枯草芽孢桿菌DNKAS對加工番茄分枝列當?shù)姆乐螒?/h1>
2020-03-15 10:50:04崔華星王寧侯敏許俊鋒郭文超安康陳陽輝崔衛(wèi)東
中國農(nóng)業(yè)科技導報 2020年12期
崔華星,王寧,侯敏,許俊鋒,郭文超,安康,陳陽輝,崔衛(wèi)東*
(1.新疆大學生命科學與技術學院, 烏魯木齊 830001； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所,烏魯木齊 830001；3.新疆農(nóng)業(yè)科學院新疆特殊環(huán)境微生物試驗室， 烏魯木齊 830001；4.北京達農(nóng)生物科技有限公司， 北京 100043)
分枝列當(Orobancheaegyptiaca)是多年生、兩年生或一年生肉質(zhì)寄生草本，可廣泛寄生于西瓜、甜瓜、向日葵、加工番茄等作物上，會吸收寄主養(yǎng)分、生長激素和水分以維持自身生長，導致寄主作物生長緩慢、抵御病蟲害能力降低、作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降、減產(chǎn)甚至絕收[1-2]。新疆維吾爾自治區(qū)是受分枝列當肆虐最嚴重的地區(qū)之一，遍布南北疆各地，嚴重危害加工番茄種植加工產(chǎn)業(yè)，每年受分枝列當影響的加工番茄種植面積約為7 000 hm2 [3]，個別地塊寄生率達100%，導致加工番茄絕收。
目前，分枝列當主要防治措施有調(diào)整播期[4]、播種捕獲作物或誘捕作物[5]、土壤深耕[6]、培育抗性品種[7]、化學防治[8-9]等。然而，單一使用這些防治措施效果都不理想。調(diào)整播期和播種捕獲或誘捕作物雖然可以減輕列當危害，但在一些地區(qū)由于氣候原因很難執(zhí)行；土壤深耕十幾年內(nèi)只能用一次，防治效果降低；培育抗性品種是防治分枝列當?shù)挠行Т胧┲?，由于我國對加工番茄抗分枝列當品種選育的研究相對滯后，且抗性品種影響加工番茄部分指標，形成成熟品種非常困難；化學防治不僅會污染土壤，而且劑量使用不當也會影響寄主作物生長[10]。微生物防治具有防治效果好[11]、環(huán)境友好、不易產(chǎn)生耐藥性、提高作物產(chǎn)量[12]、可在列當出土前進行防治[13]等特點，有利于發(fā)展可持續(xù)性農(nóng)業(yè)，越來越引起人們的重視。
生防菌是防治列當?shù)闹匾椒ㄖ??？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)廣泛應用于植物病防治，并取得良好效果，但用于列當防治的研究較少。了解枯草芽孢桿菌在大田中的代謝情況，有利于枯草芽孢桿菌對列當?shù)姆乐螒?。Biolog-ECO技術是根據(jù)微生物單一碳源代謝表型進行分析，通過對數(shù)字化的平板圖像進行顏色響應來研究微生物的代謝功能多樣性[14-15]。顧美英等[16]通過Biolog-ECO技術分析不同腐爛病發(fā)病程度核桃根區(qū)土壤，發(fā)現(xiàn)腐爛病發(fā)病程度較重的土壤中微生物活性低于健康和腐爛病發(fā)病程度較輕的土壤。當前，關于枯草芽孢桿菌在列當田中代謝情況研究，鮮有報導。本研究選用枯草芽孢桿菌DNKAS菌株作為生防菌，通過皿內(nèi)種子發(fā)芽抑制試驗來驗證其抗列當性能，隨后為掌握大田中菌種施用的最佳劑量，從微生物群落系統(tǒng)功能角度，運用Biolog-ECO 技術分析不同處理條件下的土壤微生物功能多樣性、碳源利用情況和微生物代謝多樣性的關系，為枯草芽孢桿菌更好地防治分枝列當提供研究基礎。
1 材料與方法
1.1 試驗材料與試劑
試驗菌株為枯草芽孢桿菌DNKAS，由北京達農(nóng)生物科技有限公司提供；人工合成獨腳金內(nèi)酯類似物GR24，購自北京酷來搏科技有限公司；DNKAS菌粉，由北京達農(nóng)生物科技有限公司生產(chǎn)，施用劑型為可濕性粉劑，活菌數(shù)達 1×1011CFU·g-1；黃腐酸鉀，購自新疆雙龍腐植酸有限公司；番茄品種為‘TH1601’，由中糧吉木薩爾番茄公司提供；NA、NB和PDA培養(yǎng)基，均購自青島高科園海博生物技術有限公司。
1.2 樣品采集
試驗地點位于新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州吉木薩爾縣(N43°59′51″, E89°4′45″)，屬中溫帶大陸干旱氣候，冬季寒冷、夏季炎熱，降雨量少，晝夜溫差大，平均年日照時數(shù)為2 861.1 h，年平均氣溫7.0 ℃。品質(zhì)檢測所用材料為各處理的成熟加工番茄果實，所需樣品土壤采集自去除表層深10～20 cm的根際土壤，四分法采樣后放入PE袋中帶回，放入4 ℃冰箱保存，用于微生物及土壤理化性質(zhì)分析。
1.3 儀器與設備
SPX-420BF-2生化培養(yǎng)箱，上海?，斣囼炘O備有限公司；1506Biolog-ECO 板和微生物自動鑒定系統(tǒng)，美國 Biolog 公司；JP-150Y超聲波細胞粉碎機，無錫久平儀器有限公司；L6S分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；DFY300A搗碎機，無錫萊浦儀器設備有限公司；TD-380折射儀，上海雙旭電子有限公司；YS6060番茄紅素色差儀，深圳市三恩時科技有限公司；CT-6321 pH計，上海儀電分析儀器有限公司；HK2玻璃糖漿錘度計, 濰坊祥意化工有限公司；MZ101體式顯微鏡，廣州市明美光電技術有限公司。
1.4 試驗方法
1.4.1皿內(nèi)芽管生長抑制試驗 ①分枝列當種子的表面消毒和預培養(yǎng)。將分枝列當種子用質(zhì)量體積比1∶100的次氯酸鈉溶液和75%的乙醇中分別超聲清洗5.0 min。用無菌水沖洗至無色后將分枝列當種子置于超凈工作臺自然晾干。先將直徑為8.0 mm的玻璃纖維濾紙片擺放于事先放有2層濕潤普通定性濾紙的直徑為9.0 cm的培養(yǎng)皿中，隨后將己經(jīng)晾干的分枝列當種子均勻撒于玻璃纖維濾紙片上，每個濾紙片上約40～70粒種子。將上述培養(yǎng)皿封口后置于25 ℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)5 d，待用。
