度黃芩提取物對水霉菌孢子的影響 黃芩提取物對水霉菌孢子形成與萌發(fā)均具有較強的抑制作用。由表1可知，隨黃芩提取物質量濃度的增大，產生的孢子數(shù)逐漸變少，當黃芩提取物質量濃度達到300 mg/L時，孢子數(shù)量僅為 0.10×106個，質量濃度達500 mg/L時，水霉孢子幾乎停止生長。同時，隨黃芩提取物濃度的增加，對水霉菌孢子萌發(fā)的抑制率逐漸增加，當黃芩提取物質量濃度在10～100 mg/L之間時，抑制率呈大幅度上升趨勢，但抑制率最高未超過60%；當提取物質量濃度于300～500 mg/mL時，抑制率高達90%以上。由此可知，當提取物質量濃度達到300 mg/L及以上時，黃芩對水霉菌的繁殖代謝具有加強的抑制作用。

表1 不同質量濃度黃芩提取物對水霉菌孢子形成的影響

2.1.2 不同質量濃度黃芩提取物對菌絲生長的影響 黃芩提取物對水霉菌菌絲的生長具有較強的抑制作用。由表2可知，隨著黃芩提取物質量濃度的增大，對水霉菌菌絲生長的抑制率逐漸增強，當黃芩提取物質量濃度達到300 mg/L時，抑制率達到65%以上；當黃芩提取物質量濃度達到400 mg/L時，抑制率達到85%以上。試劑空白對照組菌絲的生長量達15 mg左右；當黃芩提取物質量濃度為100 mg/L時菌絲生長量為 12.32 mg；當提取物質量濃度達400 mg/L時，菌絲生長量為2.07 mg；當黃芩提取物質量濃度達至500 mg/L時，菌絲生長量接近1.50 mg，說明當黃芩提取物質量濃度在500 mg/L時對水霉菌的生長具有非常的大抑制效果。

表2 不同質量濃度黃芩提取物處理對水霉菌生長的影響

2.2 黃芩提取物對水霉菌生理代謝的影響

2.2.1 不同濃度黃芩提取物對菌絲總糖含量的影響 由圖1可知，隨著黃芩提取物質量濃度的增大，水霉菌菌絲總糖含量在逐步下降。當黃芩提取物質量濃度為0 mg/L時，菌絲總糖含量占8%左右，當黃芩提取物質量濃度在100～1 000 mg/L時，菌絲總糖含量在逐步下降，但是菌絲總糖含量下降最多也僅為 1.5% 左右，說明黃芩提取物對水霉菌絲總糖含量的影響效果不明顯。這可能是由于提取物在破壞菌絲細胞結構，影響菌絲的生長代謝，將多糖分解為小分子糖，但其體內總糖含量的減小量并不大。

2.2.2 不同濃度黃芩提取物對菌絲蛋白質含量的影響 由圖2可知，隨著黃芩提取物質量濃度的增大，水霉菌菌絲蛋白質含量在逐步下降。黃芩提取物質量濃度為0時，菌絲蛋白質含量是60.31 mg/g；當質量濃度為100 mg/L時，菌絲蛋白質含量下降至58.21 mg/g；當質量濃度上升至1 000 mg/L時，菌絲蛋白質含量仍在55.67 mg/g?？梢婞S芩提取物對水霉菌絲蛋白質含量的影響雖有一定減小的趨勢，但不顯著(P>0.05)。說明在高質量濃度時菌絲生長代謝受到了較大的抑制，蛋白質形成的更新量已逐漸減少或趨近為0。

