利用間歇浸沒式植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)金釵石斛種苗

張杰, 胡燕花, 張本厚*, 陳集雙

(1.杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 杭州 310018; 2.南京工業(yè)大學(xué)大豐海洋產(chǎn)業(yè)研究院, 江蘇 鹽城 224145;3.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院, 南京 211800)

金釵石斛(DendrobiumnobideLindl.)為蘭科石斛屬植物，是珍稀瀕危的名貴中藥材[1]，被列為“九大仙草”之一。金釵石斛以莖入藥，其主要化學(xué)成分有生物堿、多糖、倍半萜類、菲類、聯(lián)芐類等[2]，具有抗腫瘤、抗老年癡呆等活性[3]。金釵石斛除藥用價值外，其花型獨特、色彩艷麗，因此還極具觀賞價值。然而，由于金釵石斛的種子細小、無胚乳，在自然條件下繁殖能力極低，再加上自然生長緩慢、長期過度采掘，導(dǎo)致野生資源日趨枯竭[4]，目前已被列為國家珍稀瀕危二級保護植物，亟需開展資源保護和育種開發(fā)研究。

應(yīng)用植物組培快繁方法能夠有效解決金釵石斛種苗短缺的問題[5]，目前有關(guān)金釵石斛的快速繁殖技術(shù)已多有報道[6-7]。金釵石斛組織培養(yǎng)多采用固體培養(yǎng)，此方式是一個勞動密集型技術(shù)，人工成本占到生產(chǎn)總成本的60%以上，人工的大量投入又增加污染，進一步增加了生產(chǎn)成本[8]；另外由于培養(yǎng)過程是在一個相對密閉的空間，無法有效地進行氣體交換，組培苗的生長受到影響，培養(yǎng)周期延長，種苗質(zhì)量不高，移栽成活率降低[9]。

間歇浸沒式培養(yǎng)系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種植物組織培養(yǎng)系統(tǒng)，結(jié)合了固體培養(yǎng)最大氣體轉(zhuǎn)換和液體培養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)充分吸收利用的優(yōu)點[10]，具有培養(yǎng)周期短、增殖率高、自動化程度高、培養(yǎng)通量大等特點[11-12]。本文以貴州赤水金釵石斛為試驗材料，對金釵石斛組培苗進行間歇浸沒式培養(yǎng)研究，以期建立一種新的金釵石斛種苗生產(chǎn)模式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗材料為金釵石斛原球莖，取自貴州赤水地區(qū)人工種植的果莢，經(jīng)固體培養(yǎng)30 d后獲得，所用固體培養(yǎng)基為1/2MS+土豆50 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，調(diào)節(jié)pH至 6.0。

BIOF-IV型植物生物反應(yīng)器購自南京博方生物科技有限公司，工作原理為液體間歇浸沒式培養(yǎng)，即液體培養(yǎng)基間歇的與組培苗接觸，提供其生長所需營養(yǎng)，該設(shè)備分為上下結(jié)構(gòu)，上部分為組培苗生長室，下部分為液體培養(yǎng)基儲存室；采用氣壓作為培養(yǎng)基流動的動力、時間控制器控制流動頻率。

固體培養(yǎng)所使用的容器為500 mL的蘭花瓶，購自濟南普朗特生物科技有限公司。

1.2 金釵石斛的植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)

將一定重量的金釵石斛原球莖接種到100 mL無菌的液體培養(yǎng)基中，適應(yīng)性培養(yǎng)3～5 d，觀察無污染后同液體培養(yǎng)基一同倒入無菌的反應(yīng)器罐體，并補充900 mL液體培養(yǎng)基，完成接種，將反應(yīng)器罐體連接到反應(yīng)器的動力和控制系統(tǒng)中，設(shè)定浸沒頻率后進行培養(yǎng)?；疽后w培養(yǎng)基為1/2MS+土豆50 g·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，pH 6.0；培養(yǎng)環(huán)境為光照強度1 800～2 000 lx，光照周期14 h·d-1，溫度(25±1)℃；培養(yǎng)周期為90 d。