②無細胞發(fā)酵液制備。首先，將DNKAS菌株接種于NA培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h。隨后，挑取適量菌株接種至己滅菌、裝有50.0 mL NB培養(yǎng)基的200 mL三角瓶中。用培養(yǎng)膜封口后，將上述三角瓶放置于37 ℃、150 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng)，同時以不接種微生物的NB液體培養(yǎng)基作為對照。振蕩培養(yǎng)18 h后，取三角瓶中的培養(yǎng)液30 mL，5 500 r·min-1離心7 min，離心后的菌液經(jīng)0.45 nm微孔濾膜過濾。過濾后瓶中的無細胞發(fā)酵濾液視為原液。將無細胞發(fā)酵濾液原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。
③菌體水提取液制備。離心后的菌體加無菌水至30 mL，經(jīng)超聲細胞粉碎機粉碎，粉碎后的菌液經(jīng)0.45 nm的微孔膜過濾視為原液，原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。
④菌體甲醇提取液制備。離心后的菌體加甲醇至30 mL, 經(jīng)超聲細胞粉碎機粉碎，粉碎后的菌液經(jīng)0.45 nm的微孔膜過濾視為原液，原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。
列當芽管長度用明美顯微鏡成像系統(tǒng)自帶測量軟件進行測量。
⑤分枝列當種子芽管萌發(fā)試驗。萌發(fā)試驗設置4個處理，分別為0.1 mg·L-1GR24(GR24)、無細胞發(fā)酵濾液(CF)、菌體甲醇提取液(BM)和菌體水提取液(BW)，其中，GR24為分支列當種子的萌發(fā)刺激物；菌體甲醇提取液為，取30 μL菌體甲醇提取液，待甲醇揮發(fā)后，加30 μL無菌水。同時，將無細胞發(fā)酵濾液、菌體水提取液和菌體甲醇提取液分別稀釋為1、10、100、1 000倍。將一片直徑為8.0 mm的玻璃纖維濾紙片擺放于培養(yǎng)皿中，依次添加30 μL種子萌發(fā)處理液和1片己經(jīng)預培養(yǎng)好的分枝列當種子片于上述玻璃纖維濾紙片上。培養(yǎng)皿中部放1張對折3次的濕潤濾紙片保濕，然后將培養(yǎng)皿用封口膜封口。各處理6片重復。隨后將培養(yǎng)皿置于25 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，9 d后，用顯微鏡觀察分枝列當種子芽管生長情況。
1.4.2田間小區(qū)試驗 設置清水對照(CK)、3 kg·hm-2DNKAS菌劑(D3)、4.5 kg·hm-2DNKAS菌劑(D4.5)、6 kg·hm-2DNKAS菌劑(D6)、9 kg·hm-2DNKAS菌劑(D9)、12 kg·hm-2DNKAS菌劑(D12)、7.5 kg·hm-2黃腐酸鉀(FA-K)、4.5 kg·hm-2DNKAS菌劑+7.5 kg·hm-2黃腐酸鉀(D4.5+ FA-K) 共8個處理，每個處理3次重復，共計27個小區(qū)，各小區(qū)隨機區(qū)組排列。每小區(qū)長70 m，寬1.5 m，面積 105 m2。各藥劑分4次隨水滴灌，時間分別為5月6日(番茄移栽時)、5月27日、6月7日、6月27日。待番茄生長中期分枝列當出土后，每小區(qū)全部采樣，調(diào)查分枝列當發(fā)生情況，計算寄生強度和防效。8月12日采收時，每小區(qū)取4.5 m2測產(chǎn)。
寄生數(shù) = 鮮活分枝列當數(shù)+枯死分枝列當數(shù)
寄生強度 = 分枝列當總株數(shù) / 被寄生的寄主株數(shù)
防治效果 =(對照寄生度-處理寄生度)/對照寄生度×100%
選擇色澤均勻、大小均一、成熟度一致的番茄紅色果實，每小區(qū)隨機取15個，每個果實縱切成4等份，各取其中的1/4放入搗碎機，以12 000 r·min-1轉速1 min勻漿，用于測定相關指標?？扇苄怨绦挝锖坎捎谜凵鋬x法[17]測定；可滴定酸含量采用NaOH滴定法[18]測定；a/b色差值采用番茄紅素色差儀[19]測定；粘度采用旋轉粘度測定法[20]；pH采用pH計測定；霉菌數(shù)采用稀釋平板涂布法[21]測定。
1.4.3土壤微生物群落碳源代謝利用測定 根際土壤微生物采用Biolog-ECO微平板方法[22]進行，并適當調(diào)整。選取防效效果好的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理，分別稱取各類土樣5 g，加入到裝有50 mL滅菌的無菌水中，置于28 ℃搖床上180 r·min-1振蕩30 min，使土壤充分混勻后靜置15 min，采用梯度稀釋法將土壤懸液稀釋至1 000倍。取上述土壤稀釋液150 μL接種到生態(tài)板中，并將接種好的Biolog-ECO板放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168 h時，用Biolog鑒定系統(tǒng)測定590 nm波長下的吸光度，將測得數(shù)據(jù)進行每孔平均顏色變化率(average well color development, AWCD)分析。
AWCD=∑(Ci-R)/31
式中，Ci是每個孔的吸光度，R是板內(nèi)控制孔的吸光度。
選擇Biolog-Eco微平板培養(yǎng)120 h的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理的培養(yǎng)土壤懸液，進行6大類碳源利用情況分析；同時對土壤微生物檢測結果進行微生物群落功能多樣性分析，用Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和McIntosh 指數(shù)來表征。
1.5 數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)預處理利用Microsoft Excel 2016，方差分析采用SPSS 19.0軟件，采用單因素方差分析 (One-Way ANOVA)、Duncan法和Bonferroni法進行多重比較分析。主成分分析、多樣性指數(shù)分析采用DPS v9.50軟件。
2 結果與分析
2.1 不同處理對分枝列當芽管生長的影響