2.2.3 不同質量濃度黃芩提取物對菌絲氨基酸含量的影響 由圖3可知，隨著黃芩提取物質量濃度的增大，水霉菌菌絲氨基酸含量呈遞減趨勢，遞減幅度在高質量濃度處理時較大。黃芩提取物質量濃度為0時，菌絲蛋白質含量是 38.32 mg/g；當黃芩提取物質量濃度在0～100 mg/L 之間時，氨基酸含量下降顯著(P<0.05)，100 mg/L時氨基酸含量下降至32.38 mg/g，說明黃芩提取物對菌絲氨基酸的形成具有較明顯的抑制效果；當質量濃度為 1 000 mg/L 時菌絲氨基酸含量下降至27.04 mg/g，其菌絲氨基酸含量的變化結果與蛋白質含量相一致。

2.3 黃芩提取物對水霉菌酶活性的影響

2.3.1 不同質量濃度黃芩提取物對SOD活性的影響 由圖4可知，隨著黃芩提取物質量濃度的增大，水霉菌菌絲SOD活性呈遞減趨勢。當沒有添加黃芩提取物時，由圖4可知，是275 U/g；但當黃芩提取物質量濃度在100 mg/L時，SOD活性有下降但幅度不是很大，說明黃芩提取物在這個質量濃度范圍對菌絲SOD活性的抑制作用不明顯。但當黃芩提取物質量濃度在500 mg/L 時；SOD活性顯著下降(P<0.5)，說明黃芩提取物在這個質量濃度時對菌絲SOD活性的抑制作用強，對菌生長代謝的影響大。

2.3.2 不同質量濃度黃芩提取物對CAT活性的影響 由圖5可知，隨著黃芩提取物質量濃度的增大，水霉菌菌絲CAT活性同樣呈遞減趨勢。由圖5可知，當黃芩提取物質量濃度在0～500 mg/L 之間時，CAT活性下降顯著(P<0.05)，說明黃芩提取物質量濃度在500 mg/L時對菌絲CAT活性的抑制作用強。當黃芩提取物質量濃度為1 000 mg/L時，CAT活性下降不明顯且較為緩慢，說明菌絲體CAT活性于500 mg/L時，幾乎受到了最大限度的抑制，因此隨著后期處理質量濃度的進一步提高，菌絲酶活減少量非常少。

3 討論

為初步研究黃芩提取物對水霉菌抑制機制，本試驗從水霉菌的繁殖、生長、理化、酶活性質等方面進行分析測定，當提取物質量濃度達到300～500 mg/L 時，孢子的形成量非常少，僅在0.01×106～0.10×106個之間，同時孢子萌發(fā)抑制率更是達到了90%以上，這可能是提取物破壞了菌絲的生殖代謝，菌絲孢子不能夠正常形成或形成不具有活性的孢子[14-15]。對菌體分別采用PDA液體、固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)，當提取物質量濃度達到400～500 mg/L 時，菌絲生長抑制率達到85%以上，菌絲生長量僅為1.5 mg左右，相對于空白組(14.77 mg)減少了約90%，這可能由于提取物迫害菌絲的正常生長代謝、阻礙了菌絲細胞的分裂與分化，從而有效地抑制菌絲生長[16]。糖、蛋白質、氨基酸是菌絲生長的主要代謝物之一，當菌絲停止生長或生長受到抑制時這些指標含量均會有所下降，通過試驗分析可知，當黃芩處理質量濃度在1 000 mg/L時，三者含量均有一定程度的下降，且下降量均達到了5%以上，說明提取物可有效阻礙菌絲的糖代謝和蛋白代謝，從而影響菌絲的生長，直至死亡。菌絲體內酶活性的強弱同樣是衡量菌體生長代謝強弱的主要指標之一，通過研究發(fā)現(xiàn)當采用1 000 mg/L提取物處理時，氧自由基和過氧化氫自由基清除酶的活性菌均有很大程度提高，分別達到60%、80%左右，說明此時菌體自由基的清除能力非常差，菌體正加速衰老和死亡。通過抑菌機制研究分析測定可有效判定菌死亡的原因，可為相類似綠色抑菌產品的開發(fā)奠定基礎。本研究抑菌機制指標較少，后期可進一步從菌絲細胞結構、關鍵基因表達與代謝進行分析，以期更全面地探索抑菌機制。