徐彥紅, 左意才, 席溢, 許鐘丹, 李斌

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 貴陽(yáng) 550025)

Ca作為植物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，有“植物細(xì)胞代謝的總調(diào)節(jié)者”之稱，能與作為胞內(nèi)信使的Ca調(diào)蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)植物體的許多生理代謝過(guò)程[1-2]。P是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素之一，不僅是植物體內(nèi)許多重要化合物的組分，而且還以多種途徑參與植物代謝[3]。多花黑麥草(Loliummultiflorum)為禾本科(Gramineae)一年生牧草，其再生性強(qiáng)、產(chǎn)量高、適口性好、品質(zhì)優(yōu)良，眾多草食動(dòng)物喜食，可青飼、調(diào)制干草、青貯或放牧利用，是中國(guó)西南地區(qū)冬閑田栽培的主要牧草之一[4-5]?？λ固氐貐^(qū)特殊的碳酸鹽母巖成土背景和氣候條件，決定了其土壤有機(jī)質(zhì)含量低、鈣(Ca)含量較高、保水保土能力差等特點(diǎn)[6-9]；且土壤中的磷(P)大多以難溶態(tài)形式存在，可以被植物直接吸收利用的有效P含量低。因此，喀斯特地區(qū)土壤多呈現(xiàn)高Ca、低P的特點(diǎn)，這是制約多花黑麥草生產(chǎn)的重要因素之一。因此，研究喀斯特地區(qū)多花黑麥草對(duì)高Ca、低P脅迫及不同鈣磷比(Ca/P比)的響應(yīng)，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)于植物對(duì)Ca元素、P元素響應(yīng)的報(bào)道很多。吳鵬飛等[10]研究發(fā)現(xiàn)，隨著低P脅迫時(shí)間的推移，杉木的葉綠素含量發(fā)生大規(guī)模降低，不同濃度的Ca處理可以緩解低P逆境杉木葉綠體受傷程度，顯著提高其光合效率。低P脅迫下高粱的葉綠素和可溶性蛋白含量顯著下降，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性升高[11]。胡枝子在Ca脅迫下，SOD和過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)活性隨著Ca濃度的增加，呈先降低后增加的趨勢(shì)，Ca濃度增加到100 mmol·L-1時(shí)，SOD和CAT活性降到最低，POD活性變化幅度較小[12]?？梢?jiàn)，關(guān)于植物對(duì)鈣磷的響應(yīng)多集中于單一Ca脅迫或P脅迫，而不同鈣磷配比及濃度對(duì)植物生長(zhǎng)影響的報(bào)道鮮少，而不同鈣磷配比及濃度對(duì)多花黑麥草生長(zhǎng)特性的研究，更是未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以多花黑麥草(LoliummultiflorumLamk)為試驗(yàn)材料，采用砂培法，探討了不同Ca、P處理對(duì)多花黑麥草株高、葉寬等形態(tài)指標(biāo)以及光合色素、MDA、脯氨酸(proline, Pro)、SOD活性的影響，以期篩選多花黑麥草栽培的最適Ca、P濃度，解析多花黑麥草應(yīng)對(duì)高Ca、低P環(huán)境的生理適應(yīng)機(jī)制，為多年生黑麥草在喀斯特地區(qū)的種植提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以多花黑麥草‘安格斯1號(hào)’為研究材料，種子購(gòu)自貴州眾智恒生態(tài)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

采用砂培法進(jìn)行種植，石英砂用水浸泡，除去粘土和有機(jī)質(zhì)，至水呈無(wú)色透明為止；再用3%鹽酸浸泡1周；然后用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液浸泡，每天2次，至pH為中性。將處理好的石英砂裝入直徑為29.5 cm，深為21.5 cm的花盆中，每盆裝砂9 kg。

挑選均勻飽滿的黑麥草種子，將其置于2%的H2O2溶液中浸泡10 min進(jìn)行消毒，再用蒸餾水沖洗6遍，晾干備用，將處理后的種子置床培養(yǎng)。待種子發(fā)芽，苗長(zhǎng)7 cm以上時(shí)，選擇高度近似、生長(zhǎng)情況相近的幼苗移栽花盆中，移栽深度為2 cm。為確保植株有足夠的養(yǎng)分，每周定期為植株澆灌霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液。

試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)Ca/P比，依次為1∶1、2∶1、5∶1，每個(gè)Ca/P比設(shè)置2個(gè)水平，具體配置方法見(jiàn)表1，以不添加Ca、P離子的營(yíng)養(yǎng)液處理為對(duì)照(CK)。每個(gè)處理種植3盆，每盆定苗3株。P源為NaH2PO4、Ca源為CaCl2。