由表1可以看出，無細胞發(fā)酵濾液(CF)、菌體甲醇提取液(BM)和菌體水提取液(BW)處理的分枝列當芽長均隨稀釋倍數(shù)的的升高而變長，同一種處理液的原液、10倍、100倍和1 000倍處理間均差異顯著。在稀釋倍數(shù)為1×、10×和100×時，CF、BM、BW三種處理溶液間均表現(xiàn)為BW和BM的分枝列當芽長顯著高于CF，表明CF的分枝列當芽長抑制效果優(yōu)于BW和BM，稀釋倍數(shù)為1×、10×、100×的無細胞發(fā)酵液的分枝列當芽長抑制率分別為100%、83.85%和52.02%；稀釋倍數(shù)為1×、10×、100×的甲醇提取液的分枝列當芽長抑制率分別為83.07%、51.93%和34.19%；稀釋倍數(shù)為1×、10×和100×的水提取液的分枝列當芽長抑制率分別為72.40%、50.87%和27.81%；在稀釋倍數(shù)為1 000×時，CF、BM、BW三種處理溶液的分枝列當芽長無顯著差異，且與GR24處理間無差異顯著，即1 000×的CF、BM和BW處理對于分枝列當芽長無抑制作用。結果表明，枯草芽孢桿菌DNKAS可以抑制分枝列當芽管生長，其中，無細胞發(fā)酵液抑制效果最好，甲醇提取液次之，水提取液最弱。進一步證明，生防菌DNKAS對分枝列當抑制效果最佳的物質(zhì)可能為細胞次生代謝產(chǎn)物，其次是胞內(nèi)脂溶性物質(zhì)，胞內(nèi)水溶性物質(zhì)抑制效果最差。
表1 不同處理的分枝列當芽長Table 1 Length of Orobanche aegyptiaca germ tube in different treatments (μm)
2.2 不同處理的小區(qū)防治效果
分枝列當?shù)男^(qū)防治效果結果(表2)顯示，各處理均能顯著降低分枝列當?shù)募纳鷶?shù)和寄生度，均具有良好的防治效果。其中，D12、D9、D6、D4.5、FA-K和D4.5+FA-K處理的防治效果分別為52.33%、47.89%、35.66%、28.03%、41.44%和47.22%，分枝列當寄生數(shù)分別降低52.36%、47.92%、35.65%、24.05%、41.44%、47.24%，寄生度分別降低52.20%、47.79%、35.66%、28.30%、41.17%、47.42%；6個處理間無顯著差異。D3的防治效果為24.09%，寄生數(shù)與CK相比無顯著差異，但寄生度較CK顯著降低了24.26%?？梢姡S著菌劑劑量的加大，分枝列當寄生數(shù)量和寄生度均有明顯下降，防治效果有所提高。與FA-K相比，D4.5+FA-K的防治效果提高了14%，而寄生數(shù)和寄生度降低約10%，但是無顯著差異。與D4.5相比，D4.5+FA-K的防治效果顯著提高48.98%，寄生數(shù)和寄生度分別降低26.51%和26.67%，但是無顯著差異。
表2 不同處理的分枝列當防治效果Table 2 Control effectes of Orobanche aegyptiaca in field experiment of different treatments
2.3 不同處理對小區(qū)產(chǎn)量的影響
不同處理的小區(qū)產(chǎn)量結果(圖1)表明，各處理的加工番茄小區(qū)產(chǎn)量均顯著高于CK處理，均具有增產(chǎn)效果。其中，D4.5+FA-K處理的產(chǎn)量最高，為136 665 kg·hm-2，顯著高于D3、D4.5、D6、FA-K和CK處理，但是與D9、D12沒有顯著差異。D4.5+FA-K、D9和D12三個處理的產(chǎn)量較CK分別增加60.25%、56.48%和43.52%。純菌劑處理中，D12的產(chǎn)量最高，為133 445 kg·hm-2，與D9和D6間無顯著差異。D4.5、D3和FA-K處理的產(chǎn)量雖在幾個處理中最低，但是仍顯著高于CK處理，分別比CK顯著增加31.89%、22.96%和17.68%，可見，番茄產(chǎn)量與菌劑施用量存在一定的正相關關系。D4.5+FA-K與 FA-K相比顯著增產(chǎn)17.26%，與D4.5相比，產(chǎn)量顯著提高21.51%，表明黃腐酸鉀和菌劑混合施用，比單一施用黃腐酸鉀效果更好。
注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義。Note: Different lowercase letters indicate statistically significant differences between different treatments at P<0.05 level.圖1 不同處理的小區(qū)產(chǎn)量Fig.1 Yield of plot in different treatments
2.4 不同處理對加工番茄果實品質(zhì)的影響
番茄果實的品質(zhì)性狀檢測結果(表3)顯示，各處理中，可溶固形物含量在4.5～5.0之間，粘稠度小于15，pH均在4.6以下，霉菌數(shù)為2，色差均大于2.0，符合國家標準[23]。表明添加菌劑和黃腐酸均未對果品產(chǎn)生不良影響。
表3 不同處理的番茄品質(zhì)Table 3 Tomato quality indexes of processing tomato in different treatments
2.5 不同處理的根際土壤微生物功能多樣性
2.5.1根際土壤微生物群落的AWCD值
AWCD值越高，說明土壤微生物群落的代謝活性越旺盛。不同時間不同處理的AWCD值結果見圖2，可見，5個處理的AWCD值整體隨時間推移的變化趨勢一致，在培養(yǎng)24～120 h時，呈升高趨勢，120 h時達到峰值，表明此階段的土壤微生物數(shù)處于對數(shù)期，活性增加較快，利用碳源能力強；培養(yǎng)120 h之后，AWCD值逐漸下降，說明各個處理的微生物生長進入對數(shù)生長中后期，并且D9、D12、FA-K和D4.5+FA-K處理的微生物數(shù)量均高于CK處理。不同處理的AWCD值存在一定差別。從0～168 h的AWCD值來看，土壤微生物群落代謝活性在120 h最高。與CK相比，D4.5+FA-K、FA-K、D12和D9處理的微生物活性依次增加了18.6%、10.2%、8.8%和3.4%。
圖2 不同處理的根際土壤微生物群落的AWCDFig.2 Microbial community AWCD of rhizosphere soil in different treatments