1.3 金釵石斛的固體培養(yǎng)

固體培養(yǎng)使用500 mL的蘭花瓶作為容器，每瓶中放入100 mL固體培養(yǎng)基，并接種1 g原球莖。固體培養(yǎng)基配方為1/2MS+土豆50 g·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂6.5 g·L-1，pH 6.0。培養(yǎng)環(huán)境與反應(yīng)器培養(yǎng)實驗組相同。

1.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

采用單因素分析對浸沒頻率、接種量和培養(yǎng)基蔗糖濃度進行優(yōu)化，每個因素設(shè)置4個水平。

1.4.1浸沒頻率優(yōu)化 浸沒頻率為生物反應(yīng)器培養(yǎng)的重要參數(shù)之一，直接影響植株生長情況。固定接種量為10 g、蔗糖濃度為30 g·L-1，設(shè)定浸沒時間為5 min，間隔時間為1、4、8、12 h，實驗組分別命名為A1、A2、A3、A4。

1.4.2接種量優(yōu)化 反應(yīng)器罐體中的接種量決定著罐體空間的利用率。固定蔗糖濃度為30 g·L-1、浸沒頻率為5 min/8 h，設(shè)定每個罐體原球莖的接種量為1、5、10、15 g·L-1，實驗組分別命名為B1、B2、B3、B4。

1.4.3蔗糖濃度優(yōu)化 培養(yǎng)基中的糖成分為植物的生長提供了碳源，培養(yǎng)基中蔗糖的濃度直接影響植株的增殖和生長情況。固定接種量為10 g、浸沒頻率為5 min/8 h，設(shè)定培養(yǎng)基中糖濃度為0、10 、20、30 g·L-1，實驗組分別命名為C1、C2、C3、C4。

1.5 生長狀態(tài)及增殖倍數(shù)檢測

培養(yǎng)90 d后，取出金釵石斛組培苗，分別測量株高、根長和莖粗。將組培苗用清水洗凈，吸水紙吸干的表面水分，精確稱量鮮重m2，接種原球莖的重量為m1，計算增殖倍數(shù)。

增殖倍數(shù)=m2/m1

1.6 多糖含量測定

采用硫酸-蒽酮法[13]測定多糖含量。

1.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取分析純蔗糖，置于墊有稱量紙的平皿中，60 ℃烘干，準(zhǔn)確稱取0.100 g，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，再加入0.5 mL濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度，使用時再稀釋10倍作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用蒸餾水補足到2.0 mL，依次分別加入蒽酮試劑0.5 mL、濃硫酸溶液5 mL，混勻，在沸水浴中10 min，冷卻后620 nm處測量OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2金釵石斛組培苗多糖提取與檢測 將金釵石斛組培苗烘干，用粉碎儀粉碎后，將粉末過60目篩，稱取0.1 g樣品粉末于三角燒瓶，加入25 mL煮沸的蒸餾水，混勻后放入沸中水浴30 min，取出三角瓶冷卻后過濾，濾液在容量瓶中定容至50 mL，獲得多糖提取液，將提取液稀釋10倍作為樣品液。顯色和檢測步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備過程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式和樣品液的OD值計算樣品液中多糖濃度和多糖含量。

1.7 生物總堿測定

1.7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 稱取干燥至恒重的石斛堿對照品1 mg，置于100 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分別置于60 mL的分液漏斗中，用三氯甲烷稀釋至10 mL，加入pH 4.5的緩沖液 5.0 mL和0.04%溴甲酚綠溶液2.0 mL，振搖混勻5 min，靜置30 min。取濾液5 mL，加入0.01 mol·L-1氫氧化鈉乙醇溶液 1.0 mL，搖勻，于620 nm處測OD值，標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.2生物總堿提取與檢測 樣品烘干后粉碎，取粉末0.5 g，用適量氨水濕潤，密封放置30 min，精確加入三氯甲烷10 mL，置于80 ℃水浴加熱回流2 h，冷卻后稱重，補足失重，過濾。取濾液1 mL于100 mL容量瓶中，補足三氯甲烷至刻度，混勻，作為樣品液。顯色和檢測步驟如同標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式和OD值計算樣品液中生物總堿濃度，再計算樣品中生物堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對組培苗生長狀態(tài)的影響