表1 不同鈣磷處理的鈣、磷濃度設(shè)置Table 1 Designation of calcium and phosphorus treatments

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

株高和葉寬于2017年3月31日開(kāi)始測(cè)量，每隔1周測(cè)量一次，共測(cè)量4周。

光合色素測(cè)定參照高俊鳳[13]的方法；MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法[14]；Pro含量采用酸性茚三酮法[14]；SOD活性采用NBT光化還原法[15]。

采用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)鈣磷處理對(duì)多花黑麥草生長(zhǎng)特性的影響，正相關(guān)的指標(biāo)按Di=(xi-ximin)/(ximax-ximin)計(jì)算，負(fù)相關(guān)的指標(biāo)按Di=1-(xi-ximin)/(ximax-ximin)計(jì)算。

式中Di為不同鈣磷處理下第i個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，xi為不同鈣磷處理下第i個(gè)指標(biāo)的值，ximax、ximin分別為不同鈣磷處理下第i個(gè)指標(biāo)的最大值和最小值[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鈣磷處理對(duì)多花黑麥草形態(tài)指標(biāo)的影響

試驗(yàn)過(guò)程中不同鈣磷處理的多花黑麥草株高和葉寬結(jié)果(表2)顯示，不同鈣磷處理間株高和葉寬有一定差異。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，T2處理的株高最大，比CK高16.56%，但沒(méi)有顯著性差異；T3處理多花黑麥草的葉寬最大，比CK顯著高75.68%。T1和T2處理比較發(fā)現(xiàn)，Ca2+濃度為25 mg·kg-1時(shí)，隨P濃度的增加，株高呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明添加P會(huì)促進(jìn)多花黑麥草生長(zhǎng)，但4月14日之前葉寬呈降低趨勢(shì)，而4月14日之后葉寬呈升高趨勢(shì)。T3、T4和T5處理比較發(fā)現(xiàn)，Ca2+濃度為50 mg·kg-1時(shí)，隨P濃度增加，株高呈現(xiàn)不規(guī)則變化；4月14日之前葉寬呈先降低后升高趨勢(shì)，4月14日之后葉寬呈降低趨勢(shì)。T2和T4處理比較發(fā)現(xiàn)，P濃度為25 mg·kg-1時(shí)，隨Ca2+濃度增加，株高呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，葉寬變化不規(guī)則。T5和T6處理比較發(fā)現(xiàn)，P濃度為50 mg·kg-1時(shí)，隨Ca2+濃度增加，株高呈降低趨勢(shì)。表明適宜的鈣磷濃度對(duì)多花黑麥草的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，Ca2+和P濃度分別為25、25 mg·kg-1時(shí)最佳。

表2 不同日期(mm/dd)不同鈣磷處理的株高和葉寬Table 2 Plant height and leaf width of different calcium and phosphorus treatments at different time(mm/dd) (cm)

2.2 不同鈣磷處理對(duì)多花黑麥草生理特性的影響

2.2.1不同鈣磷處理對(duì)光合色素含量的影響 不同鈣磷處理的多花黑麥草光合色素結(jié)果(表3)顯示，不同處理對(duì)光合色素的影響存在差異性。其中，T2處理葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均為最大值，且顯著高于其他處理(P<0.05)，較CK分別提高了12.22%、10.87%、14.63%。Ca/P比為1∶1時(shí)，隨著Ca2+、P濃度的提高，T5處理較T2處理的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量顯著下降。Ca2+濃度為25 mg·kg-1時(shí)，隨P濃度增加，T2處理較T1處理的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均顯著上升；Ca2+濃度為50 mg·kg-1時(shí)，隨P濃度增加，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈先顯著降低(T3至T4)后顯著升高(T4至T5)趨勢(shì)。P濃度相同時(shí)，隨Ca2+濃度增加，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈降低趨勢(shì)(T2至T4，T5至T6)。表明適宜的鈣、磷濃度對(duì)多花黑麥草的光合作用有促進(jìn)效果，Ca2+和P濃度分別為25 mg·kg-1、25 mg·kg-1時(shí)最佳。

表3 不同鈣磷處理對(duì)光合色素含量的影響Table 3 Photosynthetic pigment contents of different calcium and phosphorus treatments (mg·g-1)