2.5.2根際微生物群落的碳源利用 根據(jù)不同處理AWCD值的變化情況，選擇120 h的根際土壤進行6類碳源的微生物利用分析，結果(圖3)顯示，D12處理的胺類、酚酸類、氨基酸和碳水化合物類利用情況高于D9，然而兩處理只有氨基酸利用情況低于CK。D12多聚物和羧酸類利用情況低于D9，但唯獨D12處理的羧酸類利用情況低于CK。D4.5+FA-K處理的6類碳源利用率均明顯高于FA-K，且D4.5+FA-K和FA-K處理的胺類、酚酸類、多聚物類和碳水化合物類利用情況均高于CK。D4.5+FA-K處理的羧酸類和氨基酸利用情況高于CK，但FA-K處理的羧酸類和氨基酸利用情況低于CK。
圖3 不同處理的根際土壤微生物群落對6類碳源的利用占比Fig.3 Utilization percentage of 6 types carbon sources by microbial communities of rhizosphere soil in different treatments
2.5.3根際微生物群落的微生物多樣性指數(shù)
優(yōu)勢度指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)是常用的群落多樣性分析指標。優(yōu)勢度指數(shù)反映各物種的種群數(shù)量變化情況，指數(shù)越大，說明群落內(nèi)物種數(shù)量分布越不均勻，優(yōu)勢種的地位越突出。豐富度指數(shù)用于表征微生物群落的種類多樣性。均勻度指數(shù)用以反映土壤利用碳源種類和程度差異，均勻度越大表明微生物種群對碳源利用差異越大。對培養(yǎng)120 h的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理的AWCD值，進行微生物多樣性分析，結果(表4)顯示，D12、FA-K和D4.5+FA-K處理的豐富度指數(shù)較高，顯著高于CK處理，但3個處理間無顯著差異。D9的豐富度指數(shù)與CK間無顯著差異，D4.5+FA-K的豐富度指數(shù)與FA-K無顯著差異。不同處理間的優(yōu)勢度指數(shù)和均勻度指數(shù)均無顯著差異。結果表明，DNKAS菌劑和黃腐酸鉀均可增加根際土壤的微生物種類，但是對于建立菌群優(yōu)勢地位和碳源的利用程度沒有影響。
表4 不同處理根際土壤的微生物多樣性指數(shù)Table 4 Microbial community diversity indexes in different treatmments
3 討論
目前，對于列當?shù)奈⑸锓乐沃饕\用列當病原菌，能取得良好的防治效果。王亞嬌等[24]從感病的列當中分離出尖孢鐮刀菌Br-2，大田試驗顯示對彎管列當防治率高達58.27%。吳元華等[25]將自主分離純化得到的生防鐮刀菌用于煙田列當防治試驗，發(fā)現(xiàn)不僅可以推遲列當出土時間，還能達到62.44%的防治率。對土傳病害拮抗菌進行列當防治的研究較少?？莶菅挎邨U菌對環(huán)境有較強的適應性，具有可在植物或土壤上大量繁殖和定植、競爭營養(yǎng)位點和空間位點、誘導抗性、促生和增產(chǎn)等特性，廣泛用于植物病害防治[26]，擁有作為列當生防菌的潛力。阻止列當芽管伸長，是列當防治的主要方式之一。本研究表明，枯草芽孢桿菌DNKAS的無細胞發(fā)酵液、菌體甲醇提取液、菌體水提取液對分枝列當?shù)难抗苌L具有顯著抑制作用。Barghouthi和Salman[27]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌QUBC16的無細胞發(fā)酵液可有效減少分枝列當芽管長度，與本研究結果一致。本研究中，無細胞發(fā)酵液對芽管生長抑制效果最佳，說明細胞次生代謝產(chǎn)物中有效物質(zhì)起主要作用。然而是何種物質(zhì)，還需進一步探究。
列當?shù)募纳鷶?shù)量和寄主作物產(chǎn)量是評判生防菌防治效果的關鍵指標。已有研究表明，密旋鏈霉菌[12]和灰黃青霉[28]均可減少分枝列當萌發(fā)率，使列當寄生數(shù)下降，寄主作物產(chǎn)量增加。田間小區(qū)試驗表明，枯草芽孢桿菌DNKAS通過降低分枝列當寄生數(shù)量，使加工番茄增產(chǎn)。結合皿內(nèi)試驗和田間小區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌DNKAS通過抑制分枝列當芽管生長，減少芽管與加工番茄根部接觸的概率，進而降低分枝列當出土數(shù)量，提高防治效果, 減輕分枝列當對加工番茄寄生的影響，使加工番茄增產(chǎn)。原因除了枯草芽孢桿菌可以減輕分枝列當?shù)奈：Γ€可能與枯草芽孢桿菌具有抗病、促生作用有關?；谔镩g小區(qū)試驗結果，枯草芽孢桿菌DNKAS的單次施用量低于4.5 kg·hm-2，不能形成優(yōu)勢菌群，而高于12 kg·hm-2，菌劑成本太高，綜合考慮認為，合理的使用劑量為9～12 kg·hm-2。為降低人工成本和時間成本，建議用隨水滴灌藥劑進行防治。
Biolog-ECO微平板法是研究微生物對生態(tài)環(huán)境影響的重要方式。研究[29]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Bs-15可使板栗土壤中微生物活性增加，顯著提高優(yōu)勢度指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)。本研究的Biolog-ECO微平板試驗發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀均可增加土壤微生物活性、碳源總利用率、微生物數(shù)量和種類；同時，枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀枯草芽孢桿菌DNKAS的微生物豐富度指數(shù)高于CK，而優(yōu)勢度指數(shù)和均勻度指數(shù)與CK無顯著差異。表明枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀均具有調(diào)整土壤微生物群落結構，使土壤中微生態(tài)功能更加趨于穩(wěn)定的功能[29-30]。
目前，黃腐酸鉀在國內(nèi)主要用于作物增產(chǎn)、提升品質(zhì)和改良土壤，本研究發(fā)現(xiàn)黃腐酸鉀可用于列當?shù)姆乐?。研究表明，黃腐酸鉀具有促生、抗病、抗旱、提高過氧化物酶酶活等作用[31]，而根部土壤微生物群落結構的改變和過氧化物酶活性的升高，對列當寄生和生長有抑制作用[32]。因此，黃腐酸鉀可以減少分枝列當?shù)募纳l(fā)生，促進加工番茄增產(chǎn)。