不同培養(yǎng)條件下金釵石斛組培苗的形態(tài)如表1所示。

表1 不同反應(yīng)器培養(yǎng)條件對金釵石斛組培苗形態(tài)特征的影響Table 1 Effect of different culture conditions on morphological characters of D. nobile plantlets

2.1.1浸沒頻率對組培苗生長狀態(tài)的影響 浸沒頻率不同組培苗形態(tài)出現(xiàn)明顯差異，間隔時間長植株莖的生長狀態(tài)較好，間隔時間短根的生長狀態(tài)較好，即實驗組A3和A4植株莖的高度和莖粗優(yōu)于其他兩組，且差異顯著；而實驗組A1和A2根長優(yōu)于其他兩組，但A2和A3差異不顯著，根據(jù)種苗移栽經(jīng)驗根不宜太長，因此最佳的反應(yīng)器培養(yǎng)種苗的浸沒頻率為實驗組A3。

2.1.2接種量對組培苗生長狀態(tài)的影響 接種量對組培苗生長狀態(tài)具有顯著影響，組培苗生長狀態(tài)最好的為實驗組B3，優(yōu)于接種量較低的實驗組B1和B2，說明金釵石斛種苗的生長具有一定的群體效應(yīng)，但當(dāng)接種量過高，由于空間不足組培苗相互“擠壓”而生長受到影響[14]，組培苗細弱。

2.1.3蔗糖濃度對組培苗生長狀態(tài)的影響 間歇浸沒培養(yǎng)是一個半開放式的培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過程中進行了有效的氣體交換[15]，為組培苗的生長提供充足的CO2，因此對液體培養(yǎng)基中蔗糖(碳源)需求量減少。從表1可看出，當(dāng)蔗糖濃度為C3(20 g·L-1)時，組培苗的生長狀態(tài)最佳，而固體培養(yǎng)一般使用的蔗糖濃度為30 g·L-1，因此，間歇浸沒反應(yīng)器培養(yǎng)可以節(jié)省部分糖源；當(dāng)培養(yǎng)基中不含蔗糖時，組培苗也有一定的生長，說明間歇浸沒生物反應(yīng)器具有無糖培養(yǎng)的潛力。

2.2 不同培養(yǎng)條件對增殖的影響

增殖倍數(shù)是培養(yǎng)能力的重要表現(xiàn)形式之一，在不同的浸沒頻率、接種量、蔗糖濃度條件下培養(yǎng)金釵石斛組培苗90 d后測定增殖倍數(shù)，結(jié)果如圖1所示，浸沒頻率為A3、接種量為B3、蔗糖濃度為C3時，所獲得的增殖倍數(shù)最高；通過浸沒頻率實驗組與其他實驗組增殖情況相比較發(fā)現(xiàn)，前者均高于后兩者，也可以說明浸沒頻率是影響金釵石斛組培苗間歇浸沒培養(yǎng)增殖倍數(shù)的關(guān)鍵因素。

注: 圖中不同小寫字母表示差異在P<0.05 水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。Note: Different small letters in the figure indicate significant difference at P<0.05 level.圖1 不同培養(yǎng)條件對金釵石斛組培苗增殖倍數(shù)的影響Fig.1 Effect of different culture conditions on proliferation rate of D. nobile plantlets