2.2.2不同鈣磷處理對(duì)MDA、脯氨酸含量和SOD活性的影響 不同鈣磷處理多花黑麥草的MDA、脯氨酸含量和SOD活性結(jié)果見(jiàn)圖1,可見(jiàn)，CK處理的MDA含量最高，T1、T4、T5、T6處理間無(wú)顯著性差異，T2、T3處理最低。Ca/P比為5∶1時(shí)，隨Ca2+、P濃度的增加，T3處理較T1處理的MDA含量顯著下降；Ca/P比為2∶1時(shí)，隨Ca2+、P濃度的增加，T6處理與T4處理的MDA含量沒(méi)有顯著性差異；Ca/P比為1∶1時(shí)，隨Ca2+、P濃度的增加，T5處理較T2處理的MDA含量上升，但沒(méi)有顯著性差異。Ca2+濃度為25 mg·kg-1時(shí)，隨P濃度增加，T2較T1的MDA含量顯著降低；Ca2+濃度為50 mg·kg-1時(shí)，T3、T4、T5處理間MDA含量沒(méi)有顯著性差異。P濃度為25 mg·kg-1時(shí)，隨Ca2+濃度增加，T4較T2的MDA含量升高，但是沒(méi)有顯著性差異；P濃度為50 mg·kg-1時(shí)，T5、T6處理間沒(méi)有顯著性差異。表明Ca和P的缺乏對(duì)多花黑麥草造成傷害產(chǎn)生較多的MDA，在低濃度時(shí)對(duì)多花黑麥草傷害較小，而隨著脅迫濃度的增加傷害加重，產(chǎn)生更多MDA。

T2處理Pro含量最高，CK處理最低；Ca/P比為5∶1時(shí)，隨Ca2+、P濃度的增加，T3處理較T1處理的Pro含量顯著降低；Ca/P比為2∶1時(shí)，隨Ca2+、P濃度的增加，T6處理較T4處理間的Pro含量顯著升高；Ca/P比為1∶1時(shí)，隨Ca2+、P濃度的增加，T5處理較T2處理的Pro含量顯著下降。Ca2+濃度為25 mg·kg-1時(shí)，隨P濃度增加，T2較T1的MDA含量顯著升高；Ca2+濃度為50 mg·kg-1時(shí)，隨P濃度增加，Pro含量先顯著降低(T3至T4)后顯著升高(T4至T5)趨勢(shì)。P濃度為25 mg·kg-1時(shí)，隨Ca2+濃度增加，T4較T2的Pro含量顯著下降；P濃度為50 mg·kg-1時(shí)，隨Ca2+濃度增加， T5、T6處理間的Pro含量差異不顯著。表明在高Ca2+、P脅迫下，細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)輔氨酸含量升高，但T2處理的輔氨酸含量最高，原因還需要進(jìn)一步研究。

T5處理SOD活性最強(qiáng)，處理T1、T2、T3、T4、T6之間差異不顯著，且活性均較低。Ca2+濃度為25 mg·kg-1時(shí)，隨P濃度增加，SOD活性增強(qiáng)(T1至T2)；Ca2+濃度為50 mg·kg-1時(shí)，隨P濃度增加，SOD活性呈先降低后顯著升高；P濃度相同時(shí)，T2、T4處理間SOD活性無(wú)顯著差異，T6處理較T5處理SOD活性顯著下降。表明適當(dāng)?shù)腃a和P濃度會(huì)增加植物SOD活性，但脅迫過(guò)重SOD活性降低。

2.3 不同鈣磷處理對(duì)多花黑麥草生長(zhǎng)特性影響的綜合評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)上述指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)，多花黑麥草對(duì)不同Ca2+、P濃度存在一定的適應(yīng)機(jī)制，在不同鈣磷處理下各生理指標(biāo)的響應(yīng)有差異。為探究多花黑麥草適宜生長(zhǎng)的Ca/P比及Ca2+、P濃度，采用隸屬函數(shù)法對(duì)不同鈣磷處理下各指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。以不同處理下各指標(biāo)的平均值為基礎(chǔ)，用隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)公式，分別計(jì)算不同處理下多花黑麥草8個(gè)生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，將各項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值累加，取其平均值。結(jié)果(表4)表明，T3處理的隸屬函數(shù)值最大，T2處理次之，CK處理最差，表明Ca2+、P濃度分別為50、10 mg·kg-1處理下多花黑麥草的生長(zhǎng)情況最好，Ca2+、P濃度都為25 mg·kg-1時(shí)，次之。

表4 不同鈣磷處理對(duì)多花黑麥草影響的隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)Table 4 Comprehensive evaluation of membership function of different treatments in L. multiflorum