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崔華星,王寧,侯敏,許俊鋒,郭文超,安康,陳陽輝,崔衛(wèi)東*
(1.新疆大學生命科學與技術學院, 烏魯木齊 830001； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所,烏魯木齊 830001；3.新疆農(nóng)業(yè)科學院新疆特殊環(huán)境微生物試驗室， 烏魯木齊 830001；4.北京達農(nóng)生物科技有限公司， 北京 100043)
分枝列當(Orobancheaegyptiaca)是多年生、兩年生或一年生肉質(zhì)寄生草本，可廣泛寄生于西瓜、甜瓜、向日葵、加工番茄等作物上，會吸收寄主養(yǎng)分、生長激素和水分以維持自身生長，導致寄主作物生長緩慢、抵御病蟲害能力降低、作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降、減產(chǎn)甚至絕收[1-2]。新疆維吾爾自治區(qū)是受分枝列當肆虐最嚴重的地區(qū)之一，遍布南北疆各地，嚴重危害加工番茄種植加工產(chǎn)業(yè)，每年受分枝列當影響的加工番茄種植面積約為7 000 hm2 [3]，個別地塊寄生率達100%，導致加工番茄絕收。
目前，分枝列當主要防治措施有調(diào)整播期[4]、播種捕獲作物或誘捕作物[5]、土壤深耕[6]、培育抗性品種[7]、化學防治[8-9]等。然而，單一使用這些防治措施效果都不理想。調(diào)整播期和播種捕獲或誘捕作物雖然可以減輕列當危害，但在一些地區(qū)由于氣候原因很難執(zhí)行；土壤深耕十幾年內(nèi)只能用一次，防治效果降低；培育抗性品種是防治分枝列當?shù)挠行Т胧┲?，由于我國對加工番茄抗分枝列當品種選育的研究相對滯后，且抗性品種影響加工番茄部分指標，形成成熟品種非常困難；化學防治不僅會污染土壤，而且劑量使用不當也會影響寄主作物生長[10]。微生物防治具有防治效果好[11]、環(huán)境友好、不易產(chǎn)生耐藥性、提高作物產(chǎn)量[12]、可在列當出土前進行防治[13]等特點，有利于發(fā)展可持續(xù)性農(nóng)業(yè)，越來越引起人們的重視。
生防菌是防治列當?shù)闹匾椒ㄖ??？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)廣泛應用于植物病防治，并取得良好效果，但用于列當防治的研究較少。了解枯草芽孢桿菌在大田中的代謝情況，有利于枯草芽孢桿菌對列當?shù)姆乐螒?。Biolog-ECO技術是根據(jù)微生物單一碳源代謝表型進行分析，通過對數(shù)字化的平板圖像進行顏色響應來研究微生物的代謝功能多樣性[14-15]。顧美英等[16]通過Biolog-ECO技術分析不同腐爛病發(fā)病程度核桃根區(qū)土壤，發(fā)現(xiàn)腐爛病發(fā)病程度較重的土壤中微生物活性低于健康和腐爛病發(fā)病程度較輕的土壤。當前，關于枯草芽孢桿菌在列當田中代謝情況研究，鮮有報導。本研究選用枯草芽孢桿菌DNKAS菌株作為生防菌，通過皿內(nèi)種子發(fā)芽抑制試驗來驗證其抗列當性能，隨后為掌握大田中菌種施用的最佳劑量，從微生物群落系統(tǒng)功能角度，運用Biolog-ECO 技術分析不同處理條件下的土壤微生物功能多樣性、碳源利用情況和微生物代謝多樣性的關系，為枯草芽孢桿菌更好地防治分枝列當提供研究基礎。
1 材料與方法
1.1 試驗材料與試劑
試驗菌株為枯草芽孢桿菌DNKAS，由北京達農(nóng)生物科技有限公司提供；人工合成獨腳金內(nèi)酯類似物GR24，購自北京酷來搏科技有限公司；DNKAS菌粉，由北京達農(nóng)生物科技有限公司生產(chǎn)，施用劑型為可濕性粉劑，活菌數(shù)達 1×1011CFU·g-1；黃腐酸鉀，購自新疆雙龍腐植酸有限公司；番茄品種為‘TH1601’，由中糧吉木薩爾番茄公司提供；NA、NB和PDA培養(yǎng)基，均購自青島高科園海博生物技術有限公司。
1.2 樣品采集
試驗地點位于新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州吉木薩爾縣(N43°59′51″, E89°4′45″)，屬中溫帶大陸干旱氣候，冬季寒冷、夏季炎熱，降雨量少，晝夜溫差大，平均年日照時數(shù)為2 861.1 h，年平均氣溫7.0 ℃。品質(zhì)檢測所用材料為各處理的成熟加工番茄果實，所需樣品土壤采集自去除表層深10～20 cm的根際土壤，四分法采樣后放入PE袋中帶回，放入4 ℃冰箱保存，用于微生物及土壤理化性質(zhì)分析。
1.3 儀器與設備
SPX-420BF-2生化培養(yǎng)箱，上海?，斣囼炘O備有限公司；1506Biolog-ECO 板和微生物自動鑒定系統(tǒng)，美國 Biolog 公司；JP-150Y超聲波細胞粉碎機，無錫久平儀器有限公司；L6S分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；DFY300A搗碎機，無錫萊浦儀器設備有限公司；TD-380折射儀，上海雙旭電子有限公司；YS6060番茄紅素色差儀，深圳市三恩時科技有限公司；CT-6321 pH計，上海儀電分析儀器有限公司；HK2玻璃糖漿錘度計, 濰坊祥意化工有限公司；MZ101體式顯微鏡，廣州市明美光電技術有限公司。
1.4 試驗方法
1.4.1皿內(nèi)芽管生長抑制試驗 ①分枝列當種子的表面消毒和預培養(yǎng)。將分枝列當種子用質(zhì)量體積比1∶100的次氯酸鈉溶液和75%的乙醇中分別超聲清洗5.0 min。用無菌水沖洗至無色后將分枝列當種子置于超凈工作臺自然晾干。先將直徑為8.0 mm的玻璃纖維濾紙片擺放于事先放有2層濕潤普通定性濾紙的直徑為9.0 cm的培養(yǎng)皿中，隨后將己經(jīng)晾干的分枝列當種子均勻撒于玻璃纖維濾紙片上，每個濾紙片上約40～70粒種子。將上述培養(yǎng)皿封口后置于25 ℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)5 d，待用。