2.3 不同培養(yǎng)條件對組培苗中多糖含量的影響

利用反應(yīng)器培養(yǎng)金釵石斛組培苗，90 d后檢測不同培養(yǎng)條件下組培苗中多糖含量情況，結(jié)果如圖2所示：浸沒時間5 min，間隔時間為8 h(A3)有利于組培苗中多糖的積累，并與其他實驗組差異顯著；接種量為10 g·L-1(B3)時，檢測的組培苗中多糖含量最高；隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的提高，組培苗中多糖含量也逐漸提高，C4時為最高。

注: 圖中不同小寫字母表示差異在P<0.05 水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。Note: Different small letters in the figure indicate significant difference at P<0.05 level.圖2 不同反應(yīng)器培養(yǎng)條件對金釵石斛組培苗多糖含量的影響Fig.2 Effect of different culture conditions on polysaccharides content of D. nobile plantlets

2.4 不同培養(yǎng)條件對組培苗中生物總堿含量的影響

生物堿是金釵石斛中重要的藥效成分，其含量直接影響藥材的質(zhì)量。利用間歇浸沒式植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)金釵石斛組培苗，不同培養(yǎng)條件下組培苗中生物總堿的含量檢測結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示：浸沒時間為5 min，隨著間隔時間的增加，生物總堿的含量先升高后降低，在A3(間隔時間8 h)時含量最高，各實驗組之間差異顯著；接種量方面，在接種量為B1(1 g·L-1)到B3(10 g·L-1)時，生物總堿含量沒有明顯變化，接種量繼續(xù)增加到B4(15 g)生物總堿含量明顯降低；培養(yǎng)基中蔗糖濃度不同，生物總堿含量出現(xiàn)明顯差異，在蔗糖濃度為C3(20 g·L-1)時含量最高。

注: 圖中不同小寫字母表示差異在P<0.05 水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。Note: Different small letters in the figure indicate significant difference at P<0.05 level.圖3 不同反應(yīng)器培養(yǎng)條件對金釵石斛組培苗生物總堿含量的影響Fig.3 Effect of different culture conditions on total alkaloids content of D. nobile plantlets

2.5 不同培養(yǎng)方式幼苗生長狀態(tài)比較

傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)依靠以瓊脂為支撐物的固體培養(yǎng)基，由于該技術(shù)使用相對密閉的小容器，培養(yǎng)過程中無法進行有效的氣體交換，種苗生長受到一定的影響。對相同培養(yǎng)條件下金釵石斛的固體培養(yǎng)和間歇浸沒式植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)進行比較，結(jié)果如圖4所示，反應(yīng)器獲得植株生長狀態(tài)明顯優(yōu)于固體培養(yǎng)，前者的株高3～5 cm、莖粗2～3 mm、根長2～3cm，后者的株高1.5～3 cm、莖粗1～2.5 mm、根長0.5～1 cm。通過組培苗中多糖和生物總堿含量比較也發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器培養(yǎng)的組培苗兩種成分含量均顯著高于固體培養(yǎng)，前者的數(shù)值為3.82%和0.32 mg·g-1，后者的數(shù)值是2.41%和0.22 mg·g-1。采用樹皮為基質(zhì)，相同的水肥管理，種植30 d后兩種培養(yǎng)方式下的種苗煉苗成活率反應(yīng)器高達100%，而固體培養(yǎng)的為95%，并且發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器培養(yǎng)的種苗更早長出新芽，生長狀態(tài)優(yōu)于固體培養(yǎng)。

A：反應(yīng)器培養(yǎng)90 d；B：反應(yīng)器中培養(yǎng)90 d的組培苗；C：固體培養(yǎng)90 d；D：固體培養(yǎng)90 d的組培苗。A: Plant bioreactor culture for 90 d; B: Plantlets in plant bioreactor for 90 d; C: semi-solid culture for 90 d; D: Plantlets in semi-solid medium for 90 d.圖4 不同培養(yǎng)方式對金釵石斛組培苗的比較(bar=2 cm)Fig.4 Comparison of different culture methods for tissue culture of D. nobile(bar=2 cm)