3 討論

植株的高低是植物對(duì)逆境最直接的反映，葉片是植物光合作用和蒸騰作用的主要器官，葉寬作為葉形指標(biāo)，在植物逆境適應(yīng)機(jī)制中有著一定的研究意義。本研究結(jié)果表明，Ca2+和P濃度都為25 mg·kg-1(Ca/P比為1∶1)時(shí)，多花黑麥草的株高和葉寬達(dá)到最大值。Ca2+濃度為25 mg·kg-1時(shí)，P濃度低于和高于25 mg·kg-1，株高和葉寬均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這與前人對(duì)蠶豆(Viciafaba)[17]、向日葵(Helianthusannuus)、玉米(Zeamays)和小麥(Triticumaestivum)[18]的研究結(jié)果一致，表明適宜的Ca2+和P離子濃度對(duì)多花黑麥草生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制其生長(zhǎng)。

逆境脅迫下植物體內(nèi)活性氧和過(guò)氧化物的積累會(huì)破壞葉綠素，導(dǎo)致其分解并抑制其合成。葉綠素含量直接影響光合作用的進(jìn)行，在一定范圍內(nèi)與光合速率呈正相關(guān)，能在一定程度上反映植物的光合能力[19]，而類胡蘿卜素含量的高低與植物耗散過(guò)量的激發(fā)光能有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+濃度處于低水平(25 mg·kg-1)時(shí)，隨P濃度增加，葉綠素和類胡蘿卜素含量增加，而當(dāng)Ca2+濃度為高水平(50 mg·kg-1)時(shí)，隨P濃度增加，光合色素含量先增加后降低，表明較高或較低的Ca2+、P會(huì)抑制光合色素的合成或加速光合色素的降解，本研究結(jié)果與Sabir等[20]對(duì)印度人參苗的研究結(jié)果相似。造成葉綠素含量降低可能是由于逆境脅迫打破離子平衡限制了鐵離子向原卟啉分子的運(yùn)輸，類胡蘿卜素含量下降，也不利于植株耗散過(guò)量的激發(fā)光能，使光合器官的抗強(qiáng)光破壞能力降低[21]。

MDA作為膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量的多少直接反映植物細(xì)胞發(fā)生膜質(zhì)過(guò)氧化的程度。本研究中，CK的MDA含量最高，表明Ca2+、P的缺乏會(huì)導(dǎo)致多花黑麥草產(chǎn)生MDA，隨著Ca2+、P濃度的添加多花黑麥草細(xì)胞的膜質(zhì)過(guò)氧化程度改善，但是當(dāng)Ca2+、P濃度超過(guò)植物生長(zhǎng)必需時(shí)，又會(huì)傷害植物細(xì)胞，高Ca、低P傷害效應(yīng)疊加，加重多花黑麥草受損程度，表現(xiàn)為更多的MDA積累。抗氧化酶用于清除逆境脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)多活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化性損傷，增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫環(huán)境的適應(yīng)[22-23]。本研究中，T5和對(duì)照(CK)的SOD活性較強(qiáng)，表明這兩個(gè)Ca2+、P濃度處理，誘導(dǎo)植物建立防御體系，從而避免或緩解了活性氧對(duì)植物的傷害；但是T6處理的SOD的活性又較弱，可能是較高的Ca2+濃度直接損害植物細(xì)胞引起的。 Pro是水溶性最大的氨基酸，可降低細(xì)胞水勢(shì)，防止脅迫造成的過(guò)度失水，在植物的滲透調(diào)節(jié)中起重要作用[24]。與CK相比，各處理的Pro含量均顯著升高，T2處理最高。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠緩解由于高濃度或低濃度Ca2+、P脅迫造成的細(xì)胞失水。

綜上所述，適宜的Ca/P比和Ca2+、P濃度可在一定程度上促進(jìn)多花黑麥草株高和葉寬的提高。Ca2+、P脅迫條件下多花黑麥草可通過(guò)提高幼苗的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、增強(qiáng)酶活性的策略來(lái)適應(yīng)逆境環(huán)境。隸屬函數(shù)法分析表明，Ca2+、P濃度分別為50、10 mg·kg-1處理最適合多花黑麥草的生長(zhǎng)，Ca2+、P濃度都為25 mg·kg-1時(shí)，次之?？梢?jiàn)，多花黑麥草對(duì)低磷有一定的耐受性，因此在喀斯特地區(qū)種植多花黑麥草時(shí)施入少量磷肥即可滿足其生長(zhǎng)需要。為避免磷過(guò)量造成的資源浪費(fèi)和水體污染，建議施磷量范圍為10～25 mg·kg-1。