②無細胞發(fā)酵液制備。首先，將DNKAS菌株接種于NA培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h。隨后，挑取適量菌株接種至己滅菌、裝有50.0 mL NB培養(yǎng)基的200 mL三角瓶中。用培養(yǎng)膜封口后，將上述三角瓶放置于37 ℃、150 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng)，同時以不接種微生物的NB液體培養(yǎng)基作為對照。振蕩培養(yǎng)18 h后，取三角瓶中的培養(yǎng)液30 mL，5 500 r·min-1離心7 min，離心后的菌液經(jīng)0.45 nm微孔濾膜過濾。過濾后瓶中的無細胞發(fā)酵濾液視為原液。將無細胞發(fā)酵濾液原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。
③菌體水提取液制備。離心后的菌體加無菌水至30 mL，經(jīng)超聲細胞粉碎機粉碎，粉碎后的菌液經(jīng)0.45 nm的微孔膜過濾視為原液，原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。
④菌體甲醇提取液制備。離心后的菌體加甲醇至30 mL, 經(jīng)超聲細胞粉碎機粉碎，粉碎后的菌液經(jīng)0.45 nm的微孔膜過濾視為原液，原液稀釋10、100、1 000倍后，備用。
列當芽管長度用明美顯微鏡成像系統(tǒng)自帶測量軟件進行測量。
⑤分枝列當種子芽管萌發(fā)試驗。萌發(fā)試驗設置4個處理，分別為0.1 mg·L-1GR24(GR24)、無細胞發(fā)酵濾液(CF)、菌體甲醇提取液(BM)和菌體水提取液(BW)，其中，GR24為分支列當種子的萌發(fā)刺激物；菌體甲醇提取液為，取30 μL菌體甲醇提取液，待甲醇揮發(fā)后，加30 μL無菌水。同時，將無細胞發(fā)酵濾液、菌體水提取液和菌體甲醇提取液分別稀釋為1、10、100、1 000倍。將一片直徑為8.0 mm的玻璃纖維濾紙片擺放于培養(yǎng)皿中，依次添加30 μL種子萌發(fā)處理液和1片己經(jīng)預培養(yǎng)好的分枝列當種子片于上述玻璃纖維濾紙片上。培養(yǎng)皿中部放1張對折3次的濕潤濾紙片保濕，然后將培養(yǎng)皿用封口膜封口。各處理6片重復。隨后將培養(yǎng)皿置于25 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，9 d后，用顯微鏡觀察分枝列當種子芽管生長情況。
1.4.2田間小區(qū)試驗 設置清水對照(CK)、3 kg·hm-2DNKAS菌劑(D3)、4.5 kg·hm-2DNKAS菌劑(D4.5)、6 kg·hm-2DNKAS菌劑(D6)、9 kg·hm-2DNKAS菌劑(D9)、12 kg·hm-2DNKAS菌劑(D12)、7.5 kg·hm-2黃腐酸鉀(FA-K)、4.5 kg·hm-2DNKAS菌劑+7.5 kg·hm-2黃腐酸鉀(D4.5+ FA-K) 共8個處理，每個處理3次重復，共計27個小區(qū)，各小區(qū)隨機區(qū)組排列。每小區(qū)長70 m，寬1.5 m，面積 105 m2。各藥劑分4次隨水滴灌，時間分別為5月6日(番茄移栽時)、5月27日、6月7日、6月27日。待番茄生長中期分枝列當出土后，每小區(qū)全部采樣，調(diào)查分枝列當發(fā)生情況，計算寄生強度和防效。8月12日采收時，每小區(qū)取4.5 m2測產(chǎn)。
寄生數(shù) = 鮮活分枝列當數(shù)+枯死分枝列當數(shù)
寄生強度 = 分枝列當總株數(shù) / 被寄生的寄主株數(shù)
防治效果 =(對照寄生度-處理寄生度)/對照寄生度×100%
選擇色澤均勻、大小均一、成熟度一致的番茄紅色果實，每小區(qū)隨機取15個，每個果實縱切成4等份，各取其中的1/4放入搗碎機，以12 000 r·min-1轉速1 min勻漿，用于測定相關指標?？扇苄怨绦挝锖坎捎谜凵鋬x法[17]測定；可滴定酸含量采用NaOH滴定法[18]測定；a/b色差值采用番茄紅素色差儀[19]測定；粘度采用旋轉粘度測定法[20]；pH采用pH計測定；霉菌數(shù)采用稀釋平板涂布法[21]測定。
1.4.3土壤微生物群落碳源代謝利用測定 根際土壤微生物采用Biolog-ECO微平板方法[22]進行，并適當調(diào)整。選取防效效果好的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理，分別稱取各類土樣5 g，加入到裝有50 mL滅菌的無菌水中，置于28 ℃搖床上180 r·min-1振蕩30 min，使土壤充分混勻后靜置15 min，采用梯度稀釋法將土壤懸液稀釋至1 000倍。取上述土壤稀釋液150 μL接種到生態(tài)板中，并將接種好的Biolog-ECO板放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168 h時，用Biolog鑒定系統(tǒng)測定590 nm波長下的吸光度，將測得數(shù)據(jù)進行每孔平均顏色變化率(average well color development, AWCD)分析。
AWCD=∑(Ci-R)/31
式中，Ci是每個孔的吸光度，R是板內(nèi)控制孔的吸光度。
選擇Biolog-Eco微平板培養(yǎng)120 h的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理的培養(yǎng)土壤懸液，進行6大類碳源利用情況分析；同時對土壤微生物檢測結果進行微生物群落功能多樣性分析，用Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和McIntosh 指數(shù)來表征。
1.5 數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)預處理利用Microsoft Excel 2016，方差分析采用SPSS 19.0軟件，采用單因素方差分析 (One-Way ANOVA)、Duncan法和Bonferroni法進行多重比較分析。主成分分析、多樣性指數(shù)分析采用DPS v9.50軟件。
2 結果與分析
2.1 不同處理對分枝列當芽管生長的影響