3 討論

金釵石斛是石斛中的名貴品種，目前野生金釵石斛已越來越少，人工種植已經(jīng)有較大規(guī)模，因此優(yōu)質(zhì)種苗的生產(chǎn)成本關(guān)鍵。

目前，金釵石斛種苗的生產(chǎn)方式有兩種：一是莖節(jié)扦插的方式，該方法簡單、成活率高，但也導(dǎo)致致病微生物的富集，種苗質(zhì)量逐年降低的問題[16]；二是利用植物組織培養(yǎng)方法進行種苗的生產(chǎn)，但目前大多采用的是一種以玻璃或塑料瓶為容器、瓊脂為支撐物的固體培養(yǎng)，容器的密閉性導(dǎo)致無法進行有效的氣體交換，組培苗生長受到抑制[17]，為了便于操作和避免污染容器一般較小，所能提供的營養(yǎng)物質(zhì)有限，在培養(yǎng)的過程中需要將組培苗不斷的轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中來保證其正常生長，因此,需要大量的人工、物料等投入，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高[18]。

間歇浸沒式植物生物反應(yīng)器是在傳統(tǒng)的植物固體和液體組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機械動力、程序控制等實現(xiàn)了半自動培養(yǎng)的一種方法[19]。該方法采用液體培養(yǎng)實現(xiàn)了培養(yǎng)容器的增大和營養(yǎng)物質(zhì)的高效利用[20]，采用無菌空氣壓縮產(chǎn)生的氣壓驅(qū)動液體培養(yǎng)基流動并實現(xiàn)容器內(nèi)外氣體的有效交換[21]，從而實現(xiàn)了培養(yǎng)周期的縮短和組培苗的更健康生長，提高了生產(chǎn)效率、降低了生產(chǎn)成本，并且由于培養(yǎng)容器的增大和容器的串并聯(lián)，實現(xiàn)了高通量的培養(yǎng)。

間歇浸沒式植物生物反應(yīng)器的重要培養(yǎng)參數(shù)是浸沒頻率、接種量和培養(yǎng)基蔗糖溶度。其中，浸沒頻率決定了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收是否充分，組培苗的玻璃化與否，相關(guān)報道表明，較高的浸沒頻率(≥1 h/6 h)適宜塊根塊莖的形成，較低的浸沒時間(≤1 min/12 h)能夠促進體細胞胚體的形成，而兩者之間的浸沒頻率適宜種苗的生長[22-23]，本文篩選的金釵石斛種苗培養(yǎng)的最適浸沒頻率為5 min/8 h，符合這一規(guī)律。接種量決定了培養(yǎng)容器的空間利用率和組培苗的生長狀態(tài)，接種量過低，成苗后的容器空間沒有完全利用造成浪費，接種量過高，組培苗相互擁擠，不能正常生長，如白芨種苗的培養(yǎng)[24]，本文以金釵石斛原球莖為外植體，優(yōu)選到最適的接種量為10 g·L-1，接種量過高或過低不不利于種苗的培養(yǎng)。培養(yǎng)基蔗糖濃度決定了組培苗是否能夠健康生長，一般情況下蔗糖濃度偏低組培苗弱小，容易出現(xiàn)褐化，蔗糖濃度過高，組培苗徒長，加重玻璃化情況[25]，本文篩選的最適培養(yǎng)基蔗糖濃度為20 g·L-1，在此濃度下金釵石斛種苗生長健康。通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，間歇浸沒式植物生物反應(yīng)器已成功應(yīng)用于多種植物的培養(yǎng)中，但不同的植物的生活習(xí)性不同，培養(yǎng)條件各不相同，需對每一種植物的培養(yǎng)參數(shù)進行優(yōu)化。

本文進行了間歇浸沒式植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)金釵石斛種苗的重要的培養(yǎng)參數(shù)的優(yōu)化，建立了金釵石斛間歇浸沒液體培養(yǎng)體系，為金釵石斛優(yōu)質(zhì)種苗的生產(chǎn)提供一種高效率、低成本的方法。