由表1可以看出，無細胞發(fā)酵濾液(CF)、菌體甲醇提取液(BM)和菌體水提取液(BW)處理的分枝列當芽長均隨稀釋倍數(shù)的的升高而變長，同一種處理液的原液、10倍、100倍和1 000倍處理間均差異顯著。在稀釋倍數(shù)為1×、10×和100×時，CF、BM、BW三種處理溶液間均表現(xiàn)為BW和BM的分枝列當芽長顯著高于CF，表明CF的分枝列當芽長抑制效果優(yōu)于BW和BM，稀釋倍數(shù)為1×、10×、100×的無細胞發(fā)酵液的分枝列當芽長抑制率分別為100%、83.85%和52.02%；稀釋倍數(shù)為1×、10×、100×的甲醇提取液的分枝列當芽長抑制率分別為83.07%、51.93%和34.19%；稀釋倍數(shù)為1×、10×和100×的水提取液的分枝列當芽長抑制率分別為72.40%、50.87%和27.81%；在稀釋倍數(shù)為1 000×時，CF、BM、BW三種處理溶液的分枝列當芽長無顯著差異，且與GR24處理間無差異顯著，即1 000×的CF、BM和BW處理對于分枝列當芽長無抑制作用。結果表明，枯草芽孢桿菌DNKAS可以抑制分枝列當芽管生長，其中，無細胞發(fā)酵液抑制效果最好，甲醇提取液次之，水提取液最弱。進一步證明，生防菌DNKAS對分枝列當抑制效果最佳的物質(zhì)可能為細胞次生代謝產(chǎn)物，其次是胞內(nèi)脂溶性物質(zhì)，胞內(nèi)水溶性物質(zhì)抑制效果最差。
表1 不同處理的分枝列當芽長Table 1 Length of Orobanche aegyptiaca germ tube in different treatments (μm)
2.2 不同處理的小區(qū)防治效果
分枝列當?shù)男^(qū)防治效果結果(表2)顯示，各處理均能顯著降低分枝列當?shù)募纳鷶?shù)和寄生度，均具有良好的防治效果。其中，D12、D9、D6、D4.5、FA-K和D4.5+FA-K處理的防治效果分別為52.33%、47.89%、35.66%、28.03%、41.44%和47.22%，分枝列當寄生數(shù)分別降低52.36%、47.92%、35.65%、24.05%、41.44%、47.24%，寄生度分別降低52.20%、47.79%、35.66%、28.30%、41.17%、47.42%；6個處理間無顯著差異。D3的防治效果為24.09%，寄生數(shù)與CK相比無顯著差異，但寄生度較CK顯著降低了24.26%?？梢姡S著菌劑劑量的加大，分枝列當寄生數(shù)量和寄生度均有明顯下降，防治效果有所提高。與FA-K相比，D4.5+FA-K的防治效果提高了14%，而寄生數(shù)和寄生度降低約10%，但是無顯著差異。與D4.5相比，D4.5+FA-K的防治效果顯著提高48.98%，寄生數(shù)和寄生度分別降低26.51%和26.67%，但是無顯著差異。
表2 不同處理的分枝列當防治效果Table 2 Control effectes of Orobanche aegyptiaca in field experiment of different treatments
2.3 不同處理對小區(qū)產(chǎn)量的影響
不同處理的小區(qū)產(chǎn)量結果(圖1)表明，各處理的加工番茄小區(qū)產(chǎn)量均顯著高于CK處理，均具有增產(chǎn)效果。其中，D4.5+FA-K處理的產(chǎn)量最高，為136 665 kg·hm-2，顯著高于D3、D4.5、D6、FA-K和CK處理，但是與D9、D12沒有顯著差異。D4.5+FA-K、D9和D12三個處理的產(chǎn)量較CK分別增加60.25%、56.48%和43.52%。純菌劑處理中，D12的產(chǎn)量最高，為133 445 kg·hm-2，與D9和D6間無顯著差異。D4.5、D3和FA-K處理的產(chǎn)量雖在幾個處理中最低，但是仍顯著高于CK處理，分別比CK顯著增加31.89%、22.96%和17.68%，可見，番茄產(chǎn)量與菌劑施用量存在一定的正相關關系。D4.5+FA-K與 FA-K相比顯著增產(chǎn)17.26%，與D4.5相比，產(chǎn)量顯著提高21.51%，表明黃腐酸鉀和菌劑混合施用，比單一施用黃腐酸鉀效果更好。
注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義。Note: Different lowercase letters indicate statistically significant differences between different treatments at P<0.05 level.圖1 不同處理的小區(qū)產(chǎn)量Fig.1 Yield of plot in different treatments
2.4 不同處理對加工番茄果實品質(zhì)的影響
番茄果實的品質(zhì)性狀檢測結果(表3)顯示，各處理中，可溶固形物含量在4.5～5.0之間，粘稠度小于15，pH均在4.6以下，霉菌數(shù)為2，色差均大于2.0，符合國家標準[23]。表明添加菌劑和黃腐酸均未對果品產(chǎn)生不良影響。
表3 不同處理的番茄品質(zhì)Table 3 Tomato quality indexes of processing tomato in different treatments
2.5 不同處理的根際土壤微生物功能多樣性
2.5.1根際土壤微生物群落的AWCD值
AWCD值越高，說明土壤微生物群落的代謝活性越旺盛。不同時間不同處理的AWCD值結果見圖2，可見，5個處理的AWCD值整體隨時間推移的變化趨勢一致，在培養(yǎng)24～120 h時，呈升高趨勢，120 h時達到峰值，表明此階段的土壤微生物數(shù)處于對數(shù)期，活性增加較快，利用碳源能力強；培養(yǎng)120 h之后，AWCD值逐漸下降，說明各個處理的微生物生長進入對數(shù)生長中后期，并且D9、D12、FA-K和D4.5+FA-K處理的微生物數(shù)量均高于CK處理。不同處理的AWCD值存在一定差別。從0～168 h的AWCD值來看，土壤微生物群落代謝活性在120 h最高。與CK相比，D4.5+FA-K、FA-K、D12和D9處理的微生物活性依次增加了18.6%、10.2%、8.8%和3.4%。
圖2 不同處理的根際土壤微生物群落的AWCDFig.2 Microbial community AWCD of rhizosphere soil in different treatments
2.5.2根際微生物群落的碳源利用 根據(jù)不同處理AWCD值的變化情況，選擇120 h的根際土壤進行6類碳源的微生物利用分析，結果(圖3)顯示，D12處理的胺類、酚酸類、氨基酸和碳水化合物類利用情況高于D9，然而兩處理只有氨基酸利用情況低于CK。D12多聚物和羧酸類利用情況低于D9，但唯獨D12處理的羧酸類利用情況低于CK。D4.5+FA-K處理的6類碳源利用率均明顯高于FA-K，且D4.5+FA-K和FA-K處理的胺類、酚酸類、多聚物類和碳水化合物類利用情況均高于CK。D4.5+FA-K處理的羧酸類和氨基酸利用情況高于CK，但FA-K處理的羧酸類和氨基酸利用情況低于CK。
圖3 不同處理的根際土壤微生物群落對6類碳源的利用占比Fig.3 Utilization percentage of 6 types carbon sources by microbial communities of rhizosphere soil in different treatments
2.5.3根際微生物群落的微生物多樣性指數(shù)
優(yōu)勢度指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)是常用的群落多樣性分析指標。優(yōu)勢度指數(shù)反映各物種的種群數(shù)量變化情況，指數(shù)越大，說明群落內(nèi)物種數(shù)量分布越不均勻，優(yōu)勢種的地位越突出。豐富度指數(shù)用于表征微生物群落的種類多樣性。均勻度指數(shù)用以反映土壤利用碳源種類和程度差異，均勻度越大表明微生物種群對碳源利用差異越大。對培養(yǎng)120 h的D9、D12、FA-K、D4.5+FA-K及CK處理的AWCD值，進行微生物多樣性分析，結果(表4)顯示，D12、FA-K和D4.5+FA-K處理的豐富度指數(shù)較高，顯著高于CK處理，但3個處理間無顯著差異。D9的豐富度指數(shù)與CK間無顯著差異，D4.5+FA-K的豐富度指數(shù)與FA-K無顯著差異。不同處理間的優(yōu)勢度指數(shù)和均勻度指數(shù)均無顯著差異。結果表明，DNKAS菌劑和黃腐酸鉀均可增加根際土壤的微生物種類，但是對于建立菌群優(yōu)勢地位和碳源的利用程度沒有影響。
表4 不同處理根際土壤的微生物多樣性指數(shù)Table 4 Microbial community diversity indexes in different treatmments
3 討論
目前，對于列當?shù)奈⑸锓乐沃饕\用列當病原菌，能取得良好的防治效果。王亞嬌等[24]從感病的列當中分離出尖孢鐮刀菌Br-2，大田試驗顯示對彎管列當防治率高達58.27%。吳元華等[25]將自主分離純化得到的生防鐮刀菌用于煙田列當防治試驗，發(fā)現(xiàn)不僅可以推遲列當出土時間，還能達到62.44%的防治率。對土傳病害拮抗菌進行列當防治的研究較少?？莶菅挎邨U菌對環(huán)境有較強的適應性，具有可在植物或土壤上大量繁殖和定植、競爭營養(yǎng)位點和空間位點、誘導抗性、促生和增產(chǎn)等特性，廣泛用于植物病害防治[26]，擁有作為列當生防菌的潛力。阻止列當芽管伸長，是列當防治的主要方式之一。本研究表明，枯草芽孢桿菌DNKAS的無細胞發(fā)酵液、菌體甲醇提取液、菌體水提取液對分枝列當?shù)难抗苌L具有顯著抑制作用。Barghouthi和Salman[27]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌QUBC16的無細胞發(fā)酵液可有效減少分枝列當芽管長度，與本研究結果一致。本研究中，無細胞發(fā)酵液對芽管生長抑制效果最佳，說明細胞次生代謝產(chǎn)物中有效物質(zhì)起主要作用。然而是何種物質(zhì)，還需進一步探究。
列當?shù)募纳鷶?shù)量和寄主作物產(chǎn)量是評判生防菌防治效果的關鍵指標。已有研究表明，密旋鏈霉菌[12]和灰黃青霉[28]均可減少分枝列當萌發(fā)率，使列當寄生數(shù)下降，寄主作物產(chǎn)量增加。田間小區(qū)試驗表明，枯草芽孢桿菌DNKAS通過降低分枝列當寄生數(shù)量，使加工番茄增產(chǎn)。結合皿內(nèi)試驗和田間小區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌DNKAS通過抑制分枝列當芽管生長，減少芽管與加工番茄根部接觸的概率，進而降低分枝列當出土數(shù)量，提高防治效果, 減輕分枝列當對加工番茄寄生的影響，使加工番茄增產(chǎn)。原因除了枯草芽孢桿菌可以減輕分枝列當?shù)奈：Γ€可能與枯草芽孢桿菌具有抗病、促生作用有關?；谔镩g小區(qū)試驗結果，枯草芽孢桿菌DNKAS的單次施用量低于4.5 kg·hm-2，不能形成優(yōu)勢菌群，而高于12 kg·hm-2，菌劑成本太高，綜合考慮認為，合理的使用劑量為9～12 kg·hm-2。為降低人工成本和時間成本，建議用隨水滴灌藥劑進行防治。
Biolog-ECO微平板法是研究微生物對生態(tài)環(huán)境影響的重要方式。研究[29]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Bs-15可使板栗土壤中微生物活性增加，顯著提高優(yōu)勢度指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)。本研究的Biolog-ECO微平板試驗發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀均可增加土壤微生物活性、碳源總利用率、微生物數(shù)量和種類；同時，枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀枯草芽孢桿菌DNKAS的微生物豐富度指數(shù)高于CK，而優(yōu)勢度指數(shù)和均勻度指數(shù)與CK無顯著差異。表明枯草芽孢桿菌DNKAS和黃腐酸鉀均具有調(diào)整土壤微生物群落結構，使土壤中微生態(tài)功能更加趨于穩(wěn)定的功能[29-30]。
目前，黃腐酸鉀在國內(nèi)主要用于作物增產(chǎn)、提升品質(zhì)和改良土壤，本研究發(fā)現(xiàn)黃腐酸鉀可用于列當?shù)姆乐?。研究表明，黃腐酸鉀具有促生、抗病、抗旱、提高過氧化物酶酶活等作用[31]，而根部土壤微生物群落結構的改變和過氧化物酶活性的升高，對列當寄生和生長有抑制作用[32]。因此，黃腐酸鉀可以減少分枝列當?shù)募纳l(fā)生，促進加工番茄增產(chǎn)。
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